Учебно-методическое пособие по самостоятельной работе Специальность 020208. 65 Биохимия Красноярск сфу 2012
Скачать 305.68 Kb.
|
АФК образуются в физиологических условиях как вторичные продукты в процессе метаболизма, а также другими путями, включая редокс-реакции, осуществляемые путем одноэлектронного переноса; гомолиз инициаторных молекул, обладающих слабой ковалентной связью; радиолиз; фотолиз; термолиз (рис.1.1). I – цитохром-с-оксидаза; II – флавиновые оксидазы; III – ксантиноксидаза; IV – NADPH – оксидаза; V – NO-синтаза; VI – реакция Фентона; VII – реакция Хабера-Вайса; VIII – воздействие радиации; IX – перекисное окисление липидов; X–неферментативное окисление гемоглобина; XI – каталаза; XII – миелопероксидаза. Рисунок 1.1 – Основные пути и ферменты генерации АФК в организме человека и животных Активные формы кислорода — это, с физико-химической точки зрения, прежде всего свободные радикалы, которые имеют на внешней электронной оболочке неспаренный электрон. АФК генерируются во всех частях клетки. 95–98% вдыхаемого О2 расходуется на выработку энергии и окислительный метаболизм субстратов, 2–5% О2 переходит в активные формы кислорода. Средняя концентрация их в тканях человека составляет 10–8 мМ. Основные механизмы генерации АФК связаны с нарушениями функционирования электронно-транспортных цепей митохондрий или микросом, особенно при низкой концентрации АDP, а также при изменении свойств дегидрогеназ. Важна роль и системы цитохрома Р-450, локализованной в эндоплазматической сети. Свободные радикалы отличаются от обычных молекул не только высокой химической активностью, но и тем, что порождают цепные реакции. "Отобрав" доступный электрон у оказавшейся рядом молекулы, радикал превращается в молекулу, а донор электрона – в радикал, который может продолжить цепь дальше. Вопросы для самоконтроля 1. Активные формы кислорода – классификация, характеристика. 2. В каких процессах образуется супероксидный анион-радикал 3. Первичные радикалы кислорода. 4. Вторичные радикалы кислорода. 5. Третичные радикалы кислорода. 6. Реакция Хабера-Вейса. 7. NADPH-оксидазный комплекс – строение, биологическая роль. 8. Компартмент клетки, в котором образуется основное количество активных форм кислорода. 9. Оксидазные и оксигеназные реакции, в которых образуются АФК. 10. Генерация АФК при аутоокислении гемоглобина. Тема 1.2. Окислительная модификация биомолекул активными формами кислорода Процессы свободнорадикального окисления играют чрезвычайно важную роль в жизнедеятельности клеток, с одной стороны, это необходимый этап различных метаболических процессов, но с другой стороны, повышенная интенсивность свободнорадикальных процессов во многих случаях является либо следствием, либо причиной тех или иных патологических изменений в клетках и тканях. В ходе свободнорадикальных реакций образуется значительное количество продуктов радикальной и нерадикальной природы, часть из которых способна повторно вовлекаться в развитие и дальнейшее усиление интенсивности процессов свободнорадикального окисления. Свободнорадикальному окислению подвергаются липиды, белки, нуклеиновые кислоты и углеводы. В первую очередь в биологических мембранах окислению подвергаются полиненасыщенные жирные кислоты в составе фосфолипидов. Перекисное окисление мембранных фосфолипидов является распространенным механизмом модификации и деструкции мембран, его усиление выявляется при развитии большого количества патологических состояний. В нормальной клетке эти процессы регулируются рядом ферментов: NАDР(Н)-зависимыми оксигеназами, циклооксигеназами и липоксигеназами. Продукты перекисного окисления липидов являются промежуточными продуктами синтеза простагландинов, тромбоксанов, лейкотриенов и др. Процесс ПОЛ осуществляется по механизму цепной реакции, которая приводит к накоплению различных липоперекисей – сравнительно устойчивых соединений. Последние вызывают нарушения упаковки мембраны и внедрение в области мембранных дефектов воды и других гидрофильных молекул. Из перекисного радикала может образоваться эндоперекисный радикал липида, распад которого приводит к формированию ряда продуктов, в том числе различных альдегидов (рис. 1.2.1). ПОЛ включает 3 стадии: инициация, распространение и терминация.  Рисунок 1.2.1. - Схематическое изображение свободнорадикального окисления ненасыщенной жирной кислоты и образующихся при окислении продуктов Образовавшиеся при инициации пероксильные радикалы атакуют ненасыщенные цепи соседних жирных кислот, порождая цепную реакцию перекисного окисления и образования цитотоксичных перекисных радикалов RO· и R·, и диеновых коньюгатов. Особенно активно катализируют липидпероксидацию ионы железа Fe(III) и меди Cu(II): взаимодействуя с гидроперерекисями ROOH они порождают алкоаксильные RO· и пероксильные ROO· радикалы. Гидроперекиси липидов приводят к повышению текучести мембраны, истечению растворенных в цитозоле веществ и потере функции мембранных белков. Активность ПОЛ зависит также от степени ненасыщенности мембранных ПНЖК. Продукты терминации ПОЛ – циклические гидро- и эндоперекиси распадаются до конечных продуктов: различных альдегидов, таких как малоновый диальдегид (МДА) и 4-гидроксиноненаль, которые могут атаковать аминокислоты боковых цепей белка и приводить к фрагментации ДНК. Продукты окисления, в частности митохондриальных мембран, могут являться компонентами сигнальных путей апоптоза. Вопросы для самоконтроля 1. Какими АФК запускается процесс ПОЛ? 2. Из каких стадий состоит процесс липопероксидации? 3. Каким образом происходит разветвление ПОЛ? 4. Как обрывается процесс перекисного окисления липидов? 5. Почему повышается текучесть мембран при ПОЛ? 6. Роль токоферола в поддержании липидного гомеостаза мембран. 7. Каким антиоксидантом токоферол поддерживается восстановленном состоянии? 8. Какие продукты ПОЛ обладают прооксидантным действием? 9. Как можно определить уровень липопероксидации? 10. Механизм действия малонового диальдегида на белки и нуклеиновые кислоты. Тема 1.3. Компоненты антиоксидантной системы и их характеристика. Связывание и модификация АФК, предупреждение образования окисленных биомолекул осуществляется антиоксидантной системой, функционирующей как внутри клетки, так и вне её. Клеточная АОС представлена семейством оксидоредуктаз и трансфераз, найденных в цитоплазме, митохондриях и ядре клетки. Состав низкомолекулярных клеточных антиоксидантов достаточно обширен: восстановленный глутатион и аскорбиновая кислота находятся в водной фазе клетки, защищая компоненты цитозоля и матрикса митохондрий, токоферолы и каротиноиды - плазматическую и внутриклеточные мембраны. Защита ферментов и белков, в частности липопротеинов, присутствующих в плазме крови, осуществляется внеклеточной АОС. Эта антиоксидантная система, как и клеточная, характеризуется наличием антиоксидантных ферментов и низкомолекулярных биоантиоксидантов и присутствует не только в плазме крови, но и в других биологических жидкостях организма. Функционально такая система обеспечивает ограничение интенсивности реакций свободнорадикального окисления, защиту чувствительных к окислительным повреждениям мембран молекул, внутри- и внеклеточных структур от действия свободных радикалов, восстановление окислительных молекулярных повреждений. Такие процессы обеспечиваются разными путями, включающими предотвращение образования свободных радикалов, обезвреживание их посредством связывания. В аэробных организмах сформировалась первичная и вторичная системы антиоксидантной защиты. Компоненты первичной системы взаимодействуют непосредственно с АФК на уровне клеток и тканей. К ним отнесены ферментативные и неферментативные звенья АОС. Компоненты вторичной защиты (липолитические ферменты, протеазы, пептидазы и т.д.) образуют систему, которая начинает функционировать при уже случившихся окислительных повреждениях клеточных структур, когда возникает необходимость быстрого их удаления и восстановления. Ферментативная АОС включает ферменты супероксиддисмутазу (СОД), каталазу, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназу (Г6ФДГ), глутатионпероксидазу (ГПО), глутатионредуктазу (ГР), глутатионтрансферазу (ГSТ). Супероксиддисмутаза. Организмы различной степени сложности, утилизирующие кислород в процессах обмена веществ содержат ферменты, обладающие способностью дисмутировать супероксидные радикалы, обрывая тем самым опасную цепь свободнорадикальных превращений в самом зародыше. Эти ферменты называют супероксиддисмутазами (КФ 1.15.1.1., супероксид: супероксид оксидоредуктаза, СОД). Известно три типа СОД, для которых необходимо наличие Cu2+, Zn2+, Mn3+: медь-цинковая (Cu,Zn-СОД; СОД1), марганцевая (Мn-CОД; СОД2) и экстрацеллюлярная (Э-СОД; СОД3). СОД являются, в основном внутриклеточными ферментами и лишь небольшая часть СОД-активности обнаружена во внеклеточных жидкостях млекопитающих в виде гликозилированного тетрамера Cu,Zn-СОД с M.м. 135 кДа. Этот гликопротеин проявляет сродство к сульфатированным полисахаридам таким, как гепарин и гепарансульфат Реакция дисмутации с участием Cu,Zn-СОД идёт в две стадии, в ходе которых происходит перенос электронов с одного супероксидного анион-радикала на другой. Промежуточным акцептором этого электрона служит атом меди. E- Cu2+ + O2 - + H+ E-Cu+ + O2
Супероксиддисмутазы обладают узкой субстратной специфичностью, действие их направлено только на полувосстановленную молекулу кислорода. СОД может взаимодействовать также с пероксидом водорода и выступать в качестве прооксиданта, инициируя образование радикалов - супероксида и гидроксила: Cu2+ -СОД + Н2О2 Сu+ -СОД + О2 + 2Н+; Cu+ -СОД + Н2О2 Сu2+ -СОД + ОН + НО Неорганические перекиси ингибируют СОД, необратимо восстанавливая медь в составе её активного центра. В отличие от неорганических липидные перекиси обратимо ингибируют СОД. Эффективным ингибитором фермента является гидроперекись линоленовой кислоты, снижающая её активность в 3,5 раза. Супероксиддисмутаза играет важную роль в защите клеток от повреждающего действия супероксидного анион-радикала и по праву считается главным ферментом внутриклеточной АОС. СОД не только стабилизирует клеточные мембраны, предотвращая процессы перекисного окисления липидов. Снижая уровень О2, она защищает от его дезактивирующего действия каталазу и глутатионпероксидазу. Регулирующее влияние на активность СОД оказывают глутатион, цистеин, другие SH-содержащие соединения, а также опосредованно ферменты глутатионового обмена; последние, наряду с каталазой и пероксидазами различной субстратной специфичности, обеспечивают детоксикацию пероксида водорода. В процессе дисмутации супероксидного анион-радикала образуется перекись водорода, восстанавливаемая до воды в основном каталазой и глутатионпероксидазой Каталаза. Каталаза (КФ 1. , пероксид водорода: пероксид водорода оксидоредуктаза) – хромопротеин с молекулярной массой около 240 кДа, состоит из 4 субъединиц, имеющих по одной группе гема, локализуется в основном в пероксисомах, частично – в микросомах и в меньшей мере – в цитозоле. Полагают, что каталаза не имеет высокого сродства к перекиси водорода и не может эффективно обезвреживать это соединение при низких концентрациях, имеющихся в цитозоле. В пероксисомах, где концентрация перекиси водорода высока, каталаза активно разрушает ее. Разложение перекиси водорода каталазой осуществляется в два этапа: Fe3+-каталаза + 2 H2O2 → окисленная каталаза + H2O2 → Fe3+-каталаза + H2O2 + O2. При этом в окисленном состоянии каталаза работает как пероксидаза. Субстратами в пероксидазной реакции могут быть этанол, метанол, формиат, формальдегид и другие доноры водорода. Следует отметить, что около 0,5% кислорода, образующегося в результате разложения перекиси водорода, возникает в возбужденном, синглетном состоянии и таким образом в процессе разложения перекиси водорода вновь генерируются активные формы кислорода. Глутатионпероксидаза (КФ 1. , глутатион: оксидоредуктаза, ГПО) важнейший фермент, обеспечивающий инактивацию активных форм кислорода, так как разрушает и пероксид водорода и гидропероксиды липидов. Он катализирует восстановление пероксидов с помощью трипептида глутатиона (γ-глутамилцистеинилглицин). ГПО – гомотетрамерный селенопротеин, имеет молекулярную массу около 74 кДа, состоит из 4 идентичных субъединиц, в состав активного центра входит селен, который содержится в виде Se-цистеина. Селен необходим для синтеза глутатионпероксидазы. Сульфгидрильная группа глутатиона (ГSH) служит донором электронов и, окисляясь, образует дисульфидную форму глутатиона, в которой 2 молекулы глутатиона связаны через дисульфидную группу. Ген глутатионпероксидазы локализован в 3-й хромосоме. Глутатионпероксидаза катализирует реакции, в которых фермент восстанавливает пероксид водорода до воды, а также восстановление органических гидропероксидов (ROOH) до гидроксипроизводных, и в результате переходит в окисленную дисульфидную форму ГS-SГ: 2ГSH + H2O2 = ГS-SГ + H2O 2ГSH + ROOH = ГS-SГ + ROH +H2O Глутатионпероксидаза обезвреживает не только H2O2, но и разные органические липидные пероксилы, которые образуются в организме при активации ПОЛ. Такие как гидропероксиды линолевой и линоленовой кислот, холестерин-7β-гидропероксид и некоторые синтетические вещества (кумен-, трет-бутил-гидропероксиды). Глутатионпероксидаза защищает от окислительной атаки белки, липиды, никотинамидные коферменты, восстанавливает липидные перекиси. Фермент глутатионпероксидаза локализирован в цитозоле в небольших количествах, а также в митохондриях. В тканях млекопитающих максимальная активность глутатионпероксидазы в печени, эритроцитах, надпочечниках. Активность фермента зависит от количества образованных пероксидов. Функционирует сопряженно с глутатионредуктазой. Фермент устойчив к действию цианида и азида, особенно в присутствии ГSH. Главной ферментативной системой плазмы крови является ГПО внеклеточных жидкостей и ГПО гидроперекисей липидов (ГПО 4), которая будучи липофильным соединением эффективно взаимодействует с гидроперекисями фосфатидилхолина, холестерина и эфиров холестерина в липопротеинах низкой плотности, восстанавливая их, следовательно, защищая от окислительной модификации. Кроме того ГПО 4 совместно с токоферолом практически полностью подавляет ПОЛ в биологических мембранах благодаря тому, что витамин Е эффективно восстанавливает пероксирадикалы, а фермент разлагает гидроперекиси, препятствуя тем самым их вовлечению в окислительный цикл. Глутатион-S-трансферазы. Глутатион-S-трансферазы (КФ 2. , восстановленный глутатион: трансфераза, ГST) представлены суперсемейством мультифункциональных изоферментов, которые способствуют процессам детоксикации, используя различные механизмы, включая: 1) каталитическую инактивацию широкого спектра ксенобиотиков через конъюгацию с ГSH; 2) некаталитическое связывание определенных ксенобиотиков; 3) восстановление липид- и ДНК-гидропероксидов через экспрессию активности ГSH-пероксидазы. Кроме того, глутатион-S-трансферазы изомеризуют некоторые стероиды и простагландины, участвуют в метаболизме других эндогенных веществ. В частности, ГST могут вовлекаться в синтез лейкотриенов, поддерживая процесс воспаления. Восстановленный глутатион (ГSH) – низкомолекулярный тиол, преобладающий (90–95%) во многих растительных, микробных и во всех животных клетках, в которых его молярная концентрация (1–10 ммоль) выше, чем концентрация большинства органических веществ. ГSH представляет собой трипептид (L-гамма-глутамил-L-цистеинилглицин), состоящий из глицина, цистеина и глутаминовой кислоты, которая связана с цистеином через карбоксильную группу. Конъюгация ксенобиотиков с глутатионом катализируемая глутатион-S-трансферазой, осуществляется в основном тремя путями (рис. 4): 1) нуклеофильное замещение по электрофильным атомам С, N, S и Р. 2) присоединение к субстрату (алкены и эпоксиды) полной молекулы GSH ; 3) восстановление органических гидроперекисей до спиртов (селен-независимая глутатион-пероксидазная активность), характерная для GST класса альфа, в отличие от фермента глютатионпероксидазы). При дальнейшем метаболизме глутатионовые конъюгаты переходят в меркаптуровые кислоты или меркаптаны и выводятся из организма (около 0,1 ммоль в сутки).  Рисунок 4 –Реакции, катализируемые глутатион-S-трансферазами Вопросы для самоконтроля 1. Супероксиддисмутаза – строение, изоформы, мезанизм реакции. 2. В чем отличие экстрацеллюлярной СОД от цитозольного изофермента? 2. Какие ферменты входят в глутатионовую антипероксидную систему? 3. Как происходит окисление глутатиона? 4. В какой реакции происходит восстановление окисленного глутатиона? Какой кофермент требуется для этого процесса? 5. Глутатионпероксидаза – строение, изоформы, субстраты. 6. Два варианта участия глутатионпероксидазы в обезвреживании мембранных липопероксидов. 7. Глутатион-S-трансферазы. Классификация, строение, механизм действия. Таблица 3 – Содержание тем лабораторных работ
4. МЕТОДИКА ПРОВЕДЕНИЯ ПРОМЕЖУТОЧНОЙ АТТЕСТАЦИИ ПО САМОСТОЯТЕЛЬНОЙ РАБОТЕ Для контроля самостоятельной работы студентов по дисциплине используются тесты, обсуждение отработанных на лабораторных занятиях методик, проработанного теоретического материала. Успешное освоение данного раздела большого практикума подготовит студентов к проведению научных исследований в области биохимии и молекулярной биологии как в плане теоретического понимания механизмов основных биохимических процессов, так и в плане практического применения этих знаний в дальнейшей деятельности. Для промежуточного контроля проводятся две письменные контрольные работы. Контрольно-измерительные материалы предлагаются в нескольких вариантах и состоят из заданий и тестовых вопросов. После проведения промежуточного контроля на ближайшем лабораторном занятии подробно разбираются задания и вопросы, вызвавшие наибольшие затруднения. Промежуточный контроль проводится согласно графику, приведенному в приложении. Итоговая аттестация – зачет. |
Похожие:
 | Учебно-методическое пособие к самостоятельной работе Специальность 020208. 65 Биохимия Учебно-методическое пособие предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов |  | Учебно-методическое пособие для самостоятельной работы студентов... М 545 Методология сравнительного правоведения: учебно-методическое пособие для самостоятельной работы студентов [Текст] / сост. И.... |
| Методические указания к самостоятельной работе Специальность 020208. 65 Биохимия Учебное пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Биохимия» | | Методические указания к самостоятельной работе Специальность 020208. 65 Биохимия Учебное пособие предназначено для студентов, обучающихся по специальности «Биохимия» |
| Учебно-методическое пособие Красноярск сфу 2012 удк 504. 004. 4 (07) ббк 28. 0я73 Экологическая информатика: учебно-методическое пособие [Текст] / сост. М. А. Субботин. – Красноярск: Сиб федер ун-т, 2012. – 9 с | | Учебно-методическое пособие для практических занятий Специальность 020208. 65 Биохимия Учебно-методическое пособие предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов |
| Учебно-методическое пособие для практических занятий Специальность 020208. 65 Биохимия Учебно-методическое пособие предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов | | Учебно-методическое пособие для практических занятий Специальность 020208. 65 Биохимия Учебно-методическое пособие предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов |
| Учебно-методическое пособие для практических занятий Специальность 020208. 65 Биохимия Учебно-методическое пособие предназначено для студентов биологических и медико-биологических специальностей университетов | | Программа по дисциплине Красноярск сфу 2008 удк 581. 1(07) ббк 28. 573я73 ф 20 Программа предназначена для студентов направления 020200 биология, спец. 020208. 65 «Биохимия» |
| Учебно-методическое пособие для семинарских занятий, самостоятельной... Семейное право: учебно-методическое пособие [Текст] / сост. Н. В. Высоцкая. Красноярск: Сиб федер ун-т, 2012. 17 с | | Учебно-методическое пособие для семинарских занятий, самостоятельной... Организация, управление и администрирование в социальной работе: учебно-методическое пособие [Текст] / сост. А. В. Каратаев, М. М.... |
| Учебно-методическое пособие для семинарских занятий, самостоятельной... Введение в профессию «Социальная работа»: учебно-методическое пособие [Текст] / сост. М. М. Хохлова, А. Н. Гончарова. Красноярск:... | | Биохимия тканей Биохимия тканей: методические указания к самостоятельной работе [Текст ] / cост. Е. В. Инжеваткин – Красноярск: Сибирский федеральный... |
| Учебно-методическое пособие для самостоятельной работы по учебной дисциплине Т 801 Субъективные основания уголовной ответственности: учебно-методическое пособие для самостоятельной работы [Текст] / сост. А.... | | Учебно-методическое пособие для самостоятельной работы по учебной дисциплине Э401 Экономические преступления: учебно-методическое пособие для самостоятельной работы [Текст] / сост. Н. А. Вербицкая. – Красноярск:... |
