Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»
Скачать 1.33 Mb.
|
| МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. Х.М.БЕРБЕКОВА» (КБГУ) УДК 61 № госрегистрации 01201064882 Инв. № УТВЕРЖДАЮ Ректор, д.т.н., профессор Карамурзов Б.С. « » 2012 г. ОТЧЕТ О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы по теме: «Разработка методов комплексной терапии с подключением препаратов антиоксидантов» (промежуточный, этап № 4) Наименование этапа: «Экспериментальные исследования факторов персистенции стафилококков. Клинико-лабораторные исследования препаратов с непрямым антибактериальным действием»
Нальчик 2012 список исполнителей
30.05.2012 СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ АОА – антиоксидантная активность плазмы ПЦР – полимеразно-цепная реакция ХЛ – хемилюминесценция CYP – цитохром р450 GST – глутатион-S-трансфераза NOS – нитратсинтаза eNOS – эндотелиальная нитратсинтаза PCR – polymerase reaction Реферат Отчет 81 с., 8 рис., 2 схемы, 33 табл., 42 источника. СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ, ИММУНОЦИТОКИНЫ, АНТИОКСИДАНТЫ, ФАГОЦИТАРНАЯ АКТИВНОСТЬ, БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ. Цель работы на 4 этапе – разработка методов комплексной терапии с подключением препаратов-антиоксидантов. При оценке свободно-радикального статуса больных различными формами стафилококковой инфекции нами на 1–3 этапах был обнаружен дефицит антиоксидантной мощности организма, более выраженный при тяжелых гнойно-воспалительных процессах. Для восстановления уровня антиоксидантов применили препарат – «комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот» (препарат «Иммуджен»), состоящий из высокоактивных субстанций – метионина, селена, витамина Е и коэнзима Q. На основе знаний о составе комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот и действии его отдельных компонентов на многие патологические состояния было решено исследовать его влияние на свободно-радикальный статус фагоцитов больных стафилококковой инфекций с наиболее выраженным дефицитом антиоксидантных показателей, предварительно изучив его влияние в биологическом эксперименте. Препарат «Иммуджен» был протестирован в опытах in vitro и биологическом эксперименте, где было показано, что «комплекс» уменьшает токсическую, и, в частности, гепатотоксическую нагрузку на организм. Проведено клинико-лабораторное исследование эффективности комплексной терапии с подключением препарата «Иммуджен» пациентов с распространенными флегмонами. Так как изученные ранее препараты (иммуноцитокины, фитопрепарат, угнетающий каталазу, антиоксидантный комплекс) воздействуют на разные звенья патогенеза, в дальнейшем была изучена клиническо-лабораторная эффективность их сочетанного воздействия (в дополнение к стандартной терапии). Генетическое исследование влияния полиморфизма генов ферментов, участвующих в регуляции свободно-радикального статуса, позволили установить, что баланс активации/инактивации радикалов складывается из соотношения активностей реакций образования и инактивации радикалов(CYP1A1, GSTT1, GSTM1, GSTP1) и может влиять на степень риска развития осложнений. В целом, полученные нами результаты исследования полиморфизма генов ферментов биотрансформации у больных с септическими процессами свидетельствуют об общности некоторых аспектов, а также о том, что свойства факторов риска проявляют: патологический аллель CYP1А1*4, нулевые генотипы GSTT1 и GSTM1, функционально неполноценные аллели eNOS – C774T, G894T. Основные выводы по второму этапу работ следующие:
СОДЕРЖАНИЕ
Введение Проблема лечения местных и генерализованных форм гнойной инфекции остается актуальной и во многом нерешенной. Сохраняется тенденция к увеличению числа больных с тяжелой гнойно-септической патологией, что объясняется как снижением иммунореактивности [1, 2], так и селекцией резистентных микробов 3, 4, 5, 6, 7. На нынешнем этапе развития медицины основные методы лечения инфекционных заболеваний, в том числе и стафилококковой этиологии, сводятся к антибактериальной и дезинтоксикационной терапии [8, 9, 10]. При этом не учитываются причины и следствия развивающихся тонких метаболических процессов, в том числе состояние прооксидантной и антиоксидантной систем, и их влияние на течение заболевания. Значительный прогресс в изучении клеточных и молекулярных основ взаимодействия «инфекционный агент – иммунная система» позволил существенно изменить представления о патогенезе многих заболеваний. Нейтрофилы, моноциты, макрофаги ответственны за неспецифическую резистентность организма, что определяется их способностью к поглощению и обезвреживанию микроорганизмов. Механизмы антимикробной активности фагоцитов опосредуются двумя путями. Первый – кислороднезависимый механизм – обусловлен действием на бактериальную клетку лизосомальных ферментов: лизоцима, катионных белков, лактоферрина и др. [11]. Основой другого механизма, ответственного за деструкцию бактерий, является способность фагоцитов продуцировать свободные радикалы. Радикалы, возникающие в организме человека, действуют как на молекулярном, так и на клеточном уровнях и являются основными бактерицидными агентами фагоцитов [11]. Однако если радикалы образуются длительно, в большом количестве и при истощении защитных антиоксидантных систем макроорганизма, они могут начать цепь нежелательных реакций, приводящих к повреждению собственных органов и тканей [12]. Исследование свободно-радикального статуса фагоцитов при бактериальной, и, в частности, стафилококковой инфекции имеет особое значение, так как закладывает основу для проведения грамотной патогенетически обоснованной терапии. Кроме того, определение оксидантного статуса организма необходимо проводить в динамике инфекционного процесса, так как полученные в разные периоды заболевания данные являются основанием для прогноза течения и характера патологического процесса и важны при назначении некоторых фармакологических препаратов. Например, применение некоторых иммуностимуляторов (пирогенал, продигиозан) нежелательно при повышенном оксидантном потенциале и может как привести к обострению аллергических заболеваний, так и послужить запуском аутоиммунных расстройств [13]. Целью исследования на 4 этапе была разработка методов комплексной терапии с подключением препаратов-антиоксидантов. Глава 1 Изучение влияния отдельных антиоксидантных веществ (лецитин, убихион, витамин Е) и комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот на образование кислородных радикалов лейкоцитами периферической крови доноров Изучение влияния препарата Immugen на образование кислородных радикалов лейкоцитами периферической крови человека Лейкоциты периферической крови человека выделяли по стандартной методике, основанной на центрифугировании на градиенте плотности фиколл-верографина 1.119 при 400 g. Препарат Immugen (0.5–1.0 мг/мл) добавляли к изолированным лейкоцитам непосредственно перед активацией ФМА. Для сравнения влияния отдельных составляющих препарата Immugen на образование свободных радикалов лейкоцитами компоненты (лецитин, убихинон, витамин Е, метионин) также добавляли к изолированным лейкоцитам непосредственно перед активацией ФМА. Хемилюминесцентный анализ проводили с использованием хемилюминометра LKB (Швеция) в стандартных условиях (см. ниже) при активации ФМА (10–5 М). Для оценки генерации супероксидного радикала клетками перитонеального экссудата использовали спектрофотометрический метод, основанный на восстановлении цитохрома с (см. ниже). Определение радикалобразующей способности нейтрофилов Измерение хемилюминесценции (ХЛ) Для изучения продукции активных кислородных метаболитов традиционно используется хемилюминесцентный анализ. Измерение хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов производили на хемилюминометре ПХЛ-1, а также на LKB Luminometer (model 1251, Sweden) в термостатированных при 37 С стеклянных кюветах при постоянном перемешивании. Образец содержал 5х105 клеток в 1 мл раствора Хенкса, 2х10–5 люминола (или люцигенина). В качестве показателя степени активации фагоцитов принимали изменение амплитуды ХЛ ответа (I отн. ед.). Индекс предстимуляции иммуноцитокинами рассчитывали как отношение амплитуд ХЛ ответов стимулированных и контрольных клеток. Измерение продукции супероксидрадикала нейтрофилами Для измерения концентрации супероксидрадикала, генерируемого нейтрофилами, использовали метод, основанный на реакции восстановления супероксидом цитохрома с. В работе исследовали спонтанную и индуцированную продукцию супероксидрадикала. В инкубационную смесь объемом 1 мл, содержащую 100 мкл суспензии нейтрофилов (106/мл) в растворе Хенкса (рН 7.4) и 50 мкл цитохрома с (12.5 мг/мл), добавляли 10 мкл ФМА (10–6М). Спонтанную продукцию супероксидного радикала измеряли путем добавления 10мкл диметилсульфоксида (99 %) вместо ФМА. Для выяснения вклада в реакцию восстановления цитохрома с именно супероксидного радикала в реакционную смесь добавляли 10 мкл Cu-Zn-СОД (0.5 мг/мл). Приготовленные таким образом пробы инкубировали при периодическом перемешивании в течение 1 часа при 37 С. Затем суспензии центрифугировали 10 минут при 400 g, после чего измеряли оптическое поглощение супернатанта при 550 нм (А550) и выражали в нМ/мин, с учетом показателя экстинкции восстановления цитохрома с (ε = 21мМ–1 см–1). Поскольку в состав изучаемого комплекса входят такие антиоксиданты как убихинон и витамин Е, было изучено его влияние на образование кислородных радикалов лейкоцитами периферической крови человека и процессы перекисного окисления липидов в системе in vitro. Добавление комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот к изолированным лейкоцитам или цельной крови непосредственно перед активацией ФМА (10–5М) приводило к снижению ХЛ ответа на активатор (С50 = 0,2 мг/мл). Однако при инкубации цельной крови с препаратом (0,5–1,0 мг/мл) в течение 4 часов при 37 С этот эффект исчезал и величина ХЛ ответа полностью восстанавливалась. Сравнение отдельных компонентов комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот по способности ингибировать образование свободных радикалов in vitro показало, что максимальным эффектом обладают убихинон и витамин Е (табл. 1), тогда как метионин, напротив усиливал ХЛ ответ лейкоцитов, активированных ФМА. Таблица 1 – Концентрации 50 %-ингибирования ХЛ и восстановления цитохрома с лейкоцитами in vitro для комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот и его компонентов (мг/мл)
 Рисунок 1 – Концентрации 50 %-ингибирования люминольной ХЛ лейкоцитами in vitro комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот и его компонентов, (мг/мл) Исследование влияния препарата на железо-индуцированное окисление желточных липопротеидов показало, что он обладает антиоксидантным действием (С50 = 4мг/мл). Таким образом, на основании исследованных свойств комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот in vitro можно предположить, что препарат выступает как ингибитор свободно-радикальных процессов. Глава 2 Изучение биологического действия комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот при асептическом перитоните у крыс:
При различных инфекционных заболеваниях необходимо подключение к комплексной терапии препаратов антиоксидантов [13]. Широкий спектр терапевтического действия, низкая токсичность, высокая эффективность делают препараты-антиоксиданты перспективными в качестве лекарств-протекторов патологических процессов, протекающих при участии свободных радикалов. Однако одним из существенных недостатков этой группы препаратов остается невозможность их использования в острый период заболевания, так как под действием антиоксидантов уменьшается необходимый в эту стадию антимикробный эффект свободных радикалов. Для оптимизации терапевтического действия препаратов необходимо учитывать свободно-радикальный статус больного в динамике, стадию заболевания и индивидуально подбирать вид и концентрацию лечебного препарата. В связи с этим активно продолжается поиск комбинаций антиоксидантных составляющих и аминокислот, обладающих комплексом свойств, позволяющих применять препарат в острой стадии заболевания. Целью исследования было изучение действия комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот (в состав входят убихинон, фосфолипиды сои, токоферол, селен и метионин) в биологическом эксперименте путем интраперитонеального введения пептона. Эксперимент выполнялся на 40 беспородных крысах, которые были разбиты на 4 группы: 10 животным интраперитонеально вводили 20 мл стерильного физиологического раствора (группа «Контроль»); 10 животным интраперитонеально вводили 20 мл стерильного 2 % раствора пептона для индукции асептического воспаления на фоне реакции на чужеродный белок (группа «Пептон»); 10 животным интраперитонеально вводили стерильный физиологический раствор на фоне перорального введения комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот (в состав входят убихинон, фосфолипиды сои, токоферол, селен и метионин), разведенного подсолнечным маслом (25 мг/мл), при этом пероральное введение было начато за 7 дней до введения физиологического раствора (группа «Контроль+Комплекс»); 10 животным интраперитонеально вводили 20 мл стерильного 2 % раствора пептона на фоне перорального введения антиоксидантного комплекса (группа «Пептон+Комплекс»). Эритроциты получали из гепаринизированной крови, клетки перитонеального экссудата выделяли после введения в брюшную полость 20 мл раствора Хенкса. Клеточный состав оценивали с помощью мазков, окрашенных по Романовскому – Гимзе, анализ фагоцитарной активности проводили по стандартной методике с использованием зимозана («Sigma», USA). Оценивали активность аланин аминотрансферазы (АЛТ) и аспартат аминотрансферазы (АСТ) в сыворотке с использованием биохимического анализатора ASCA (США), активность глутатион-S-трансферазы (GST) эритроцитов по восстановлению 1-хлор-2,4-динитробензола (CDNB), активность супероксиддисмутазы (СОД) клеток перитонеального экссудата и эритроцитов по способности клеточных лизатов ингибировать аутоокисление адреналина. Антиоксилительную активность препарата определяли по методу Клебанова Г.И. и др. Статистическая обработка полученных данных проводилась с применением пакета прикладных программ Statistica 6.0 (StatSoft, USA). Достоверность различий этих показателей определялась параметрическим критерием Стьюдента. Действие комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот исследовали в биологическом эксперименте путем интраперитонеального введения пептона. О развитии воспалительной реакции в брюшной полости судили по увеличению выхода клеток перитонеального экссудата на 2 сутки. К этому сроку острая нейтрофильная реакция уже завершается, о чем свидетельствует близкое к контрольным значениям содержание полиморфноядерных лейкоцитов в экссудате (табл. 2). Введение пептона интраперитонеально вызывало у крыс гепатотоксическую реакцию – повышение уровня активности АСТ и АЛТ в сыворотке, особенно на 7 сутки и GST в эритроцитах (табл. 2). Как видно из приведеных в табл. 2 данных, «комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот» существенно снижал интоксикацию, вызванную введением чужеродного белка (об этом свидетельствует снижение уровня АСТ и АЛТ, особенно на 7 сутки, в группе «Пептон+Комплекс» по сравнению с группой «Пептон») (p<0,05). Кроме того, препарат, увеличивая уровень активности GST на 2 сутки по сравнению с группой «Пептон», практически нормализует его к 7 суткам. Следует также отметить резкое падение уровня активности СОД эритроцитов, ведущее к дисбалансу окислительно-восстановительных процессов, которое происходит на 7 сутки. Препарат, состоящий из антиоксидантных витаминов и аминокислот, полностью предотвращает это падение (табл. 3). Таким образом, комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот уменьшает токсическую и, в частности, гепатотоксическую нагрузку на организм. С другой стороны, препарат не снижает выход клеток в очаг воспаления (табл. 2) и не влияет на содержание полиморфноядерных лейкоцитов и фагоцитирующих клеток в очаге. Влияние препарата на клеточную популяцию в этом случае проявляется в восстановлении способности к дыхательному взрыву (7 сутки, группа «Пептон+Комплекс»). При этом препарат восстанавливает до нормальных значений уровень СОД-активности клеток перитонеального экссудата, тогда как в группе «Пептон» эти значения ниже контрольных. Следует также отметить и тенденцию к повышению индекса фагоцитоза в группах животных, принимавших комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот (как на фоне перитонита, так и в контрольных группах) (табл. 3). Таблица 2 – Влияние комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот на свойства клеток перитонеального экссудата
– – нет данных * – р<0,05 относительно экспериментальной группы без комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот ** – р<0,01 относительно экспериментальной группы без комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот Таблица 3 – Влияние комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот на некоторые показатели крови экспериментальных животных
– – нет данных * – р<0,05 относительно экспериментальной группы без комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот ** – р<0,01 относительно экспериментальной группы без комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот Вывод: при пероральном применении комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот, состоящий из убихинона, фосфолипидов сои, токоферола, селена и метионина, уменьшает общую интоксикацию организма. Он также действует как регулятор свободно-радикальных процессов в организме, восстанавливая уровень активности СОД макрофагов и эритроцитов и способность фагоцитов к осуществлению дыхательного взрыва. Глава 3 Клинико-лабораторное исследование влияния выбранных препаратов антиоксидантов на эффективность терапии больных с инфекционными заболеваниями стафилококковой этиологии В качестве объекта исследования была выбрана группа пациентов с одонтогенными флегмонами, в составе микстфлоры раневого отделяемого в 100 % случаев высевался S.aureus. Для исследования эффективности лечения комплексом антиоксидантных витаминов и аминокислот «Иммуджен» («IDI FARMACEUTICI S.p.A.», Италия, Via dei Castelli Romani, 83/85 00040 Pomezia), регистрационное удостоверение № 002279.И.380.12.2000) дополнительно к описанным больным под нашим наблюдением находились 2 группы больных (табл. 4): Таблица 4 – Распределение групп больных, участвующих в клиническом эксперименте по изучению эффективности терапии препаратом «Иммуджен», по полу и возрасту
Способ применения препарата. «Иммуджен» больные принимали внутрь во время еды 2 раза в сутки в течение недели совместно с традиционной терапией. Контрольную группу составили 30 доноров (описание выше). Клинические методы оценки эффективности действия препарата на течение раневого процесса. Клинически у больных групп «Иммуджен» и «Плацебо Иммуджен» оценка течения раневого процесса производилась по следующим критериям: размеры и динамика изменения инфильтрата по дням, сроки гноетечения, выраженность отека, экссудации, время появления грануляций. Для оценки размеров инфильтрата определяли его площадь: проекцию инфильтрата рассматривали как круг или эллипс и рассчитывали по формулам –S = πR2 и S = πab, где R – радиус круга, a и b – большая и малая полуоси эллипса соответственно. Данные выражали в см2. В клинической оценке состояния больного также учитывали общие симптомы интоксикации, температурную реакцию и субъективные ощущения больного, такие, как выраженность болевого синдрома, общее самочувствие (см. пример карты). Клиническую эффективность терапии оценивали в 3-балльной системе по выраженности симптомов активности воспалительного процесса в мягких тканях (табл. 5). Эффект препаратов считался выраженным при купировании признаков локального воспаления в мягких тканях до 4–5 баллов, умеренным – до 6 баллов, отсутствующим – до 7–8 баллов. Таблица 5 – Оценка выраженности воспалительного процесса в мягких тканях (в баллах)
Пример используемой карты при клиническом испытании действия препаратов на течение раневого процесса | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |  | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Санкт-петербургский государственный электротехнический университет «лэти» им. В. И. Ульянова (ленина) |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... «Разработка новых методов индивидуальной коррекции сводно-радикального статуса при бактериальных инфекциях» |
