Отчет о выполнении поисковых научно-исследовательских работ по теме
Скачать 0.94 Mb.
|
3.2.1.5.2 Циклическое минисеквенирование Готовили мастер-микс с реагентами для минисеквенирования для двух отдельных реакций с использованием двух ddNTPs меченых Cy5 и Cy3: Су5-ddUTP и Cy3-ddATP – для одной реакции; Cy5-ddGTP и Cy3-ddCTP для второй (табл.7). Количество Су5-ddUTP на 20% превышало количество остальных флуоресцентномеченых ddNTP. Флуорофоры в этой смеси светочувствительны. 4.5 мкл смеси для реакции минисеквенирования добавляли к очищенным ПЦР продуктам до конечного объема 15 мкл. Выполняли реакцию минисеквенирования в термоциклере по следующей схеме: «горячий старт» 3 минуты при 96ºС, затем 33 цикла 20 сек при 95ºС и 20 сек при 55ºС. Таблица 7 - Мастер-микс для реакции минисеквенирования
3.2.1.5.3 Гибридизация Слайды помещали на специальную подставку, на них размещали силиконовую резиновую решетку, затем плексигласовую крышку и плотно закрепляли при помощи винтов. Конструкцию подогревали до 42ºС. Готовили гибридизационную смесь для каждого образца. Для этого к 15 мкл продуктов реакции минисеквенирования добавляли 7 мкл гибридизационного раствора (5xSSC, 30% формамид, 0.1% SDS) до конечного объема 22 мкл. В гибридизационную смесь также вносили олигонуклеотиды для контроля гибридизации – флуоресцентномеченые Tag-олигонуклеотиды в концентрации 0.25 нМ. Вносили 20 мкл каждого варианта гибридизационной смеси в отдельную камеру для гибридизации на слайде. Гибридизовали слайды 2 часа при 42ºС во влажной и темной камере. 3.2.1.5.4 Промывка Готовили 3 раствора для промывки: 1 – 4xSSC; 2 – 2xSSC и 0.1 % SDS; 3 - 0.2xSSC. После гибридизации вынимали слайды из камеры и немедленно ополаскивали в растворе 1 при комнатной температуре. Затем дважды промывали слайды в растворе 2 при 42ºС в течение 5 минут, и дважды в растворе 3 при комнатной температуре в течение 1 минуты. Сушили слайды центрифугированием при 900 об/мин в течение 5 минут. 3.2.1.5.5 Сканирование Интенсивность флуоресцентного сигнала регистрировали на сканере GenePix 4100, который позволяет сканировать слайд при длинах волн 635 нм и 532, соответствующих эмиссии флуорофоров Cy3 и Cy5, наиболее часто используемых красителей в технологии микрочипов. 3.2.2 Изготовление олигонуклеотидных микроматриц для исследования микроделеций 3.2.2.1 Отбор мутаций Делеции, ассоциированные с сердечно-сосудистыми патологиями, были отобраны из базы данных FIAV. ДНК выделяли из образцов венозной крови по фенол-хлороформной методике, измеряли ее количество спектрофотометрически при 260/280 нм и хранили выделенную ДНК при 4ºС в буфере ТЕ (10 мМ Трис-HCl, pH 7.4, 1 мM ЭДТА, pH 8.0). 3.2.2.2 Подбор олигонуклеотидных праймеров 3.2.2.2.1 Праймеры для реакции минисеквенирования Для каждой мутации на слайд наносили прямые и обратные олигонуклеотидные праймеры, которые были подобраны согласно последовательности дикого типа гена. Каждый олигонуклеотид содержал ~25 пар оснований, 15-Т последовательность и аминогруппу на 5’ конце для ковалентного связывания с поверхностью слайда. Олигонуклеотиды были подобраны таким образом, чтобы праймер элонгировался на один нуклеотид на сайте делеции в APEX-реакции (Arrayed Primer Extension reaction) (Schrijver I. e.a., 2007). 3.2.2.2.2 ПЦР праймеры Длина фланкирующей последовательности ~200 пар оснований, при их создании использовалось программное обеспечение PRIMER 3.0 (http://frodo.wi.mit.edu/primer3/input.htm). Для мультиплексной ПЦР-реакции подбирались прямые и обратные праймеры длиной ~50 пар оснований со сходными температурой плавления и содержанием G/C. Каждая пара ПЦР-праймеров была протестирована in silico ПЦР для верификации специфичности ДНК-фрагментов, которые будут амплифицированы. 3.2.2.3 Изготовление микрочипа 3.2.2.3.1 Печать микрочипа В буфере для печати (150 мкМ фосфатный буфер, pH 8.5) растворяли смесь прямых и обратных праймеров для минисеквенирования в конечной концентрации 25 мкМ. Переносили аликвоты (5-10 мкл) смеси праймеров в стерильный, свободный от нуклеаз полипропиленовый планшет и закрепляли его в принтере. Слайды Epoxide Coated Slides (Corning) для контактной печати олигонуклеотидов размещали в принтере, используя магнитные пластины. Готовили MCP310S-пин для печати, промывая его в 10 мл буфера для печати. Данный пин наносит 1 nl раствора cTag на слайд, формируя пятно диаметром 400 мкм. Наносили образцы из планшета на слайд в соответствии с протоколом. Олигонуклеотиды иммобилизовали на слайд в дублях, в формате “array of arrays” (Pastinen T. e.a., 2000) с помощью автоматического контактного принтера BioOdyssey Calligrapher MiniArayer. 3.2.2.3.2 Обработка слайда после печати Инкубировали слайд во влажной камере (70-75%) при температуре 20-25ºС 12-17 часов. Необходимый уровень влажности поддерживали размещением в камере насыщенного раствора смеси NH4Cl и KNO3. Остаточные реактивные группы на слайде блокировали раствором для блокировки, содержащим 5хSSC, 0.1% SDS и 0.1 мг/мл BSA. Перед использованием раствор подогревали до 42ºC. Инкубировали слайды в растворе для блокировки в течение 45-60 минут при 42ºС. Затем дважды переносили слайды в 0.1хSSC раствор, инкубировали по 5 минут при комнатной температуре. Дважды переносили слайды в деионизированную H2O и инкубировали по 30 секунд. Сушили слайды центрифугированием при 1600 g в течение 2 минут. Хранили слайды в сухом, темном месте при комнатной температуре. 3.2.2.4 Изготовление сетки для создания отдельных гибридизационных камер Сетку из силиконовой резины изготавливали при помощи перевернутого микропланшета с V-образными лунками, использовали её многократно. Соединяли 2 компонента Elastosil RT (625A и 625B) в 50 мл пробирке Falcon в соотношении 9:1, перемешивали в течение 30 минут. Распределяли раствор в перевернутом микропланшете с V-образными лунками так, чтобы уровень раствора не доходил до верхнего края лунки на 1-2 мм. Оставляли силиконовую сетку для затвердения на 12-24 часа при комнатной температуре. Снимали силиконовую сетку с планшета и скальпелем разрезали ее на части, соответствующие размеру слайда. После каждого использования силиконовую сетку промывали в 10% растворе хлора, ополаскивали в воде и сушили. 3.2.2.5 Генотипирование 3.2.2.5.1 Мультиплексаная ПЦР и очистка амплифицированных продуктов ДНК-образцы амплифицировали методом мультиплексной ПЦР, затем верифицировали их в 2% агарозном геле. Для реакции амплификации использовали мастер-микс следующего состава: 5’ и 3’ праймеры, 10хПЦР буфер, 25 мкМ MgCl2, 2.5 мкМ dNTP, Taq ДНК полимераза, геномная ДНК и деионизованная вода. Пулированные ПЦР продукты концентрировали, очищали на колонках и верифицировали в 3% агарозном геле. Готовили смесь для инактивации непрореагировавших dNTPs и очистки от них ПЦР продуктов следующего состава: 50 мМ MgCl2, 1 M Tris-HCl pH 9.5 и 1 U щелочной фосфатазы. Добавляли 4 мкл смеси для очистки к 30 мкл ПЦР продуктов. Инкубировали при 37ºС 60 минут. Инактивировали ферменты нагреванием смеси до 85ºС в течение 15 минут. 3.2.2.5.2 APEX- реакция Амплифицированные ПЦР продукты денатурировали в течение 10 минут при 95ºС, затем быстро помещали на лед для охлаждения. В двух пробирках готовили по 25 мкл смеси для APEX-реакции: 16 мкл денатурированных продуктов амплификации, 2 U TermoSequenase DNA polymerase, 3 мкл буфера (260 мМ Tris-HCl pH 9.5 и 65 мМ MgCl2) и деионизованная вода. В одну из пробирок добавляли по 0.75 мкл Су5-ddUTP и Cy3-ddATP; во вторую - Cy5-ddGTP и Cy3-ddCTP. Количество Су5-ddUTP на 20% превышало количество остальных флуоресцентномеченых ddNTP. Для контроля отжига и герметичности камер минисеквенирования применяли смесь буфера для отжига и H2O (без ДНК). Слайды помещали на специальную подставку, на них размещали силиконовую резиновую решетку, затем плексигласовую крышку и плотно закрепляли при помощи винтов. Конструкцию подогревали до 58ºС. Добавляли 20 мкл каждого образца или контроля нагретого до 58ºС в лунки на слайде. Инкубировали слайды в темной камере 20 минут при 58ºС. 3.2.2.5.3 Промывка После инкубации промывали слайды в 0.3% растворе Alconox в течение 3 минут. Затем дважды промывали слайды в деионизованной воде по 90 секунд при 95ºС. Наносили на слайд и равномерно распределяли по его поверхности реагент (SlowFade Light Antifade Reagent), препятствующий обесцвечиванию. 3.2.2.5.4 Сканирование Интенсивность флуоресцентного сигнала регистрировали на сканере GenePix 4100, который позволяет сканировать слайд при длинах волн 635 нм и 532, соответствующих эмиссии флуорофоров Cy3 и Cy5, наиболее часто используемых красителей в технологии микрочипов.
В таблице 8 представлен фрагмент базы данных FIAV, формирующей олигонуклеотиды для нанесения их на микроматрицы. Таблица 8 - Фрагмент базы данных FIAV, формирующей фланкирующую SNP
На рисунке 35 показана схема расположения олигонуклеотидов.  600 мкм 400 мкм Рисунок 35 - Схема расположения на стекле 80 ячеек для изготовления микроматриц нуклеиновых кислот высокой плотности В таблице 9 представлен дизайн микроматрицы с олигонуклеотидами генов, ассоциированных с сердечно-сосудистыми заболеваниями. В каждой ячейке иммобилизованы прямые и обратные олигонуклеотидные праймеры для детекции SNP. Таблица 9 – Дизайн микроматрицы с олигонуклеотидами генов, ассоциированных с сердечно-сосудистыми заболеваниями
Результаты НИР были реализованы при разработке специализированной магистерской программы «Бионформатика» - руководитель д.б.н., профессор Т.П. Шкурат. Программа магистратуры утверждена Ученым Советом Южного федерального университета 05.03.2010. Приказом ректора ЮФУ №1909 от 13.05.2010 «О введении магистерских программ в Южном федеральном университете в 2010-2011 учебном году» открыта специализация «Биоинформатика». |
