Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России»
Скачать 1.33 Mb.
|
* – размеры инфильтрата: незначительные – < 20 cм2;умеренные – 21–50 см2–; значительные – >51 см2Показатели ранозаживления
Лабораторные методы исследования
Лабораторные методы исследования Выделение нейтрофилов из периферической крови человека. Для выделения нейтрофилов использовали венозную кровь, взятую утром натощак путем пункции локтевой вены больных и доноров в строго асептических условиях. Кровь собирали в стерильные силиконизированные пробирки, содержащие 1.0 мл антикоагулянта – раствора гепарина (Richter, Венгрия) (25 единиц на 1.0 мл крови). Количество используемой крови на одно исследование составляло от 5 до 10 мл. Нейтрофилы выделяли по стандартной методике на двойном градиенте плотности. Для этого в силиконизированные пробирки поэтапно наслаивали равные объемы растворов фиколл-верографина (удельная плотность 1,199 гр/см3 и 1,080 гр/см3) и периферическую кровь. Затем пробирки центрифугировали в течение 40 минут при 800 g в центрифуге с горизонтальным ротором. После центрифугирования нейтрофилы концентрировались в интерфазном кольце. Взвесь нейтрофилов переносили в силиконизированные пробирки и дважды отмывали раствором Хенкса (рН 7,4). Режим центрифугирования – 10 минут при 400 g. Подсчитывали и доводили до рабочей концентрации (см. ниже). Выделение лейкоцитов из периферической крови человека. Для выделения лейкоцитов использовали венозную кровь, взятую, как описано выше. Количество используемой крови на одно исследование также составляло от 5 до 10 мл. Кровь наслаивали на равный объем градиента плотности фиколл-верографина (удельная плотность 1,199 гр/см3) и центрифугировали 40 минут при 400 g. Взвесь лейкоцитов концентрировалась в интерфазном кольце. Клетки собирали в силиконизированную пробирку и дважды отмывали путем центрифугирования (10 минут, 400 g), подсчитывали и доводили до рабочей концентрации (см. ниже). Выделение плазмы крови. Для выделения плазмы использовали периферическую венозную кровь, взятую утром натощак в асептических условиях путем пункции локтевой вены. Кровь собирали в стерильные силиконизированные пробирки, содержащие 1,0 мл антикоагулянта – раствора гепарина (Richter, Венгрия) (25 единиц на 1,0 мл крови). Немедленно перемешивали с антикоагулянтом, не допуская образования воздушных пузырей. Для приготовления плазмы стабилизированную кровь центрифугировали 5–7 минут при 400 g и собирали супернатант. Определение радикалобразующей способности нейтрофилов Измерение хемилюминесценции (ХЛ). Для изучения продукции активных кислородных метаболитов традиционно используется хемилюминесцентный анализ. Измерение хемилюминесценции (ХЛ) нейтрофилов производили на хемилюминометре ПХЛ-1, а также на LKB Luminometer (model 1251, Sweden) в термостатированных при 37 С стеклянных кюветах при постоянном перемешивании. Образец содержал 5х105 клеток в 1 мл раствора Хенкса, 2х10–5 люминола (или люцигенина). В качестве показателя степени активации фагоцитов принимали изменение амплитуды ХЛ ответа (I отн. ед.). Индекс предстимуляции иммуноцитокинами рассчитывали как отношение амплитуд ХЛ ответов стимулированных и контрольных клеток. Измерение продукции супероксидрадикала нейтрофилами. Для измерения концентрации супероксидрадикала, генерируемого нейтрофилами, использовали метод, основанный на реакции восстановления супероксидом цитохрома с. В работе исследовали спонтанную и индуцированную продукцию супероксидрадикала. В инкубационную смесь объемом 1 мл и содержащую 100 мкл суспензии нейтрофилов (106/мл) в растворе Хенкса (рН 7,4) и 50 мкл цитохрома с (12,5 мг/мл), добавляли 10 мкл форболмиристатацетата (ФМА) (10–6М). Спонтанную продукцию супероксидного радикала измеряли путем добавления 10 мкл диметилсульфоксида (99 %) вместо ФМА. Для выяснения вклада в реакцию восстановления цитохрома с именно супероксидного радикала в реакционную смесь добавляли 10 мкл Cu-Zn-СОД (0,5 мг/мл). Приготовленные таким образом пробы инкубировали при периодическом перемешивании в течение 1 часа при 37 С. Затем суспензии центрифугировали 10 минут при 400 g, после чего измеряли оптическое поглощение супернатанта при 550 нм (А550) и выражали в нМ/мин с учетом показателя экстинкции восстановления цитохрома с (ε = 21 мМ–1 см–1). Флюоресцентный метод измерения внутриклеточной продукции активных метаболитов кислорода. Внутриклеточную генерацию радикалов исследовали с помощью флуоресцентного красителя гидроэтидина [11]. Гидроэтидин был любезно предоставлен В.И. Алексеевой (НИИ органических полупродуктов и красителей). Матричные растворы флюорохрома были приготовлены в диметилформамиде и хранились при –18 С. Нейтрофилы инкубировали в растворе Хенкса (без фенолового красного, pH 7,4) 15 минут с 10–4 М гидроэтидина, отмывали центрифугированием (5 минут при 800 g и +4 C) в избытке раствора Хенкса и окончательно ресуспендировали до концентрации 106 кл/мл. После этого клетки стимулировали форболмиристатацетатом (ФМА) 10–5 М. Образование этидиума из гидроэтидина в клетках регистрировали, измеряя интенсивность флуоресценции этидиума при длинах волн возб. = 473 нм, исп. = 610 нм на спектрофлуориметре MPF-44 (Perkin-Elmer) в сантиметровых кварцевых кюветах, термостатированных при 37 С и постоянном перемешивании. Для расчета изменения генерации АФК под действием изучаемых препаратов был введен параметр F:  где I0 – интенсивность люминесценции этидиума в опыте; Ik – интенсивность люминесценции этидиума в контроле. Определение концентрации нитратов-нитритов в плазме крови больных и здоровых доноров. Общую концентрацию нитратов и нитритов в плазме крови больных и здоровых доноров (мкМ) определяли спектрофотометрически с использованием реактива Гриса (Nitrate/Nitrite Colorimetric Assay Kit) (Cayman, USA). Для этого в каждую пробу добавляли разбавленную в два раза буфером (Аssay buffer) плазму крови, 10 мкл энзимного кофактора и 10 мкл нитрат-редуктазы. Инкубировали 1 час при комнатной температуре, вносили 50 мкл реактива Гриса R1 и 50 мкл реактива Гриса R2. Инкубировали 10 минут при комнатной температуре, измеряли оптическую плотность при 540 нм. Методы определения антиоксидантной активности плазмы крови Антиоксидантную активность (АОА) плазмы крови определяли по методике Г. Клебанова. Для этого 100 мкл желточной суспензии добавляли к 100 мкл плазмы и 100 мкл FeSO4, доводя общий объем пробы до 1 мл. Смесь инкубировали 30 минут при комнатной температуре. Затем в пробирку вносили 0,5 мл 20 % трихлоруксусной кислоты и 0,1 мл 10–2 М раствора ионола в спирте. Пробы центрифугировали 10 минут при 1500 g и отбирали супернатант. К 0,7 мл супернатанта добавляют 0,6 мл 0.5 % тиобарбитуровой кислоты и греют на водяной бане при 100 С 30 минут, после чего измеряют светопоглощение при А532. Антиоксидантную активность выражают в виде процента от контроля (проба без плазмы):  где Аопыт – опытная проба; Аопыт спонт. – опытная проба без FeSO4; Аконтроль – контрольная проба; Аконтроль спонт. – контрольная проба без FeSO4. Определение фагоцитарной активности нейтрофилов больных и здоровых доноров Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали стандартным методом в отношении бактерий Staphylococcus aureus, выделенных у каждого больного. Для этого смешивали 1 мл суспензии нейтрофилов и 1 мл взвеси бактерий (107 кл) в растворе Хенкса (рН 7,4). Смесь инкубировали при помешивании 30 мин при 37 С. Приготавливали мазки на стекле, фиксировали и окрашивали по Романовскому – Гимзе. В мазках на 100 клеток подсчитывали количество фагоцитирующих макрофагов. Полученные данные выражали в виде фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа. Определение эффективности внутриклеточного киллинга нейтрофилами бактерий. Оценку эффективности внутриклеточного киллинга оценивали по методу Nilsen 14. После постановки фагоцитарной реакции (см. выше) взвесь центрифугировали 10 минут при 1500 g, отбирали осадок, добавляли трехкратный объем Н2О и производили высев по методу Гольда на чашку Петри с мясо-пептонным агаром. Число выживших после фагоцитоза бактерий определяли по количеству колоний в секторах через 24 часа. Статистическая обработка полученных результатов. При математической обработке результатов исследований были использованы следующие методы: расчет средних значений и доверительный интервал, рассчитанные по данным n измерений. Доверительный интервал оценивали с использованием критерия Стъюдента. Статистическую обработку и расчет корреляционного коэффициента (коэффициент корреляции Спирмена) проводили с использованием программы Microsoft Excel. Клинико-лабораторное исследование эффективности терапии препаратом «Иммуджен» больных одонтогенными флегмонами Для оценки эффективности применения в комплексной терапии больных с одонтогенными околочелюстными флегмонами комплекса антиоксидантных витаминов и аминокислот «Иммуджен» наблюдали две дополнительные группы больных: «Иммуджен» (в дополнение к традиционной терапии принимали по 2 капсулы 2 раза в день в течение семи дней) и «Плацебо Иммуджен» (получали традиционную терапию). Группы были сопоставлены по полу, возрасту и сопутствующим заболеваниям. Больные групп «Иммуджен» и «Плацебо Иммуджен» поступали в стационар с одонтогенными околочелюстными флегмонами в экстренном порядке. Давность заболевания у больных с момента появления первых клинических признаков (небольшая припухлость, боль при дотрагивании, нарушение функций) составляла 2–5 суток. При поступлении в стационар болевой синдром интенсивный – у 86,6 %, умеренный – у 20 %, при пальпации боли усиливались. Температурная реакция у 93,3 % – 37,1–38,0 С. У 66,6 % отмечены выраженные симптомы интоксикации (общая слабость, недомогание, головная боль, озноб, тошнота). Степень нарушения глотания, жевания, открывания рта зависела от локализации воспалительного процесса. Одонтогенная околочелюстная флегмона в исследуемых группах пациентов распространялась на три и более клетчаточных пространства. Местно определялся болезненный инфильтрат с довольно четкими границами и умеренно выраженным перифокальным отеком, как правило, отчетливо определялся симптом флуктуации. После вскрытия гнойного очага и в первые сутки из раны выделялось умеренное количество гноя в 80 % и обильное гноетечение в 20 %. Местные деструктивные изменения были выражены незначительно (табл. 6). При оценке параметров радикалообразования достоверных изменений ХЛ не выявлено (p>0,01) (табл. 6). Отсутствие повышения генерации АФК не приводит к значимым изменениям фагоцитарной функции (табл. 7). Но комплексная терапия с применением препарата «Иммуджен» компенсирует выявленный ранее спад антиоксидантной емкости плазмы крови (табл. 6). Клиническую эффективность комплексной терапии с использованием препарата «Иммуджен» оценивали в трехбалльной системе. Эффект считали выраженным при купировании признаков воспаления до 3–4 баллов, умеренным – до 6 баллов, отсутствующим – до 7–8 баллов. Таблица 6 – Интенсивность хемилюминесценции (ХЛ) и антиоксидантная активность плазмы крови пациентов с одонтогенными флегмонами в динамике заболевания на фоне комплексной терапии
1 – p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2 – p<0,01 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки) 3 – p<0,01 – относительно показателей группы сравнения Таблица 7 – Фагоцитарная активность лейкоцитов больных с одонтогенными флегмонами в динамике заболевания на фоне комплексной терапии
1 – p<0,01 – относительно показателей здоровых доноров 2 – p<0,01 – относительно показателей предыдущего периода измерения (сутки) 3 – p<0,01 – относительно показателей группы сравнения Результаты проведенных исследований показали, что при поступлении выраженность симптомов воспаления у пациентов группы «Иммуджен» составляла 11,0±0,5; у пациентов группы «Плацебо Иммуджен» 10,6±0,4 (рис. 2).  Рисунок 2 – Динамика клинической эффективности терапии препаратом «Иммуджен» больных с одонтогенными флегмонами трех и более клетчаточных пространств. По оси ординат – баллы, по оси абсцисс – сутки Ко 2–3 дню при терапии комплексом антиоксидантных витаминов и аминокислот Иммуджен совместно с антибактериальной и дезинтоксикационной терапией значительно уменьшилась выраженность гноетечения и отека. При этом в более ранние сроки появлялись признаки грануляции и эпителизации раны (табл. 8). У пациентов обеих групп была выявлена лабораторная картина воспалительного процесса: СОЭ – 25±5; количество лейкоцитов – 17,5±5,0; сдвиг лейкоцитарной формулы влево (табл. 9). Таблица 8 – Основные объективные симптомы больных с одонтогенными околочелюстными флегмонами в динамике инфекционного процесса (%)
Таблица 9 – Данные лабораторных показателей крови больных групп «Комплекс 2» и «Контроль 2» в динамике инфекционного процесса (х±m)
Отличий лабораторных показателей крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, уровень гемоглобина и др.) и мочи (белок, удельный вес) у пациентов групп сравнения при поступлении замечено не было. На 3–7 сутки признаки воспалительного процесса в группе «Иммуджен» выражены достоверно меньше (p<0,05): лейкоциты – 7,5±0,3 (в группе «Плацебо Иммуджен» – 9,5±0,8), СОЭ – 13 ±1 (в группе «Контроль 1» – 16±1), что дополняет клинические признаки эффективности комплексной терапии этим препаратом. Таким образом, комплекс антиоксидантных витаминов и аминокислот «Иммуджен» восстанавливает уровень активности антиоксидантной системы, не снижая при этом способности нейтрофилов к осуществлению дыхательного взрыва, и снижает общую интоксикацию организма. После курса лечения исследуемым препаратом в сочетании с традиционной антибактериальной и дезинтоксикационной терапией отличный результат был отмечен у 86,7 % пациентов и хороший результат – у 13,3 % пациентов. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |  | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... В рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Санкт-петербургский государственный электротехнический университет «лэти» им. В. И. Ульянова (ленина) |
| Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Отчет о научно-исследовательской работе в рамках федеральной целевой... «Разработка новых методов индивидуальной коррекции сводно-радикального статуса при бактериальных инфекциях» |
