Технологии DNA-array
Синтез ДНК-чипов (DNA-array) - это синтез олигонуклеотидов непосредственно на поверхности чипа путем поэтапного добавления нуклеотидов к растущему концу цепи. Это направление интенсивно развивается в последние годы в мире
Технология синтеза ДНК на стекле может использоваться не только для синтеза иммобилизованных нуклеотидов, но и для синтеза праймеров исключительно высокой чистоты, поскольку все они в процессе синтеза остаются иммобилизованными на мембране. Технологии DNA array все шире используются для генотипирования SNP.
На сегодняшний день для генотипирования SNP , применяется большое разнообразие геномных технологий включая SBE (single base extension) (Syvanen A.C. e.a., 1990; Chen X. e.a., 1999), 5’-экзонуклеазные технологии -«TagMan» (Livak K.J. e.a., 1995), лигазную детекцию (Tobe V.O. e.a., 1996), различные типы гибридизации (Wang D.G. e.a., 1998; Howell W.M. e.a., 1999), расщепление FLAP-эндонуклеазами (Mein C.A. e.a., 2000). Эти методы успешно используются для генотипирования незначительных количеств SNP. Масштабные исследования SNP, развитие технологий изготовления микроматриц и флуоресцентного сканирования привели к разработке эффективных методов геномных технологий – DNA array параллельного генотипирования нескольких тысяч SNP (Pastinen T. e.a., 2000).
Один из наиболее часто применяемых сегодня принципов в мультиплексных системах генотипирования - минисеквенирование, в котором ДНК полимераза элонгирует детектируемый праймер, присоединяя единственный нуклеотид непосредственно на сайт SNP (Milani L., Syvänen A. C., 2009). Специфика реакции одно-нуклеотидной элонгации дает возможность количественного определения SNP в геномной ДНК для анализа повторяющихся последовательностей (Peiffer D.A. e.a., 2006), генотипирования пула образцов ДНК (Lindroos K. e.a., 2002), в РНК - для аллель-спецефичного экспрессионного анализа (Liljedahl U. e.a., 2004; Milani L. e.a., 2007) или количественной оценки альтернативного сплайсинга (Milani L. e.a., 2006). Этот подход расширяет возможность выявления в геноме потери гетерозиготности и повторяющихся последовательностей (Peiffer D. A. e.a., 2006). Такой подход применяется в технологиях SBE с применением tag-array гибридизации и аллель-специфичном удлинении праймеров (Syvanen A.C. e.a., 1990; Syvanen A.C., 1999; Fan J.B. e.a., 2000; Hirschhorn J.N. e.a., 2000).
Для аллель-специфического удлинения праймеров два аминомодифицированных детектируемых праймера, каждый содержащий один из вариантов нуклеотидов SNP на 3’-конце наносится и ковалентно связывается с химически-активированной поверхностью слайда посредством аминогруппы на 5’-конце. Фланкирующий SNP участок ДНК амплифицируется с SNP-специфичными праймерами, в присутствие T7 или T3 РНК-полимеразы, распознающей последовательность с 5' конца. Одновременно в одной мультиплексной ПЦР реакции может быть амплифицировано несколько SNP. ПЦР продукты затем транскрибируются в РНК, которая гибридизуется на чипе, содержащем два детектируемых праймера для каждого SNP. На иммобилизованном детектируемом праймере происходит отжиг на сайте SNP. Ферменты обратной транскрипции и флуоресцентно меченые нуклеотиды делают возможным визуализацию реакции специфического удлинения различных аллелей детектируемых праймеров. Генотип определяется сравнением интенсивности сигнала двух детектируемых праймеров SNP представленных на чипе (Syvanen A.C. e.a., 1990; Pastinen T. e.a., 1997; Pasanen T. e.a., 2003; Saarela J., 2006).
Принцип использоапния «tagged» полимеразной цепной реакции впервые описан для анализа экспрессии генов у дрожжей (Shoemaker D.D. e.a., 1996) и позже применен для генотипирования SNP (Cai H. e.a., 2000). В системе Tag-array минисеквенирования используются “cTags”-олигонуклеотиды, иммобилизованные на чипе. Мультиплексная реакция циклического минисеквенирования протекает в растворе с праймерами с 5'-Tag последовательностями и флуоресцентно-мечеными дидезоксинуклеотидами (ddNTPs) необходимыми для отжига непосредственно на SNP-сайте. Праймер несёт 5' последовательность комплементарную одному из cTag-ов, иммобилизованном на чипе посредством 3'-аминогруппы. После элонгации праймера минисеквенированием, SNP разделяются путем гибридизации с соответственным cTag-ом с определенной локализацией на чипе. Включение флуоресцентно меченых ddNTPs, терменирующих элонгацию, позволяет охарактеризовать каждый SNP по измерению интенсивности флуоресцентного сигнала, после сканирования чипа (Hirschhorn J.N. e.a., 2000; Lindroos K. e.a., 2002; Milani L., Syvänen A.C., 2009) (рис.31, 32).
A
|
|
|
|
B
|
Преципитация этанолом
|
←
|
Мультиплексная ПЦР
|
→
|
Обработка Экзонуклеазой I и щелочной фосфатазой
|
↓
|
|
|
|
↓
|
Гибридизация ПЦР продуктов с иммобилизованными детектируемыми праймерами
|
←
|
Приготовление микрочипа: нанесение специфических праймеров
|
|
Реакция минисеквенирования в растворе с tag-мечеными праймерами
|
↓
|
|
|
|
↓
|
|
Нанесение cTag праймеров
|
→
|
Реакция минисеквенирования на микрочипе
|
|
|
|
Гибридизация tag-праймеров на микрочипе
|
↓
|
|
|
|
↓
|
Детекция сигнала
|
|
|
|
Детекция сигнала
|
Рисунок 31 - Схема генотипирования с использованием специфичных праймеров на микрочипе (А) и использованием технологии «Tag-arrays» (В). (Lindroos K. e.a., 2003)
Рисунок 32 - Принцип “Tag-array” минисеквенирования в формате 384- луночного (А) и 96-луночного (B) “array of arrays”. Каждый из “subarrays” на слайде содержит до 200 (А) или 600 (В) cTag-ов. Мультиплексная реакция циклического минисеквенирования протекает в растворе с праймерами с 5'-Tag последовательностями и флуоресцентно-мечеными дидезоксинуклеотидами (ddNTPs) для отжига на SNP-сайте (С). Tag-последовательность праймера гибридизуется с комплементарной cTag-последовательностью, иммобилизованной на слайде (D). Генотипы определяются измерением флуоресценции встроившихся нуклеотидов. Показана часть одного subarray с результатом для двух SNP. Образец гомозиготен (А/А) для SNP 1 и гетерозиготен (C/T) для SNP 2.(Milani L., Syvänen A. C., 2009)
Создание отдельных реакционных камер для минисеквенирования каждого образца достигается применением силиконовой резиновой сетки (Lindroos K. e.a., 2003; Lovmar L. e.a., 2003; Chen D. e.a., 2007; Milani L., Syvänen A.C., 2009). Количество детектируемых SNP и исследуемых образцов зависит от диаметра реакционных камер. Представленная система сочетает принцип высокоспецифичного генотипирования путем минисеквенирования в формате микроматриц и параллельный анализ, она может быть использована для любой панели SNP человека и других организмов (Andres O.e.a., 2008; Chen D. e.a., 2007).
Мутационный анализ на ДНК чипе с применением технологий AP-PCR
Для проведения мутационного анализа на ДНК чипах используют метод случайных праймеров AP-PCR. Сочетании технологии ДНК чипов и метода случайных праймеров позволяет вести широкомасштабный поиск новых мутаций.
С этой целью разрабатываются новые технологии ДНК чипов на основе полимеразных и лигазных реакций. Лигазные реакции применяются для поиска как точечных мутаций, так и более протяженных – делеций, инсерций. Поскольку гибридизация на ДНК чипах недостаточно специфична, то ведётся активная разработка альтернативных гибридизационному методов детекции мутаций на ДНК-чипах. Это обуславливает возможность одновременного анализа множества различных субстратов, а, следовательно, и детекции большого количества возможных мутаций. Сущность лигазного метода состоит в синтезе двух различных олигонуклеотидных проб 3' и 5', концы которых комплементарны мутантной форме исследуемого сайта. При гибридизации с исследуемой последовательностью 3' и 5' концы проб находятся в непосредственном соседстве. При наличии мутации эти концевые нуклеотиды оказываются полностью комплементарны исследуемой поверхности и соединяются друг с другом лигазой. На конце одного из олигонуклеотидов, не участвующем в лигировании находится репортёрная метка, которая сохраняется при дальнейшей обработке чипа, если произошло лигирование и детектируется соответствующими методами. Если последовательность не мутантная, то соответствующие концы олигонуклеотидных проб оказываются не полностью комплементарными исследуемой последовательности. Они не могут быть соединены лигазой высокотребовательной к полной комплементарности лигируемых концов. При реализации этой реакции на чипе один из олигонуклеотидов иммобилизован на чипе в соответствующей ячейке. А другой находится в растворе вместе с исследуемой пробой и его конец, не участвующий в гибридизации является меченым. После проведения гибридизации и лигирования осуществляется обработка чипа в условиях, вызывающих отделение всех нелигированных репортёрных проб, чип отмывается и оставшиеся на поверхности лигированные пробы детектируются вследствие наличия репортёрной метки на их конце.
Такой чип позволяет проводить независимую детекцию любого числа проб меченных одинаковым образом. В то время как для жидкофазных реакций требуется мечение каждой пробы различной меткой, поскольку детекция всех проб производится в одном объёме.
Другим ещё более важным направлением, где применяются лигазные реакции, стало их использование при работе с чипами, содержащими короткие олигонуклеотидные последовательности, содержащие все возможные комбинации оснований данной длины. Такие чипы содержат очень большое количество ячеек, поскольку число всех возможных последовательностей олигонуклеотидов данной длины равно 4n, где n - длина нуклеотида. Для n = 9 это количество равно 262144, (для n=10 - 1048576).
Такие чипы очень перспективны для проведения мутационного анализа, поскольку с их помощью можно производить анализ любой последовательности. Очень важно, что чипы для мутационного анализа должны содержать большое количество олигонуклеотидов, которое не может быть меньше числа оснований в исследуемой последовательности. Поэтому чипы для анализа всех возможных мутаций длинных последовательностях синтезируются в основном методом фотолитографии. Сущность предложенного подхода состоит в том, что комбинаторная проба из 9 нуклеотидов синтезируется на 5' конце 20 нуклеотидной якорной последовательности, одинаковой во всех ячейках чипа. После синтеза пробы добавляется последовательность комплементарная якорной. После её гибридизации чип готов к использованию. При этом в реакцию вводится фрагментированная исследуемая ДНК. 5' последовательности молекул, гибридизировавшиеся с пробой, соединяются лигазой с последовательностью, комплементарной якорной. Таким образом, после лигирования последовательность комплементарная 9 нуклеотидной комбинаторной пробе оказывается связанной с комплементарным 20 нуклеотидным участком. Общая протяжённость дуплекса достигает 29 нуклеотидов. Используемая система действует как ловушка, обеспечивая прочное связывание и накопление на чипе комплементарных последовательностей. Это позволяет производить мутационный анализ довольно длинных фрагментов ДНК до 5000 азотистых оснований.
Кроме того, подобная схема, позволяющая селективно распознавать 5' концы любых последовательностей идеально применима для анализа любых сложных наборов ДНК фрагментов, образующихся в процессе осуществления различных методов геноиндентификационного анализа, таких как рестриктазные (RFLP) или полимеразные (AFLP, RAPD, AP-PCR). Эта технология подходит для создания экспериментальных чипов небольшого объема в небольших лабораториях.
Одновременное исследование большого количества SNP ставшее возможным связи с синтезом ДНК чипов фотолитографическим методом открывает новые перспективы в данной области исследований. Так применение ДНК-чипов с количеством ячеек 100 млн и длиной олигонуклеотидов 30 оснований позволяет анализировать неперекрывающимися пробами всю последовательность генома человека длиной 3 млрд. оснований. Количество одновременно анализируемых SNP, экспрессируемых генов, длина подвергаемых мутационному анализу последовательностей, прямо зависит от количества ячеек чипа и их размеров.
Итак, главными преимуществами фотографических технологий является возможность синтеза большого количества олигонуклеотидов и их одновременный синтез непосредственно на поверхности чипа. При этом количество олигонуклеотидов определяется только разрешающей способностью методов и не оказывает влияния на сложность методики, скорость синтеза и его стоимость.
На сегодняшний день существует только одна фирма, осуществляющая синтез ДНК-чипов методом фотолитографии - это компания Affymetrix.
|
