Получение NK-клеток периферической крови человека.10 мл цельной крови наслаивали на 10 мл Histopaque-1077 (Sigma-Aldrich), центрифугировали 20 мин при 1400g при 20оС. Мононуклеарные клетки интерфазного кольца дважды отмывали 20-кратным объемом среды RPMI-1640 (Sigma) при 200g в течение 10 мин (20оС) и с помощью негативной или позитивной (с предварительным удалением CD3+ клеток) селекции на иммуномагнитных сепараторах Vario MACS (Myltenyi Biotech) и BD IMagnet (BD Bioscience) выделяли обогащенную фракцию NK-клеток, используя CD56 Microbeads, NK Cell Isolation Kit (Miltenyi) или BD IMag Human NK-cell Enrichment Set-DM (BD Bioscience) согласно инструкции фирм-производителей. Чистота выделения фракции NK-клеток, подтверждаемая проточной цитофлуориметией (Facs Calibur, BD Biosciences) составляла 99%.
Культивирование опухолевых клеток К562. Опухолевая линия эритролейкемии человека была получена из Института молекулярной биологии (г. Новосибирск). Опухолевые клетки поддерживали пассированием in vitro в пластиковых флаконах в среде RPMI-1640, содержащей 5 мМ 2-меркаптоэтанола (Sigma), 4 мМ L-глютамина и антибиотики (100 U/ml пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина), а также инактивированную фетальную сыворотку крупного рогатого скота (Биолот, Россия) в атмосфере с 5% СО2, при 370С. Свежеразмороженную клеточную линию для усиления роста и жизнеспособности клеток культивировали в присутствии 3-5 млн. перитонеальных макрофагов мыши в 10-20 мл культуральной среды в СО2–инкубаторе. Для свежеприготовленной линии клеток содержание эмбриональной сыворотки составляло 10-20%. Для дальнейшего культивирования клеток было достаточно 5-10% содержания сыворотки.
Проточная цитофлуориметрия. Оценку фенотипических характеристик NK-клеток проводили методом проточной цитофлуориметрии. Клетки метили моноклональными антителами к cоответствующим маркерам CD56, CD314 (NKG2D), CD44, CD62L, CXCR4 (BD Biosciences), коньюгированными с флуоресцентными красителями, согласно прилагаемым к ним инструкциям при 4оС в течение 30 мин. При цитоплазматическом окрашивании клетки после мечения поверхностных маркеров фиксировали, затем проводили пермеабилизацию cогласно прилагаемой к набору для внутриклеточного мечения CytoFix/CytoPerm инструкции фирмы-производителя (BD Biosciences). Антитела к гранзиму, перфорину, IL-4/IFNγ, CXCR4 (BD Bioscience), меченые флуоресцентными красителями, добавляли к клеточному осадку, инкубировали 15-30 мин при 4оС и после отмывки анализировали на проточном цитофлуориметре. В качестве негативного контроля использовали клетки, обработанные контрольными антителами соответствующего изотипа и концентрации, не обладающими специфичностью в отношении исследуемых антигенов.
Для оценки изменений экспрессии поверхностного и цитоплазматического CXCR4 после воздействия SDF-1 выделенные NК-клетки (2х106кл/мл) инкубировали с SDF-1 (500 нг/мл) в RPMI-1640 при 37оС и 5% СО2 в течение 18 ч, затем после отмывки проводили мечение поверхностных и цитоплазматических молекул CXCR4 антителами и анализировали на проточном цитофлуориметре.
Цитотоксический тест. В работе использовали метод оценки цитотоксической активности с применением проточной цитофлуориметрии (Бахус Г.О. и др., 2001). В качестве мишеней для NK использовали клетки эритролейкемии человека К562. Клетки отмывали средой RPMI-1640, доводили до концентрации 106 кл./мл и метили флуоресцентной меткой СFSE (Fluka, США) в конечной концентрации 0,3 мкМ/мл в фосфатном буферном растворе, содержащем 5% фетальной сыворотки телят, инкубируя в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем клетки отмывали в 10-кратном объеме этого же буферного раствора при 300g 5 мин (20оС) и смешивали с клетками-эффекторами в соотношении 1:10 в полной культуральной среде в планшете с круглодонными ячейками и инкубировали в течение 18 ч при 37оС и 5% СО2. В качестве контроля использовали клетки линии К562, инкубируемые в отсутствии NK. По окончании реакции к клеточной взвеси добавляли 7AAD (BD Biosciences) согласно прилагаемой инструкции-производителя. Образцы анализировали на проточном цитофлуориметре. Среди всех вовлеченных в реакцию клеток погибшие клетки К562 определяли по одновременному включению СFSE и 7AAD. Коэффициент цитотоксичности (КЦ) NK-клеток вычисляли по формуле: КЦ=О-К, где О - процент погибших клеток К562 в опыте, К - то же самое в контроле.
Оценка секреции IL-10 NK-клетками. Для анализа IL-10-секретирующих NK-клеток использовали коммерческий набор IL-10 Secretion Assay Detection Kit (Miltenyi Biotech). Согласно инструкции, к суспензии свежевыделенных NK-клеток добавляли Catch Reagent, представляющий собой специфический коньюгат антител к панлейкоцитарному антигену CD45 и к IL-10. В течение 45 мин инкубации при 37оС секретируемый IL-10 улавливался Catch Reagent и затем выявлялся вторыми антителами к IL-10, мечеными флуоресцентной меткой.
Оценка продукции IL-10 NK-клетками проводилась также с использованием коммерческого набора Human IL-10 ELISPOT Set (BD Biosciences) согласно прилагаемой инструкции производителя. Свежевыделенные нестимулированные NK-клетки периферической крови в концентрации 106 кл./мл в 200 мкл полной культуральной среды вносили в ячейки 96-луночного планшета для ELISPOT-анализа на 18 ч. Локально секретируемый IL-10 связывался специфическими предварительно иммобилизованными антителами. После лизиса клеток связанные молекулы цитокина выявляли с помощью биотинилированных антител к IL-10, конъюгата стрептавидин-пероксидазы и субстрата (3-амино-9-этил-карбазол). 18-часовая инкубация была определена как оптимальное время для идентификации цитокин-секретирующих NK-клеток до начала их пролиферации. Секрецию IL-10 NK-клетками в ELISPOT-анализе оценивали также в условиях активации IL-2 (Биотех, Россия) в конечной концентрации 50 нг/мл либо при кокультивировании с клетками линии К562 в соотношении 1:1.
Цитоплазматическое содержание IFNγ и IL-4 в свежевыделенных NK-клетках определяли с помощью набора FastImmune IFNγ-FITC/IL-4-PE (BD Bioscience) на проточном цитофлуориметре.
Полученные данные обрабатывали методами математической статистики на персональном компьютере с использованием программы «STATISTICA 6.0» и прикладной программы Microsoft Excel. Таблицы и рисунки содержат информацию в виде средних арифметических величин (М) и средних квадратических ошибок средней арифметической (m), медианных значений (Ме) и диапазонов квартильных значений (Q1, Q3). При нормальном распределении выборки для статистической проверки использовался t-критерий Стьюдента. Если исследуемые выборки не подчинялись нормальному распределению, использовался непараметрический критерий Манна-Уитни. Достоверность различий данных, связанных между собой, вычисляли с использованием метода связанных выборок (Урбах В.Ю., 1975). Для оценки связи признаков применяли корреляционный анализ с расчетом корреляции в программе Microsoft Excel. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р≤0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.
Изучение маркеров цитотоксичности NK-клеток здоровых доноров и больных раком легкого. После проведенного цитофлуориметрического анализа изолированных NK-клеток периферической крови в обследуемой группе пациентов с раком легкого не выявлено отклонений в процентном содержании NK, позитивных по экспрессии NKG2D, рецептора активации NK-клеток. (рис. 1 А). Медиана содержания CD56+NKG2D+ клеток составила 25,4% и 28,4% от всей популяции NK в группе контроля и пациентов с раком легкого соответственно (р<0,05, критерий Манна-Уитни). При анализе экспрессии NKG2D+ NК-клеток по средней интенсивности флуоресцентного свечения (MFI), как показателя плотности распределения поверхностного рецептора, также не было выявлено статистически значимых различий между больными раком легкого и здоровыми донорами (рис. 1 Б). Особенностью пациентов с раком легкого явилось то, что разброс значений MFI NKG2D+ NК-клеток был намного больше, чем в группе контроля.
Рис.1. Содержание CD56+NKG2D+ фракции в NK-клеточной популяции периферической крови доноров (Д) (n=9) и пациентов с раком легкого (РЛ) (n=11) (А). Экспрессия NKG2D на NК-клетках больных РЛ и здоровых доноров (Б). Примечание: для каждой переменной отображены: медиана, квартильный размах (25%, 75% процентили), размах (минимум, максимум).
Гранзим В и перфорин играют ключевую роль на стадии лизиса клеток-мишеней и являются основными маркерами цитотоксичности NK-клеток. Предполагается, что перфорин облегчает вход гранзима В (сериновая протеаза) в клетку-мишень, что вызывает ее гибель (Lord S.J. et al., 2003). Анализ не показал статистически значимых различий в процентном содержании перфорин- и гранзим B-позитивных NK-клеток у больных и здоровых людей (p>0,05, критерий Манна-Уитни) (рис. 2 А). Кроме того, анализ не выявил достоверных различий в относительном содержании NK-клеток, позитивных по перфорину, у больных раком легкого независимо от стадии заболевания по сравнению с контролем (рис.2 Б).
Одновременно функциональную активность свежевыделенных NK-клеток оценивали в цитотоксическом тесте. Традиционно натуральную цитолитическую активность оценивают в радиоактивных тестах, используя в качестве мишеней клетки К562, меченые 3Н-уридином или 51Cr. В качестве клеток-эффекторов обычно используют мононуклеары периферической крови, которые выделяют на градиенте плотности фиколл-гепака (Бахус Г.О. и др., 2001). Однако использование общей фракции мононуклеаров не исключает влияния других популяций клеток крови на NK-активность. Для проведения сравнительного анализа цитотоксичности NK-клеток периферической крови онкологических больных и здоровых доноров мы применили метод оценки цитолитической активности с использованием проточной цитофлуориметрии (Бахус Г.О. и др., 2001).
Рис. 2. Процентное содержание CD56+гранзим В+ и CD56+перфорин+ фракций в NK-клеточной популяции периферической крови здоровых доноров (Д) (n=10) и больных (РЛ) (n=13) (А). Содержание CD56+перфорин+ фракции в NK-клеточной популяции периферической крови больных РЛ на II (n=6) и III (n=7) стадии заболевания. Примечание: для каждой переменной отображены медиана, квартильный размах (25%, 75% процентили), размах (минимум, максимум).
Цитометрический метод оценки цитотоксической активности изолированной фракции NK-клеток не показал ее достоверного снижения у больных раком легких (p=0,09, критерий Манна-Уитни) (рис. 3), также не было выявлено статистически значимых различий (р>0,05, критерий Манна-Уитни) в цитотоксичности NK-клеток больных по сравнению со значениями доноров после разделения пациентов на подгруппы с различной стадией заболевания (рис.3).
Рис. 3. Цитотоксическая активность NK-клеток здоровых доноров (Д) и больных (РЛ). Фракция NK-клеток была выделена из периферической крови здоровых доноров (n=8) и пациентов с РЛ (n=10) на II (n=5) и III стадии (n=5) заболевания и оценена на цитотоксичность в отношении клеток культуры К562 цитометрическим методом. Примечание: для каждой переменной отображены медиана, квартильный размах (25%, 75% процентили), размах (минимум, максимум).
Анализ корреляционных отношений не установил четкой статистически значимой взаимосвязи между коэффициентом цитотоксичности NK-клеток и количеством NK, позитивных по экспрессии NKG2D (r=0,60 в контрольной группе и r=0,04 в группе больных, р<0,05) и перфорина (r=0,58 и r=0,28 в контрольной группе и группе пациентов с раком легкого соответственно, р<0,05), ни в одной из исследуемых групп.
Рядом работ было показано, что цитолитическая активность NK-клеток периферической крови снижена по сравнению со здоровыми донорами у пациентов с меланомой, раком легких, опухолью головы и шеи, раком шейки матки, мочевого пузыря, печени и молочной железы. Причем активность NK снижалась по мере прогрессирования онкологического процесса. Однако другие исследователи не нашли изменений натуральной цитотоксичности при раке толстой кишки, глотки, молочной железы независимо от стадии заболевания (Brittenden J. et al., 1996). Lin Ching-Yang и соавт. отмечали значительное снижение цитотоксичности NK-клеток периферической крови по отношению к клеткам линии К562 у больных раком легких на поздних стадиях только в случае наличия отдаленных метастазов. У пациентов на III стадии рака без клинических признаков отдаленных метастазов цитолитическая активность NK-клеток достоверно повышалась по сравнению с контролем (Ching-Chi Lin et al., 1987). Balch С.М. и соавт. не зафиксировали нарушений цитолитической функции NK-клеток периферической крови при раке легких на III стадии по сравнению с контролем (Balch.А., 1973).
В нашем исследовании разница в цитотоксичности NK-клеток между здоровыми донорами и пациентами с раком легкого также не достигала статистической значимости, хотя для онкологических больных был характерен более широкий интервал варьирования цитолитической активности NK-клеток, чем для здоровых. Необходимо отметить, что группу больных с раком легких на III стадии составляли пациенты, у которых при поступлении не выявлены отдаленные метастазы, поэтому полученные результаты, в целом, согласуются с работой Lin Ching-Yang и соавторов. В других исследованиях показано, что активность NK-клеток при раке легкого снижена и коррелирует со стадией заболевания (LeFever A.V., Funahashi A., 1991, Sibbitt W.L. et al., 1984). Наиболее очевидным объяснением противоречивых результатов являются различия в подходах, используемых для оценки цитотоксичности. Как правило, оценивают натуральную цитолитическую активность фракции мононуклеаров периферической крови, где не исключено непосредственное влияние других иммунокомпетентных клеток.
Поскольку показано, что больные раком легкого с низкой цитолитической активностью NK-клеток имеют более короткий период ремиссии заболевания и повышенный риск развития метастазов (Ogata H., 1989), полученные нами результаты могут свидетельствовать о вероятности метастазирования опухоли у пациентов с низкой цитолитической активностью NK-клеток.
Таким образом, анализ цитотоксической активности NK-клеток периферической крови показал, что онкологический процесс при раке легких II-III стадии не сопровождался значительными ее нарушениями.
Анализ продукции цитокинов NK-клетками здоровых доноров и больных раком легкого. Цитокин-продуцирующую активность NK-клеток периферической крови онкологических больных и здоровых доноров оценивали по экспрессии цитокинов IFNγ, IL-10 и IL-4. Известно, что IFN-γ является основным эффекторным цитокином Тh 1 типа. NK-клетки рассматривают как один из основных источников образования IFNγ в организме человека (Deniz G. et al., 2002). Биологическое действие IL-4 связано с его основной функцией – направлять развитие иммунного ответа по Th 2 пути (Галактионов В.Г., 2004). Основываясь на важности этих цитокинов, мы провели анализ содержания клеток, продуцирующих цитокины в популяции изолированных NK периферической крови здоровых доноров и больных раком легкого. Мы оценивали количество NK, продуцирующих IFNγ и IL-4, без добавления каких-либо стимулов и митогенов, поскольку такой подход отражает содержание среди свежевыделенных мононуклеров крови NK-клеток, предактивированных in vivo.
При сравнении NK-клеток здоровых доноров и больных раком легкого значимых отличий по цитоплазматическому содержанию IFNγ и IL-4 выявлено не было. Клетки, позитивные по экспрессии IFNγ и IL-4, представляли небольшую популяцию общей фракции NK-клеток периферической крови (5,5±3,3% у здоровых доноров и 6,8±3,1% у больных раком, р=0,72, критерий Стьюдента). Относительное содержание NK, продуцирующих IL-4, у больных раком легкого имело тенденцию к увеличению по сравнению с группой контроля (р=0,62, критерий Манна-Уитни) (рис. 4). Интересно, что снижения процента IFNγ-продуцируюших клеток при раке выявлено не было, медиана содержания IFNγ+ NK-клеток составила 3,67% у доноров и 3,28% у пациентов с раком легкого (р=0,71, критерий Манна-Уитни) (рис. 4). После разделения пациентов на подгруппы в зависимости от стадии заболевания медиана содержания IFNγ+ NK-клеток находилась на уровне 2,88 у больных на II стадии (n=4) и 3,28 у больных на III стадии (n=9) заболевания (р>0,05, критерий Манна-Уитни). Достоверных отличий между донорами и этими группами не выявлено.
Рис.4. Анализ NK-клеток, содержащих цитоплазматические цитокины IFNγ и IL-4, у здоровых доноров (Д) (n=6) и больных (РЛ) (n=13). Примечание:для каждой переменной отображены медиана, квартильный размах (25%, 75% процентили), размах (минимум, максимум).
Отношение содержания NK-клеток, позитивных по IFNγ, к NK-клеткам, позитивным по IL-4, составляло 0,91±0,22 и 0,59±0,26 (р=026) в группе контроля и пациентов с раком легкого соответственно, что свидетельствовало о тенденции сдвига соотношения цитокинового профиля NK-клеток больных в сторону Th2, в основном за счет увеличения численности NK, продуцирующих IL-4.
IL-10 оказывает плейотропное действие в организме, которое определяется уровнем его содержания в тканях, природой продуцирующих клеток и активирующих сигналов и т.д. (Сavaillon J.M., 2001). С одной стороны IL-10 является потенциальным стимулятором NK-клеток (Kundu N. et al., 1996, Conti P. et al., 2003). B то же время IL-10 ингибирует провоспалительные функции антигенпрезентирующих клеток, подавляя экспрессию костимуляторных молекул, высвобождение провоспалительных цитокинов и созревание антигенпрезентирующих клеток (Hsieh C.L. et al., 2000).
При использовании проточной цитофлуориметрии и набора IL-10 Secretion Assay Detection Kit мы обнаружили, что процент NK-клеток, секретирующих IL-10, был примерно одинаковым в исследуемых группах. Mедиана содержания клеток, позитивных по IL-10, составляла 12,3% (8,6; 20,0) в контрольной группе (n=9) и 18,3% (15,2; 19,7) в группе пациентов с раком легких (III стадия) (n=9) от всей популяции NК-клеток (р>0,05, критерий Манна-Уитни).
Иная картина наблюдалась в ELISPOT-анализе. В группе пациентов многократно уменьшалось (р<<0,001, критерий Стьюдента) количество IL-10-секретирующих NK-клеток по сравнению с контролем (рис. 5). Ранее было продемонстрировано, что CD56bright-cубпопуляция человеческих NK-клеток, основной функцией которой является продукция цитокинов, конститутивно экспрессирует высокоафинный рецептор к IL-2 (Baume D.M. et al., 1992). Поэтому одновременно была проведена оценка уровня секреции IL-10 NK-клетками в условиях стимуляции IL-2, а также при кокультивировании с клетками-мишенями - клетками человеческой эритролейкемии К562. Оказалось, что только присутствие клеток К562, но не IL-2 вызывало достоверное увеличение количества IL-10-секретирующих клеток. При этом различие между донорами (n=11) и онкологическими больными (n=8) сохранялось (р<<0,001, критерий Стьюдента) (рис. 6). Повышение продукции IL-10 в ответ на присутствие клеток-мишеней К562 косвенно свидетельствовало о значимости IL-10 в развитии цитолитических механизмов NK-клеток.
Рис. 5. Секреция IL-10 NK-клетками здоровых доноров (А) и больных РЛ (Б) в ELISPOT-анализе. 3 репрезентативных результата.
Рис.6. IL-10-секретирующие NK-клетки периферической крови здоровых доноров (Д) (n=11) и больных (РЛ) (n=8). Клетки культивировали 18 ч в присутствии К562 (в соотношении 1:1) и IL-2 (50 нг/мл). Примечание: данные представлены в виде средней и стандартной ошибки средней. На рисунке стрелками обозначены достоверные различия опыта и контроля р<0,05 (по критерию Стьюдента), * - достоверность отличий РЛ от Д р<0,05 (по критерию Стьюдента).
Таким образом, у здоровых доноров количество нестимулированных IL-10-секретирующих клеток, выявленных в ELISPOT-анализе, составило порядка 0,1 % от всей популяции NK, у больных этот показатель падал до 0,001%. То есть при использовании двух различных методических подходов к определению IL-10-секретирующих NK-клеток, были получены противоречивые результаты. Мы предположили, что IL-10 Secretion Assay detection Kit способен определять дополнительные клеточные параметры, а именно мембран-ассоциированную форму IL-10 на поверхности NK-клеток. Для подтверждения этой гипотезы была проведена фиксация цитоплазматической мембраны NK-клеток параформальдегидом. Фиксация клеточной мембраны блокирует секрецию IL-10, однако позволяет выявлять мембран-ассоциированную форму исследуемого цитокина антителами к IL-10, мечеными флуоресцентной меткой. Для того, чтобы доказать наличие рецепторов к IL-10 и специфичность антител к IL-10, свежевыделенные NK-клетки были последовательно обработаны параформальдегидом, рекомбинантным IL-10, моноклональными антителами к IL-10, конъюгированными с фикоэритрином, и проанализированы на проточном цитофлуориметре. Цитометрический анализ интенсивности флуоресцентного свечения (MFI) фиксированных NK здоровых доноров показал наличие мембран-ассоциированной формы IL-10, а также наличие на этих же клетках рецепторов к IL-10, выявляемых по увеличению MFI после добавления IL-10 (рис. 7).
Рис 7. Экспрессия мембран-ассоциированной формы IL-10 на NK-клетках периферической крови. 3 репрезентативных результата
Кроме того, была проведена модификация метода использования IL-10 Secretion Assay detection Kit. С целью выявления мембран-ассоциированной формы IL-10 на NK-клетках периферической крови здоровых доноров и больных раком легкого был пропущен этап мечения клеток Catch Reagent, и выделенные клетки непосредственно окрашивали флуорохром-конъюгированными антителами к IL-10. Результаты модифицированного анализа не выявили статистически значимых различий в показателях экспрессии мембран-ассоциированной формы IL-10 на NK-клетках здоровых доноров и пациентов с раком легкого (13,17± 0,78% и 13,52±0,38% в контрольной группе (n=5) и группе больных (n=5) соответственно, р>0,05, критерий Стьюдента).
Сравнительная характеристика экспрессии молекул адгезии и хоуминга на NK-клетках в норме и при раке легкого. Для оценки возможных нарушений миграционной активности NK-клеток при раке легкого мы исследовали экспрессию молекул адгезии и хоуминга СD44, CD62L и CXCR4. Молекула адгезии CD62L (L-селектин) опосредует начальное прикрепление и медленный роллинг клеток по люминальной поверхности венул c высоким эндотелием, то есть первый шаг в проникновении иммунокомпетентных клеток в лимфатические узлы, Пейеровы бляшки, а также в опухоль и очаг воспаления (Chen S. et al., 2005, Sobolev O. et al., 2009). Показана функция CD44 в качестве молекулы адгезии, взаимодействующей с межклеточным матриксом и эндотелием, а также активационной молекулы (DeGrendele H.C. et al., 1996). Хемокин SDF-1 (СXCL12) и его рецептор CXCR4 играют важную роль на последних стадиях хоуминга иммунокомпетентных клеток (Robertson M., 2002).
На начальном этапе работы определяли общее количество циркулирующих NK-клеток в периферической крови здоровых волонтеров и пациентов с раком легкого. Количественный анализ содержания NK-клеток в периферической крови выявил достоверное увеличение среднего содержания CD56+CD3- лимфоцитов в периферической крови онкологических больных относительно аналогичного параметра у здоровых доноров. Содержание CD56+CD3- - клеток в периферической крови составило 11,50±2,40% у здоровых доноров (n=5) и 21,21±1,59% у больных с онкологической патологией (n=6) (р=0,009, критерий Стьюдента). На следующем этапе исследования у здоровых доноров (n=16) и пациентов с раком легкого (n=11) на II (n=1) и III (n=10) стадии развития заболевания определяли экспрессию молекул адгезии CD44, CD62L на поверхности NK-клеток, полученных из общей фракции мононуклеаров периферической крови с использованием метода иммуномагнитной сепарации. По данным анализа у больных было отмечено достоверное снижение в 2,5 раза (р<0,05, критерий Стьюдента) процентного содержания NK, экспрессирующих CD62L (рис. 8).
Рис. 8. Содержание CD56+CD44+ - и CD56+CD62L+ фракции в популяции NK-клеток периферической крови здоровых доноров (Д) (n=16) и больных (РЛ) (n=11). Примечание: данные представлены в виде средней и стандартной ошибки средней. * - достоверность отличий РЛ от Д р<0,05 (по критерию Стьюдента).
При вычислении отношения процента NK-клеток, экспрессирующих маркер CD44, к проценту NК, несущих маркер CD62, выявлено, что у больных раком это отношение было почти в 4 раза выше, чем у здоровых людей (4,8±0,9 % и 12,03±2,1% в контрольной группе (n=10) и группе пациентов с раком легкого (n=9) соответственно, р<0,05, критерий Стьюдента). Цитофлуориметрический анализ одновременной экспрессии изучаемых маркеров показал, что относительное количество CD62L+ CD44+ фракции в популяции NК-клеток пациентов с раком легких было достоверно ниже соответствующего параметра в контроле, что отображено на рисунке 9 и рисунке 10.
Рис. 9. Содержание CD44+CD62L+ фракции в популяции NK-клеток периферической крови здоровых доноров (Д) (n=8) и больных (РЛ) (n=9). Примечание: данные представлены в виде средней и стандартной ошибки средней. * - достоверность отличий РЛ от Д р<0,05 (по критерию Стьюдента).
Рис. 10. Два репрезентативных результата оценки одновременной экспрессии CD62L и CD44 на NK-клетках периферической крови здорового донора (А) и пациента с РЛ на II стадии (Б).
Таким образом, можно предположить, что при раке легкого снижается количество NK-клеток, способных проникать через эндотелиальный барьер к месту локализации новообразования. Согласно литературным данным снижение экспрессии CD62L было также обнаружено на CD4+ и CD8+ Т-клетках у экспериментальных животных в модели рака молочной железы 4Т1 (Hanson E. et al., 2009). Причем показано, что такое снижение может быть обусловлено воздействием иммуносупрессорных клеток миелоидного происхождения (MDSC), которые накапливаются в костном мозге, лимфоузлах и периферической крови в ответ на факторы, секретируемые опухолью. Снижение экспрессии CD62L на иммунокомпетентных клетках, по-видимому, реализуется через экспрессию на мембране MDSC молекулы ADAM17, фермента, участвующего в протеолитическом отщеплении эктодомена рецептора CD62L.
Анализ экспрессии хемокинового рецептора CXCR4 на NK-клетках исследуемой группы пациентов c раком легкого не выявил достоверных различий от группы контроля (рис. 11).
Рис.11. Содержание CD56+CXCR4+ фракции в популяции NK-клеток периферической крови здоровых доноров (Д) (n=12) и больных (РЛ) (n=9) (A). Плотность распределения рецептора СXCR4 на поверхности NК-клеток периферической здоровых доноров (n=12) и больных РЛ (n=9) (Б). Примечание: данные представлены в виде средней и стандартной ошибки средней.
По литературным данным СXCR4 экспрессируется в цитоплазме клеток мононуклерной фракции периферической крови человека, миелоидных прогениторных клеток, где служит некоторым «резервуаром» рецептора, позволяющим быструю ответную реакцию на SDF-1, специфический лиганд хемокинового рецептора (Ding Z. et al., 2003). При внутрицитоплазматическом окрашивании практически 100% свежевыделенных NК-клеток периферической крови здоровых доноров и больных раком легкого были позитивны по СXCR4 (рис. 12).
Рис. 12. Два репрезентативных результата оценки экспрессии цитоплазматического CXCR4 NK-клеток периферической крови здорового донора (А) и больного РЛ (Б).
При изучении реакции NК-клеток больных раком легкого и здоровых доноров в ответ на воздействие хемоаттрактанта SDF-1 установлены следующие особенности. В норме при стимуляции NК-клеток SDF-1 наблюдался эндоцитоз рецептора, о чем свидетельствовало четкое снижение поверхностной экспрессии и увеличение внутриклеточного пула СXCR4 (р<0,05, метод связанных выборок) (рис. 13 А). При анализе реакции NК-клеток на SDF-1 у больных раком легкого (III стадия заболевания) статистически значимых изменений экспрессии поверхностного и внутриклеточного СXCR4 не зафиксировано (р>0,05, метод связанных выборок) (рис.13 Б) То есть у больных либо не происходило интернализации рецептора СXCR4, либо были нарушены внутриклеточные процессы восстановления баланса между поверхностным и внутриклеточным уровнем экспрессии рецептора. Поскольку эндоцитоз рецептора СXCR4 необходим для запуска сигнальной трансдукции и хемотаксиса клетки по градиенту концентрации SDF-1 (Libura J. et al., 2002), на основании имеющихся данных можно предположить, что у больных раком легкого нарушен хемотаксис NК-клеток в направлении повышения концентрации SDF-1.
Pис.13. Изменение экспрессии поверхностного и цитоплазматического СXCR4 NK-клеток периферической крови здоровых доноров (Д) (n=9) (А) и больных (РЛ) (n=6) (Б) в ответ на воздействие SDF-1. Клетки культивировали 18 ч в присутствии SDF-1 (500нг/мл), цитофлуориметрический анализ проводился с использованием комбинации антител CD56/CXCR4. Примечание: данные представлены в виде средней и стандартной ошибки средней. На рисунке стрелками обозначены достоверные различия опыта и контроля р< 0,05 (метод связанных выборок).
Известна роль CD62L-опосредованного сигнального пути в функционировании хемокинового рецептора СXCR4 (Ding Z. et al., 2003). Исходя из полученных нами данных о глубоких нарушениях в экспрессии CD62L на циркулирующих NK-клетках больных раком легкого, мы провели исследование влияния стимуляции CD62L на экспрессию СXCR4 NK-клетками периферической крови здоровых доноров и больных с онкологической патологией.
Для активации CD62L мы использовали фукоидан (полимер L-сульфатированной фукозы), один из лигандов молекулы (Ding Z. et al., 2003). 16-часовая инкубация с фукоиданом индуцировала статистически значимое повышение уровня экспрессии рецептора СXCR4 на поверхности NK-клеток здоровых доноров в среднем в 1,9 раза (p<0,05, метод связанных выборок) от исходного уровня (рис. 14 А). Влияние фукоидана на экспрессию СXCR4 на NK-клетках было специфическим, поскольку после инкубации клеток в тех же условиях в присутствии гиалуронана (50 мкг/мл), лиганда молекулы CD44, уровень экспрессии хемокинового рецептора СXCR4 не изменялся (228,8±44,8 и 245±44,0 в контроле и опыте соответственно, n=6, р>0,05, метод связанных выборок). CD62L-опосредованное повышение пула поверхностного СXCR4 сопровождалось снижением интенсивности флуоресцентного свечения цитоплазматического СXCR4 (р<0,05, метод связанных выборок) (рис. 14 Б). По-видимому, активация сигнальных путей СD62L приводила к транслокации хемокинового рецептора из внутриклеточного пула на поверхность NK-клеток. Способность лиганда L-селектина повышать экспрессию поверхностного рецептора СXCR4 на NK-клетках больных раком легкого была в 1,7 раза ниже по сравнению со здоровыми донорами, достоверных изменений в уровне цитоплазматического СXCR4 выявлено не было (рис. 14).
Рис. 14. Влияние стимуляции L-селектина на экспрессию поверхностного (А) и внутриклеточного (Б) СXCR4 на NK-клетках периферической крови здоровых доноров (Д) (n=6) и больных (РЛ) (n=10). Клетки культивировали 16 ч в присутствии фукоидана (100 мкг/мл), цитофлуориметрический анализ проводился с использованием комбинации антител CD56/CXCR4. Примечание: данные представлены в виде средней и стандартной ошибки средней. * - достоверность отличий опыта от контроля р< 0,05 (метод связанных выборок).
Нам представляется, что роль CD62L в регуляции хемотаксиса NK-клеток по градиенту концентрации SDF-1 заключается в повышении клеточной чувствительности к хемокину. То есть в норме взаимодействие поверхностного CD62L с лигандами приводит к увеличению количества рецепторов CXCR4 на поверхности клеток за счет мобилизации внутриклеточного пула этих молекул. У больных раком легкого уровень циркулирующих CD62L-позитивных NK-клеток снижен. Кроме того, повышение уровня поверхностного CXCR4 в ответ на стимуляцию CD62L на этих клетках выражено слабее, что в целом может быть причиной «неготовности» цитолитических NK-клеток к миграции в опухоль и соответственно к осуществлению своей тумороцидной функции. |
