3. Биотехнология и медицина
Нет такого экспериментального подхода или исследователь ского направления в биотехнологии, которые бы не получили применения в медицине. Вот почему столь многообразны связи между биотехнологией и самой гуманной из всех наук. Здесь мы остановимся лишь на основных моментах.
Антибиотики.
Антибиотики — это специфические продукты жизнедеятельности, обладающие высокой физиологической актив ностью по отношению к определенным группам микроорганизмов и к злокачественным опухолям, избирательно задерживающих их рост или полностью подавляющих развитие (Н. С. Егоров, 1979). Далеко не все из этих соединений, число которых прибли жается к 5000, допущены для применения в медицине. К важней шим антибиотикам терапевтического назначения принадлежат следующие их классы (табл. 2).
Приведенные классы антибиотиков не исчерпывают их много образия, список их пополняется с каждым годом. Причины неос лабевающего внимания к поиску новых антибиотиков, как видно из табл. 10, связаны с токсичностью существующих антибиоти ков, аллергическими реакциями, вызываемыми ими, нарастанием устойчивости патогенных микроорганизмов к применяемым пре паратам и, помимо этого, с необходимостью изыскания средств борьбы с возбудителями, против которых недостаточно эффектив ны известные ныне антибиотики. Основные пути поиска вклю чают:
Испытание новых продуцентов. Так, с начала 80-х годов исследуют миксобактерии, продуцирующие большое количество антимикробных агентов (Н. Thierbach, N. Reichenbach, 1981).
Химическая модификация антибиотиков. Противомикроб-ные макролиды токсичны для человека. Например, гептаен амфо-терицин В, используемый по жизненным показаниям при тяже лых микозах, вызывает необратимые поражения почек. Получены метиловые эфиры амфотерицина, менее токсичные и сохра няющие противогрибковую активность. При модификации пенициллинов и цефалоспоринов ис пользуют иммобилизованные ферменты.
Таблица 2. Важнейшие классы антибиотиков терапевтического назначения (по И Г.. Егорову, 1979; Д.Ланчини, Ф Паренти, 1985)
Класс
|
Типичные антибиотики
|
Продуценты
|
На кого действует
|
Механизм действии
|
Трудности терапевтического применения
|
-Лактамные
|
Пенициллины, це-фалоспорины
|
Грибы родов Реnicillium, Cephalosporum
|
Грамположитель-ные и грамотрицательные бактерии
|
Нарушение синте за клеточной стенки
|
Аллергические реакции
|
Аминогликозидные
|
Стрептомицин, гентамицин, канамицин, тобрамицин, амикацин
|
Актиномицеты ро да Streptomyces, бактерии родов Micromonospora. Bacil lus
|
В основном грамотрицательные бак терии
|
Необратимое подавление синтеза белка
|
Токсическое дейст вие на слуховой нерв и почки
|
Тетрациклины
|
Одноименные антибиотики
|
Актиномицеты ро да Streptomyces
|
Грамположительные и грамотрицательные бактерии, риккетсии, хламидии, простейшие
|
Обратимое подав ление синтеза белка
|
Распространение устойчивых штаммов
|
Макролиды
|
Антибактериаль ные: эритромицин Противогрибковые и антипротозойные: полиены
|
Актиномицеты ро да Streptomyces То же
|
Грамположительные бактерии Грибы, некоторые простейшие
|
То же
Нарушение плаз матической мемб раны
|
Токсичность
|
Полипептидные и депсипептидные
|
Полимиксины, грамицидины, бацитрацины
|
Различные микро-организмы
|
В основном грамотрицательные бак терии
|
Механизм дейст вия различен
|
Высокая токсичность
|
Мутасинтез. Применяют мутантные штаммы, у которых блокирован синтез отдельных фрагментов молекулы антибиотика. В среду культивирования вносят аналоги этих фрагментов. Мик роорганизм использует эти аналоги для биосинтеза, в результате чего получают модифицированный антибиотик.
Клеточная инженерия. Получают гибридные антибиотики, например, с новыми комбинациями агликона и Сахаров.
Генетическая инженерия — введение в геном микроорганиз ма информации о ферменте, необходимом для модификации про дуцируемого антибиотика, например его метилирования при по мощи метилаз.
Важной задачей является повышение эффективности биосин теза известных антибиотиков. Значительных результатов удалось добиться за десятилетия селекции штаммов-продуцентов с приме нением индуцированного мутагенеза и ступенчатого отбора. На пример, продуктивность штаммов Penicillium по синтезу пеницил лина увеличена в 300—350 раз. Определенные перспективы от крываются в связи с возможностью клонирования генов «узких мест» биосинтеза антибиотика или в случае, если все био синтетические ферменты кодируются единым опероном.
Многообещающим подходом служит инкапсулирование анти биотиков, в частности их включение в лигюсомы, что позволяет прицельно доставлять препарат только к определенным органам и тканям, повышает его эффективность и снижает побочное действие. Этот подход применим и для других лекарственных препаратов. Например, кала-азар, болезнь, вызываемая лейгшма-нией, поддается лечению препаратами сурьмы. Однако лечебная доза этих препаратов токсична для человека. В составе липосом препараты сурьмы избирательно доставляются к органам, пора женным лейшманией, — селезенке и печени.
Вместо антибиотика в организм человека может вводиться его продуцент, антагонист возбудителя заболевания. Этот подход берет начало с работ И. И.Мечникова о подавлении гнилостной микрофлоры в толстом кишечнике человека посредством молоч нокислых бактерий. Важную роль в возникновении кариеса зу бов, по-видимому, играет обитающая во рту бактерия Streptococ cus mutans, которая выделяет кислоты, разрушающие зубную эмаль и дентин. Получен мутант Strept. mutans, который при введении в ротовую полость почти не образует коррозивных кислот, вытесняет дикий патогенный штамм и выделяет леталь ный для него белковый продукт.
Гормоны.
Биотехнология предоставляет медицине новые пути получения ценных гормональных препаратов. Особенно большие сдвиги произошли в последние годы в направлении синтеза пеп-тидных гормонов.
Раньше гормоны получали из органов и тканей животных и человека (крови доноров, удаленных при операциях органов, трупного материала). Требовалось много материала для получе ния небольшого количества продукта. Так, человеческий гормон роста (соматотропин) получали из гипофиза человека, каждый гипофиз содержит его не более 4 мг. В то же время для лечения одного ребенка, страдающего карликовостью, требуется около 7 мг соматотропина в неделю; курс лечения должен продолжать ся несколько лет. С применением генноинже-нерного штамма Е. coli в настоящее время получают до 100 мг гормона роста на 1 л среды культивирования. Открываются пер спективы борьбы не только с карликовостью, но и с низкорос-лостью — более слабой степенью дефицита соматотропина. Сома тотропин способствует заживлению ран и ожогов, наряду с каль-цитонином (гормоном щитовидной железы) регулирует обмен Са2+ в костной ткани.
Инсулин, пептидный гормон островков Лангерганса подже лудочной железы, представляет основное средство лечения при сахарном диабете. Эта болезнь вызвана дефицитом инсулина и проявляется повышением уровня глюкозы в крови. До недавнего времени инсулин получали из поджелудочной железы быка и свиньи. Препарат отличался от человеческого инсулина 1—3 аминокислотными заменами, так что возникала угроза аллерги ческих реакций, особенно у детей. Широкомасштабное терапев тическое применение инсулина сдерживалось его высокой стои мостью и ограниченностью ресурсов. Путем химической модифи кации инсулин из животных удалось сделать неотличимым от человеческого, но это означало дополнительное удорожание продукта.
Компания Eli Lilly с 1982 г. производит генноинженерный инсулин на основе раздельного синтеза Е. coli его А- и В-цепей. Стоимость продукта значительно снизилась, получаемый инсулин идентичен человеческому. С 1980 г. в печати имеются сообщения о клонировании у Е. сой гена проинсулина — предшественника гормона, переходящего в зрелую форму при ограниченном протеолизе.
К лечению диабета приложена также технология инкапсули-рования: клетки поджелудочной железы в капсуле, введенные однократно в организм больного, продуцируют инсулин в течение года.
Компания Integrated Genetics приступила к выпуску фолли-кулостимулирующего и лютенизирующего гормонов. Эти пептиды составлены из двух субъединиц. На повестке дня вопрос о про мышленном синтезе олигопептидных гормонов нервной систе мы — энкефалинов, построенных из 5 аминокислотных остатков, и эндорфинов, аналогов морфина. При рациональном примене нии эти пептиды снимают болевые ощущения, создают хорошее
настроение, повышают работоспособность, концентрируют внима ние, улучшают память, приводят в порядок режим сна и бодр ствования. Примером успешного применения методов генетиче ской инженерии может служить синтез р-эндорфина по техноло гии гибридных белков, описанной выше для другого пептидного гормона, соматостатина.
Значителен вклад биотехнологии и в промышленное произ водство непептидных гормонов, в первую очередь стероидов. Ме тоды микробиологической трансформации позволили резко со кратить число этапов химического синтеза кортизона, гормона надпочечников, применяемого для лечения ревматоидного артри та. При производстве стероидных гормонов широко используют иммобилизованные микробные клетки, например Arthrobacter globiformis, для синтеза преднизолона из гидрокортизона. Име ются разработки по получению гормона щитовидной железы ти роксина из микроводорослей.
Интерфероны, интерлейкины, факторы крови.
Интерфероны выделяются клетками человека и животных в ответ на инфици-рование вирусами. Они обладают антивирусной активностью. Механизм действия интерферонов до конца не выяснен. Предполагается, в частности, что Интерфероны препятствуют проникновению вирусных частиц в клетку. Интерфероны стиму лируют деятельность иммунной системы и препятствуют размно жению клеток раковых опухолей. Все аспекты действия интер феронов важны с точки зрения их терапевтического применения.
Различают -, -, - и -интерфероны, образуемые соответст венно лейкоцитами, фибробластами соединительной ткани, Т-лимфоцитами и эпителиальными клетками. Наибольшее значение имеют первые три группы. Интерфероны состоят из 146—166 аминокислотных остатков, - и интерфероны связаны с остат ками Сахаров (гликозилированы). До введения методов генети ческой инженерии интерфероны получали из донорской крови — до 1 мкг неочищенного интерферона из 1 л крови, т. е. примерно одну дозу для инъекции.
В настоящее время -, - и -интерфероны успешно получают с применением генноинженерных штаммов Е. coli, дрожжей, куль тивируемых клеток насекомых (Drosophil) и млекопитающих. Генно-инженерные интерфероны могут быть очищены с использо ванием моноклональных антител. В случае у- и р-интерферонов предпочтительно применение эукариотических продуцентов, так как прокариоты не гликозилируют белки. Некоторые фирмы, на пример Bioferon (ФРГ), используют не генноинженерные мутан ты, а культивируемые in vitro фибропласты человека.
Интерфероны используются для лечения болезней, вызывае мых вирусами герпеса, бешенства, гепатитов, цитомегаловиру-сом, вирусом, вызывающим опасное поражение сердца, а также для профилактики вирусных инфекций. Вдыхание аэрозоля ин терферонов позволяет предупредить развитие острых респиратор ных заболеваний. Несколько курьезной проблемой является то что интерфероны, в частности -интерфероны, сами могут вызывать у пациентов простудные симптомы (насморк, повышение температуры и т.д.). Проблема побочного действия стоит особенно остро при длительном терапевтическом применении интерферонов, необходимом для лечения злокаче ственных опухолей.
Интерфероны оказывают лечебное воздействие на организм больных раком груди, кожи, гортани, легких, мозга, рассеянной миеломе и саркоме Капоци — два последних заболевания харак терны для лиц, страдающих приобретенными иммунодефицитами (см. ниже). Интерфероны полезны также при лечении рассеян ного склероза.
Методы генетической инженерии позволяют получать модифи цированные Интерфероны. Антивирусная активность интерферо нов варьирует при аминокислотных заменах (J. Werenne, 1983). Американская компания Cetus Corporation производит -интер-ферон, в аминокислотной последовательности которого цистеин в положении 17 замещен на серии. Это приводит к повышению терапевтической активности препарата, так как предотвращает наблюдаемое in vitro формирование неактивного димера -интер-ферона за счет дисульфидных связей между остатками цистеина в положении 17. Определенные надежды возлагают на модифи кацию интерферонов путем получения гибридных молекул (Е. Д. Свердлов, 1984).
Интерлейкины—сравнительно короткие (около 150 амино кислотных остатков) полипептиды, участвующие в организации иммунного ответа. Интерлейкин-1, образующийся опре деленной группой лейкоцитов крови — макрофагами, в ответ на введение антигена стимулирует размножение (пролиферацию) Т-хелперов (субпопуляции Т-лимфоцитов), продуцирующих, в свою очередь, интерлейкин-2. Последний вызывает пролифера цию различных субпопуляций Т-лимфоцитов — Т-киллеров, Т-хелперов, Т-супрессоров, а также В-лимфоцитов, продуцентов антител. Под влиянием интерлейкина-2 из Т-лимфоцитов высво бождаются регуляторные белки — лимфокины, активирующие звенья иммунной системы; синтезируются также Интерфероны.
Интерлейкины, основные лечебные средства при иммунных расстройствах, получают путем клонирования соответствующих генов в Е. coll или культивирования лимфоцитов in vitro. Англий ская компания Celltech Ltd и японская Sakyo Company предла гают синтезированный генноинженерными бактериями интерлей-кин-1 наряду с другим тюлипептидным агентом —фактором нек роза опухолей -- для лечения ряда опухолевых заболеваний (В. Sikyta el al., 1986).
Получаемые биотехнологическим путем факторы свертывания крови, особенно фактор VIII (с помощью культивируемых кле ток млекопитающих) и фактор IX (с помощью генноинженер-ного штамма Е. coli), необходимы для терапии форм гемофи лии наследственной болезни, при которой кровь теряет способность свертываться. К числу ценных с клинической точки зрения факторов, полученных в биореакторах с культурами животных клеток, следует отнести фактор роста В-лимфоцитов, фактор активации макрофагов, Т-заместительный фактор, активатор тканевого плазминогена.
Моноклокальные антитела и ДНК-или РНК-пробы.
Моноклональные антитела — продукты В-гибридомных клеток — используют для диагностики различных заболеваний. Об ладая высокой специфичностью действия, они обеспечивают иден тификацию не только вида возбудителя, но и его серотипа. С по мощью моноклональных антител можно тестировать различные гормоны, метаболиты, белковые факторы. Наиболее быстрый ме тод индикации основан на применении антител, иммобилизован ных на мембранных электродах — аналогах ферментных биосен соров. Они позволяют диагностировать беременность, выявлять предрасположенность к диабету, ревматоидному артриту (J. Col-lins et al., 1986), идентифицировать наследственные заболе вания, сопровождающиеся утратой тех или иных ферментов и других белковых компонентов. Моноклональные антитела широко используют для диагностики рака и определения его форм.
Трудности связаны с тем, что специфических «раковых» анти генов, по-видимому, не бывает, и характерные для злокачествен но переродившейся клетки детерминанты могут быть с некоторой, пусть небольшой, вероятностью обнаружены и в здоровых клет ках. Перспективна диагностика рака при помощи моноклональ-ных антител к вырабатываемым злокачественной опухолью осо бым гормонам, аутокринам, ведущим к самостимуляции роста раковых клеток.
Моноклональные антитела имеют не только диагностическое, но и лечебное значение. При аутоиммунных заболеваниях, когда иммунные клетки «ополчаются» против собственных органов и тканей, моноклональные антитела соответствующей специфич ности могут связывать антитела, наносящие вред организму больного. Для лечения рака предлагают использовать монокло нальные антитела, конъюгированные с токсичными для раковых клеток соединениями. Моноклональные антитела доставляют яд точно по адресу, избегая поражения здоровых клеток. Поэтому к моноклональным антителам можно присоединять очень сильные токсины, например рицин — яд из клещевины, одной молекулы которого достаточно для поражения одной клетки. В современ ной фармацевтической промышленности моноклональные анти тела используют для очистки лекарственных препаратов.
Диагностическое значение имеют короткие фрагменты ДНК и РНК, несущие радиоактивную или иную метку, так называемые ДНК/РНК-пробы. С их помощью можно установить наличие в организме определенных типов нуклеиновых кислот, соответ ствующих болезнетворным агентам, злокачественным опухолям, а также проверить геном пациента на наличие у него тех или иных генетических аномалий. Метод основан на комплементар ном взаимодействии проб с участками ДНК или РНК, выделен ными из исследуемых клеток и фиксированными на носителе. Взаимодействия нуклеотидных цепочек пробы с ДНК (РНК) из образца регистрируют по радиоактивной метке или иным спо собом.
Моноклональные антитела и ДНК/РНК-пробы используют для диагностики болезней животных и растений. В частности, с помощью этих проб проводят индикацию зараженности кар тофеля вирусом. Диагностические средства из арсенала биотех нологов предлагают применять для быстрого определения пола у цыплят.
Рекомбинантные вакцины и вакцины-антигены.
Вакцина ция — один из основных способов борьбы с инфекционными забо леваниями. Путем поголовной вакцинации ликвидирована нату ральная оспа, резко ограничено распространение бешенства, по лиомиелита, желтой лихорадки. На повестке дня — изготовление вакцин против гриппа, гепатитов, герпесов, свинки, кори, острых респираторных заболеваний. Большое экономическое значение имеет разработка вакцин против болезней сельскохозяйственных животных — ящура, африканской болезни лошадей, овечьей бо-
лезни «синего языка», трипаносомозов и др. Традиционные вакцин ные препараты изготовляют на основе ослабленных, инактивиро-ванных или дезинтегрированных возбудителей болезней.
Современные биотехнологические разработки предусматрива ют создание рекомбинантных вакцин и вакцин-антигенов. Вак цины обоих типов основаны на генноинженерном подходе.
Для получения рекомбинантных вакцин обычно используют хорошо известный вирус коровьей оспы (осповакцины). В его ДНК встраивают чужеродные гены, кодирующие иммуногенные белки различных возбудителей (гемагглютинин вируса гриппа, гликопротеин D вируса герпеса, поверхностный антиген вируса гепатита В, антиген малярийного плазмодия). Получаются вак цины против соответствующих инфекций, хорошо зарекомендо вавшие себя в опытах на животных. К их достоинствам относится возможность создания поливалент ных вакцинных препаратов на основе объединения участков ДНК различных патогенов «под эгидой» ДНК вируса осповакцины. Открывается возможность одномоментной комплексной иммуни зации, скажем, крупного рогатого скота против всех опасных инфекций данной местности.
Вакцины-антигены получают, клонируя гены возбудителя бо лезни в Е. colt, дрожжах, клетках насекомых и млекопитающих. Клонирован ген поверхностного антигена HBS-вируса гепатита В (сывороточного гепатита), ген белка оболочки УРЬвируса ящура. Вирус ящура существует в виде многих серотипов, методом белковой инженерии удалось скомбини ровать иммуногенные компоненты различных серотипов в рамках одной вакцины-антигена.
Вакцины-антигены высокостабильны при хранении и перевоз ке, сравнительно просты в изготовлении (в том числе и при крупномасштабном производстве), содержат минимальное коли чество белка и поэтому малоопасны как аллергены. Они гаран тированы от остаточной инфекционности — способности вызы вать инфекционную болезнь вместо того, чтобы предохранять от нее. Проблемой является низкая иммуногенность вакцин-антигенов. Одной из причин может быть то, что вакцина не включает всех компонентов возбудителя, необходимых для созда ния иммунитета к нему. Так, вирус, покидая клетку, часто «одевается» ее мембраной. Компоненты этой мембраны, отсут ствующие в генноинженерном белке, могут обладать иммуноген-ными свойствами. К повышению иммуногенности вакцин-анти генов ведет добавление адьювантов, иммобилизация вакцин на носителях или их включение в липосомы.
Ферменты медицинского назначения.
Многообразно примене ние ферментных препаратов в медицине. Их используют для растворения тромбов, лечения наследственных заболеваний (вместо отсутствующих эндогенных ферментов), удаления не-
жизнеспособных, денатурированных структур, клеточных и тканевых фрагментов, освобождения организма от токсических веществ (Н. Ф. Казанская и др., 1984). Яркий пример-спасение жизни больных с тромбозом конечностей, легких, коронарных сосудов сердца при помощи громболитически.х ферментов (стрсптокиназы, урокиназы). В СССР такие препа раты созданы в иммобилизованной форме под руководством Е. И. Чазова и И. В. Березина. Ген урокнназы клонирован в бактериях (S. Prentis, 1984). В современной медицине протеазы применяются для очистки очагов гнойно-некротических процессов от патологических продуктов, а также для лечения ожогов Лечение рака связано с использованием L-аспарагиназы, кото рая лишает раковые клетки ресурсов необходимого для их раз вития аспарагина, поступающего с током крови. Здоровые клетки в отличие от раковых (некоторых типов) способны к самостоятельному синтезу аспарагина.
Известно около 200 наследственных заболеваний, обуслов ленных дефицитом какого-либо фермента или иного белкового фактора. В настоящее время делают попытки лечения этих заболеваний с применением ферментов. Так, пытаются лечить болезнь Готе, при которой организм не способен расщеплять, глюкоцереброзиды (S. Prentis, 1984).
В последние годы все больше внимания уделяют ингиби торам ферментов. Ингибиторы протеаз, получаемые из актино мицетов (лейпептин, антипаин, химостатин и др.) и генноинже нерных штаммов Е. coil (эглин) и дрожжей антитрипсин) оказываются полезными при септических процессах, инфаркте миокарда, эмфиземе легких, панкреатите. Уменьшение концентрации глюкозы в крови больных диабетом может быть достигнуто при исполь зовании ингибиторов кишечных инвертаз и амилаз, отвечающих за превращение крахмала и сахарозы в глюкозу. Особой задачей является поиск ингибиторов ферментов, с помощью которых патогенные микроорганизмы разрушают антибиотики, вводимые в организм больного.
Таковы основные направления биотехнологических разрабо ток в области медицины. Без преувеличения можно сказать что центральное приложение новейших биотехнологических под ходов — медицина. Одной из проблем, связанных с белками медицинского назначения, является наличие у них побочных эффектов. Например, аллергические реакции возникают как против генноинженерных белков, так и против моноклональных антител, даже если их получают на основе человеческих гиб ридом. Эта проблема не нова для медицины и не является непреодолимой.
|
