Кратасюк В.А. «Биолюминесцентные биосенсоры: от идеи до коммерциализации»
ИР 1.1.11 Количество созданных в рамках НИР объектов интеллектуальной собственности (всего- 3), в т.ч.:
ИР 1.1.12 Изобретение -3
Получено положительное решение о выдаче 3 патентов:
1.Кудряшева Н.С., Белогурова Н.В. Флуоресцентный способ определения концентрации кальция. Заявка на патент РФ, рег.№2009130133/13, приоритет от 05.08.2009.
2. Кратасюк В.А., Есимбекова Е.Н. Биолюминесцентный биомодуль и способ его приготовления. Заявка на патент РФ, рег. № 2009110636, приоритет от 23.03.2009.
3.Кратасюк В.А., Есимбекова Е.Н. Экспресс-способ биотестирования природных, сточных вод и водных растворов. Заявка на патент РФ, рег. № 2009113656, приоритет от 10.04.2009.
Таким образом, по индикаторам И1.1.2, П1.1.5, П1.1.6 Ц6.2 выполнены плановые показатели; по индикаторам И1.1.3, И1.1.4, П1.1.1, П1.1.2, П1.1.3, П1.1.4, Ц6.1, Ц7, Ц8, Ц8.1, ИР1.1.3, ИР1.1.5, ИР 1.1.8, ИР1.1.9, ИР1.1.10, ИР1.1.11, ИР1.1.12 показатели существенно превышены.
Заключение
За отчетный период получены следующие основные результаты:
В постоянную биотехнологическую культуру введены два вида светящихся грибов – Armellaria borealis из сибирского леса и Neonathopanus nambi из лесов южного Вьетнама.
Разработана методика и подобраны среды и условия культивирования, позволяющие получать препаративные количества биомассы грибов, обеспечивающие их систематическое исследование.
Для культивирования N. nambi подобрана питательная среда из доступных в сибирских условиях материалов. Показано, что опилки осины – березы успешно заменяют древесину каучуконосной гевеи - природного субстрата N. nambi, а пшеница заменяет зерна риса.
Этот вид избран в качестве основного для дальнейшего исследования из-за наибольшей скорости роста и наличия светоизлучающей системы как в мицелии так и в плодовых телах.
методами генетического анализа определено таксономическое положение вьетнамского гриба, первоначально определенного как Omphalotus af. illudent (Dao Thi Van, 2002) и в настоящее время переопределенного в совместной работе Г. Выдряковой (ИБФ), Дао Тхи Ван (Biolum Co, Vietnam) и J. Bissett (Agriculture and Agri-Food Canada, Canada) как Neonathopanus nambi.
выполнено детальное биохимическое исследование химического состава биомассы мицелия и плодовых тел N. nambi. Определен аминокислотный, жирнокислотный, элементный состав.
Методом масс-спектрометрии исследован липидный и жирнокислотный состав экстрактов, полученных из сухой биомассы плодовых тел гриба N. nambi. При этом в исследованных экстрактах гриба не обнаружен иллудин – компонент высших грибов, обладающий цитостатическим действием. Выявлено низкое содержание липидов (5,3% сухого вещества) в биомассе исследуемой культуры N. nambi. Содержание неомыляемой фракции не превышало 6,0% от общего количества липидов. Омыляемые компоненты, в состав которых входят жирные кислоты ациллипидов, составили 30,2% от суммылипидов. Жирнокислотный состав экстрактов, полученных из сухой биомассы плодовых тел гриба N. nambi, исследован методом масс-спектрометрии. Он оказался весьма необычным. Обнаружены жирные кислоты с количеством атомов углерода от 8 до 26. Особенностью жирнокислотного состава N. nambi оказалось также большое количество изомеров линолевой кислоты (С 18:2) в зрелых подовых телах – 7-8 изомеров, в мицелии и молодых плодовых телах – 3-4. При этом количество некоторых изомеров достигало 45% от общего количества жирных кислот. Данные о положении двойных связей были подтверждены масс-спектрометрией ДМОК (диметилоксазолиновых) - производных соответствующих жирных кислот, поскольку введение в цепь жирной кислоты оксазолинового кольца позволяет точно определить положение двойной связи в молекуле.
Определен спектр излучения N. nambi. Установлено его сходство по сравнению с исследованными по этому параметру видами светоизлучающих грибов. Это позволяет с высокой вероятностью предположить, что светоизлучающая система этого вида идентична или очень близка системам других грибов.
Исследована кинетика излучения мицелия N. nambi и ее реакции на внешние воздействия химические (влияние ряда токсикантов) и механические.
По чувствительности к некотором из них биолюминесцентные системы N. nambi и A.borealis превосходят бактериальные биолюминесцентные тест-системы, по другим сопоставимы или менее чувствительны. Это показывает, что для грибных биолюм-тестов есть ниша, отличная от бактериальных биолюм-тестов.
Получены первичные данные о структурно-функциональной организации и физико-химических свойствах люминесцентной системы N. nambi. Показано, что образцы мицелия, выращенные на твердых и жидких питательных средах, обладают способностью длительной светопродукции – развитие люминесцентного сигнала до максимума достигается от нескольких часов и длится до нескольких недель.
Показано, что люминесцентная система N. nambi является кислородзависимой и, вероятно, локализована в клеточной мембране гриба, в гомогенатах, полученных после разрушения мицелия, люминесцентная активность не обнаруживается.
Ионы двухвалентных металлов оказывают действие на люминесцентную систему гриба, ионы ионы Mn активируют светоизлучение, а ионы Ni, Co, Mg ингибируют ее, не влияют на излучение ионы Ca.
Показано, что супероксид анион радикал не принимает участия в реакции светоизлучения N. nambi, что отличает эту люминесцентную систему от люминесцентных систем других грибов.
Обнаружен низкомолекулярный термостабильный компанент, значительно (до 2-х порядков) повышающий светопродукцию мицелия гриба.
Показана возможность длительного поддержания свечения мицелия (20 суток и более), что открывает перспективы создания долго действующих («ждущих») сигнальных тестов на появление токсикантов в водных и воздушных средах.
По материалам работ готовятся публикации в рецензируемых журналах.
Полученные результаты создают достаточную основу для дальнейшего планомерного изучения природы свечения грибов: в фундаментальном - расшифровка биохимической и генетической основы биолюминесценции грибов и прикладном направлениях – создании грибных биолюминесцентных тест-систем, действующих длительно в режиме ожидания.
В следующем году исследования биолюминесценции грибов будут включать:
измерение кинетических параметров грибной биолюминесценции с целью выявления природы ее катализатора;
получение экспериментальных данных для решения ключевого вопроса о механизме свечения грибов – ферментативного или хемилюминесцентного;
изучение генетической организации механизма, обеспечивающего свечение грибов; разработка принципов создания нового класса «ждущих» аларм-сенсоров токсичности на основе молекулярно-клеточного механизма биолюминесценции грибов.
Для создания научно-образовательного пространства, включающего преподавателей, научных работников, молодых ученых, студентов и аспирантов разных специальностей развивается инновационный образовательный процесс на основе новых полученных результатов. Развиваются новые принципы ведения научных исследований со студентами, магистрантами и аспирантами при выполнении курсовых и дипломных работ, а также магистерских и кандидатских диссертаций по темам проекта, внедряются в учебный процесс разработанные ранее Учебно-методические комплексы дисциплин, активно развивается научно-исследовательская и инновационная деятельность в рамках Молодежной Международной Открытой Лаборатории Перспективных Исследований и Технологий (МОЛПИТ), регулярно проводятся заседания Научно-образовательного семинара по биохимической физике.
На следующем этапе будут проведены исследования по теме «Создание прототипов экспериментальных моделей для исследования функционирования ферментов в клетках светящихся бактерий», работа будет происходить по следующим направлениям:
Получение прототипов экспериментальных моделей для цепи сопряжения двух ферментов светящихся бактерий в растворах повышенной вязкости и в матричной структуре геля. Сравнительная оценка 4 прототипов экспериментальных моделей.
Анализ соответствия вязкости клеточной цитоплазмы вязкостям в прототипах экспериментальных моделей и спектров флуоресценции и анизотропии флуоресценции в исследуемых физико-химических моделях.
Сравнение активности и стабильности биолюминесцентной системы в клетке светящихся бактерий, прототипах физико-химических моделей и в растворах для определения адекватности предложенных моделей.
Разработка математической модели, описывающей количественные зависимости выхода активности иммобилизованной биолюминесцентной системы от концентрации компонентов реакции, срока хранения, вязкости среды иммобилизации. Исследование соответствия математической модели параметрам физико-химических моделей.
Исследование физико-химической модели функционирования ферментов в клетке и концепции ее использования для понимания механизмов стабилизации.
Подбор условий для совместной иммобилизации в гели различной природы ферментов и их субстратов и кофакторов, оценка эффективности их взаимодействия.
Выполнение индикаторов по проекту: по индикаторам И1.1.2, П1.1.5, П1.1.6 Ц6.2 выполнены плановые показатели; по индикаторам И1.1.3, И1.1.4, П1.1.1, П1.1.2, П1.1.3, П1.1.4, Ц6.1, Ц7, Ц8, Ц8.1, ИР1.1.3, ИР1.1.5, ИР 1.1.8, ИР1.1.9, ИР1.1.10, ИР1.1.11, ИР1.1.12 показатели существенно превышены.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ
Bechor O, Smulski D.R., Van Dyk T.K., LaRossa R.A., Belkin S. Recombinant microorganisms as environmental biosensors: pollutants detection by Escherichia coli bearing fabA'::lux fusions. //J.Biotechnology. 2002. V. 94. № 1. P. 125–132.
Roda A., Pasini P., Mirasoli M., Michelini E. and Guardigli M. Biotechnological applications of bioluminescence and chemiluminescence. //TRENDS in Biotechnology, 2004. V.22. № 6.: P. 295-303.
Girotti S., Ferri E.N, Fumo M.G., Maiolin E. Monitoring of environmental pollutants by bioluminescent bacteria. //Anal Chim Acta. 2008. V.608: P. 2–29.
Herring, P.J. Luminous fungi. Mycologist, 1994. V. 8: P.181-183.
Desjardin, D. E., Oliveira A.G., Stevani, C. V. Fungi bioluminescence revisited. //Photochem Photobiol Sci. 2008. V.7. P. 170-182.
Выдрякова Г.А., Псурцева Н.В., Белова Н.В., Пашенова Н.В., Гительзон И.И. Светящиеся грибы и перспективы их использования //Микология и фитопатология 2009, т.43, № 5, с 369-375.
Vydryakova G.A., Psurtseva N.V., Belova N.V., Gusev A.A., Pashenova N.V., Medvedeva S.E., Rodicheva E.K., Gitelson J.I. Luminous mushrooms /Light emission: Biology and Scientific applications, World Scientific Publishing, New Jersey-London-Singapore-Hong Kong, 2009. P. 79-82
Ячевский А.А. Основы микологии / Под ред. Н.А. Наумова. М.; Л., 1933.
Horswell J., Weitz H.J., Percival H.J., Speir T.W. Impact of heavy metal amended sewage sludge on forest soils as assessed by bacterial and fungal biosensors //Biol Fertil Soils. 2005. V. 42. P. 569-576.
Mendes L., Prada S., Stevani C. Evaluation of fungal acute toxicity of metals to basidiomycete fungi using a Brazilian bioluminescent species Gerronema viridilucens /Proceedings of the SETAC 26th Annual Meeting in North America (USA). 2005.
Mendes LF, Stevani CV. Evaluation of metal toxicity by a modified method based on the fungus Gerronema viridilucens bioluminescence in agar medium. //Environ Toxicol Chem. 2010 Feb;29(2):320-6.
Weitz H.J. Colin D., Campbell C.D., Killham K. Development of a novel, bioluminescence-based, fungal bioassay for toxicity testing //Environ. Microbiol. 2002. V. 4. V. 422-429.
Hollis, R.P. Construction and application of a luminescent eukaryotic biosensor. 1999. PhD Thesis, University of Aberdeen.
Hollis, R.P., Killham, K., and Glover, L.A. Design and application of a biosensor for monitoring toxicity of compounds to eukaryotes. //Appl Environ Microbiol 2000. 66:1676–1679.
Lagido, C., Pettitt, J., Porter, A.J.R., Paton, G.I., and Glover, L.A. Development and application of bioluminescent Caenorhabditis elegans as multicellular eukaryotic biosensor. //FEBS Lett 2001. 493: 36–39.
Brock M, Jouvion G, Droin-Bergère S, Dussurget O, Nicola MA, Ibrahim-Granet O. Bioluminescent Aspergillus fumigatus, a new tool for drug efficiency testing and in vivo monitoring of invasive aspergillosis. //Appl Environ Microbiol. 2008, 74(22):7023-35.
Kozlova O., Zwinderman M., Christofi N. A new short term toxicity assay using Aspergillus awamori with recombinant aequorin gene. //BMC Microbiol 2005, 5:40-42.
Assunção N.A., Soares Ch.O., Domingues O., Stevani C.V., Bechara E.J.H. Direct Analysis of Reduced and Oxidized Glutathione by CE-ESI-MS/MS /Proceedings of 2 Congress BrMass (Sociedade Brasileira de Espectrometria de Massas – BrMASS). 2007.
Paton GI, Viventsova E, Kumpene J, Wilson MJ, Weitz HJ, Dawson JJ. An ecotoxicity assessment of contaminated forest soils from the Kola Peninsula. //Sci Total Environ. 2006. V. 355. № 1-3. P. 106-17.
Airth, R.L., and Foerster, G.E. The isolation of catalytic components required for cell-free fungal bioluminescence. //Arch Biochem Biophys 1962. 97: 567–573.
Kuwabara, S., and Wassink, E.C. Purification and properties of the active substance of fungal luminescence. In: Bioluminescence in Progress. Johnson, F.H., and Haneda, Y. (eds) Princeton, USA: Princeton University Press, 1966. pp. 233–245.
Kamzolkina O. V., Danilov V. S. and Egorov N. S., Nature of luciferase from the bioluminescent fungus Armillariella mellea, //Dokl. Akad. Nauk SSSR, 1983, 271, 750–752.
O’Kane, D.J., Lingle, W.L., Porter, D., and Wampler, J.E. Development and localization of bioluminescence in the fruiting bodies of the mushroom Panellus stypticus. //Photochem Photobiol 1986. 43: 100s.
Shimomura O. The role of superoxide dismutase in regulating the light emission of luminescent fungi. //J. Exp. Bot. 1992. 43: 1519.
Isobe M., Takahashi H., Usami K., Hattori M. and Nishigohri Y. Bioluminescence mechanism on new systems //Pure & Appl. Chem. 1994. V. 66. No. 4. P. 765-772.
Shimomura, O. Bioluminescence: chemical principles and methods. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd. 2006. 470 p.
White TJ, Bruns T, Lee S, Taylor J. Amplification and direct sequencing of fungal ribosomal RNA genes for phylogenetics. In: Innis AM, Gelfand DH, Snisnky JJ, White TJ, eds. PCR Protocols: a guide to method and applications. New York: Academic Press. 1990. p 315–322.
Kanamori-Kataoka, M., Seto, Y., Kuramoto M. Development of a method for determining illudin S in food by gas chromatography-mass spectrometry //Journal of Health Science V.52(3). 2006, p.237-242
Павлов И.Н., Миронов А.Г., Кутафьева Н.П. Морфологические признаки грибов комплекса Armillaria mellea sensu lato циркумбореальной области //Хвойные бореальной зоны, 2006. Т. 23, № 3, с.14-21.
Dao T.V. The first discovery of the bioluminescent mushroom and reseach on biology of the new fungi: Omphalotus af.illudent //The graduation thesis, 2002. http://www.khoahocphothong.com.vn/newspaper/detail/1990/nuoi-trong-nam-phat-quang-tai-viet-nam.html
Dao T.V. Physiological and cultural properties of the luminous fungus Omphalotus af. illudent //Журнал СФУ. Серия: Биология. 2009. Т. 2. № 2. С. 157-171
Дао Т.В, Культивирование светящегося гриба Omphalotus af. illudent (neonothopanus nambi) / Дао Тхи Ван // Биотехнология. - 2009. - N 6. - С. 74-78.
Polese Jean-Marie Le mini-guide des champignons. Losang: Köneman 2000. P.381.
Vydryakova G.A., Bissett J., Psurtseva N.V., Shoukouhi P., Dao T.V., Gitelson J.I. Presence of the luminous mushroom Neonothopanus nambi (Speg.) R.H. Petersen & Krisai in South Vietnam //Luminescence 2010; 25: (81–216) 187-188
Kirchmair M, Pöder R, Huber CG, Miller OK. Chemotaxonomical and morphological observations in the genus Omphalotus Fayod (Omphalotaceae). //Persoonia 2002. 17(4):583–600.
Kirchmair M., Morandell S., Stolz D., Pöder R. Phylogeny of the genus Omphalotus based on nuclear ribosomal DNA-sequences //Mycologia, 2004, 96(6), pp. 1253–1260.
Tomimura Y. Chemical characteristics of rubberwood damaged by Sinoxylon conigern Gerstäcker //Bull. For. & For. Prod. Res. Inst. N 365. 1993. P 33-43.
Suzuki S., Rodriguez E.B., Saito K., Shintani H., Iiyama K. Compositional and structural characteristics of residual biomass from tropical plantations //J Wood Sci 1998. 44:40-46
Okino E.Y.A., Resck I.S., Santana M.A.E., et al. Evaluation of wood chemical constituents of Hevea brasiliensis and Cupressus decomposed by Gloeophyllum striatum using CP/MAS 13C NMR and HPLC techniques. //Journal of Tropical Forest Science. 2010. 22(2): 184–196
Lingle W.L. Bioluminescence and ligninolysis during secondary metabolism in the fungus Panellus. /VII-th International symposium on bioluminescence and chemiluminescence. //J Bioluminescence and Chemiluminescence. 1993. 8. P.100
Lingle W. L. Effects of veratryl alcohol on growth and bioluminescence of Panellus stypticus, /Abstract,Mycol. Soc. Am.Newslett., 1989, 40, 36.
Рабинович М.Л., Болобова А.В., Кондращенко В.И. Теоретические основы биотехнологии древесных композитов. Кн. I. Древесина и разрушающие её грибы. М.: Наука, 2001. 264 с.
Dao T.V. The first discovery of the bioluminescent mushroom and research on biology of the new fungi: Omphalotus af.illudent 2006. http://www.springbrook.info/research/external/Omphalotus.af.illudent_A_M.pdf
Hatakka A. Biodegradation of lignin /In: Biopolymers. Lignin, humic substances and coal. Wiley-VCH, Weinheim, Germany. 2001. V.1: P.129-180.
Hofrichter M. Review: lignin conversion by manganese peroxidase (MnP) //Enzyme Microb. Technol. 2002. V.30. P. 454–466.
Лисов А.В. Гибридная Mn-пероксидаза гриба Panus Tigrinus 8/18 //Дис. ... канд. биол. наук: 03.00.04 : Пущино, 2005 95 c. РГБ ОД, 61:05-3/1341.
Айзенштадт М.А., Боголицын К.Г. Пероксидазное окисление лигнина и его модельных соединений //Химия растительного сырья. 2009. №2. С. 5–18.
Camarero S., Sarcar S., Ruiz-Duenas F. J., Martinez M. J., Martinez A. T. Description of a versatile peroxidase involved in the natural degradation of lignin that has both manganese peroxidase and lignin peroxidase substrate interaction sites //J. Biol. Chem. 1999. V.274. №15. P.10324-10330.
Лисов А.В., Леонтьевский А.А., Головлёва Л.А. Гибридные Mn-пероксидазы базидиомицетов (обзор) //Прикладная биохимия и микробиология. 2007. Т.43. №5. С.598-606
Petersen, R.H., Krisai-Greilhuber, I. Type specimen studies in Pleurotus. //Persoonia 1999. 17, 201–219
Fengel von D. und G. Wegener. Wood: Chemisry, Ultrastructure, Reactions. Berlin-New York: Walter de Gruyter 1984., 613 S.
Airth, R.L., and McElroy, W.D. Light emission from extracts of luminous fungi. //J.Bacteriol 1959. 77: 249–250.
Endo M., M. Kajiwara and K. Nakanishi. Fluorescent constituents and cultivation of Lampteromyces japonicus, //Chem. Commun., 1970, 309.
O’Kane D.J., Lingle W.L., Porter D., Wampler J.E. Spectral analysis of the bioluminescence of Panellus stypticus. //Mycologia. 1990. V. 82. P. 607-616.
Oliveira A.G. and Stevani C.V. The enzymatic nature of fungal bioluminescence //Photochem. Photobiol. Sci., 2009, 8, 1416 – 1421.
Decker H., Terwilliger N. Cops and robbers: putative evolution of copper oxygen-binding proteins. //J. Exp. Biol. 2000. V. 203. P. 1777-1782.
Stom D.I., Geel T.A., Balayan A.E., Shachova G.I., Kuznetsov A.M., Medvedeva S.E. Bioluminescent method in studying the complex effect of sewage components. //Arch. Environ. Contam. Toxicol. 1992. V.22. P.203-208.
Родичева Э.К., Кузнецов А.М., Медведева С.Е., Биолюминесцентные биотесты на основе светящихся бактерий для экологического мониторинга. //Вестник ОГУ, 2004. Т.5: C. 96-100.
Родичева Э.К., Выдрякова Г.А., Медведева С.Е. Каталог культур светящихся бактерий. Новосибирск: Наука. 1997. 125 стp.
Патент WO/2004/076685
http://bl.ibp.ru
|
