Скачать 347.72 Kb.
|
СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИОННОЙ РАБОТЫМатериалы и методы исследования Получение дисперсии многослойных липосом аранозы Для получения дисперсии многослойных липосом с инкапсулированной аранозой использовали метод Бэнгхема. Компоненты липидного бислоя: яичный фосфатидилхолин (ФХ), холестерин (Хол), фосфатидилэтаноламин-полиэтиленгликоль-2000 (ФЭ-ПЭГ-2000) растворяли в хлороформе. Полученный раствор фильтровали под вакуумом через фильтр с размером пор 0,22 мкм, количественно переносили в стерильную круглодонную колбу и выпаривали на роторном испарителе BÜCHI Rotavapor R-200 при температуре выше температуры фазового перехода липидов (+37°С) и давлении 24 мм рт. ст. до получения тонкой липидной плёнки на стенках колбы. Для полного удаления хлороформа проводили досушивание под вакуумом в течение 60 мин. Полученную липидную плёнку гидратировали предварительно профильтрованным (через фильтр с диаметром пор 0,22 мкм) 2% раствором аранозы с добавлением сорбиновой кислоты при постоянном перемешивании. Предфильтрацию полученной дисперсии мультиламеллярных везикул проводили через фильтры с диаметром пор 0,4 мкм. Получение дисперсии однослойных липосом аранозы Измельчение небольших объёмов дисперсии (до 10 мл) проводилось на ручном мини экструдере Avanti Mini-Extruder последовательно через мембранные фильтры “Nuclepore” с диаметром пор 0,2 и 0,1 мкм. Однородные по размерам везикулы получали после 11 циклов экструзии. В процессе масштабирования технологии измельчение проводили на экструдере LIPEX последовательно через мембранные фильтры с размером пор 0,2 и 0,1 мкм и давлении инертного газа 1,5 атмосфер. Однородные по размерам везикулы получали после 9 циклов экструзии. Определение размера липосом На всех стадиях технологического процесса размер везикул определяли с использованием метода корреляционной спектроскопии светорассеяния на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer. Определение эффективности включения аранозы в липосомы Для отделения липосом от не включившейся в везикулы аранозы применяли метод гель-фильтрации на колонке С-16 «GE Healthcare» с использованием гель-сорбента Sephadex G-50. Контроль разделения фракций осуществляли с помощью проточного спектрофотометра Uvis-920. Количественное определение Содержание аранозы определяли методом спектрофотометрии в УФ-области на спектрофотометре Cary 100 Varian, Inс. при 240±2 нм. Изучение цитотоксической активности Для оценки роста опухолевых клеток и цитотоксической активности исследуемой ЛЛФ аранозы в опытах in vitro использован МТТ-тест. Опыт проводили на клеточных линиях опухолей человека: Mel Kor - метастатическая меланома и Jurkat – Т-клеточный лимфобластный лейкоз. Планшеты с клетками инкубировали в течение 72 часов. Измерения проводили на фотометрическом анализаторе иммуноферментных реакций «АИФР-01 Униплан». Определение противоопухолевого действия С целью сравнения противоопухолевого действия ЛЛФ аранозы с лиофилизатом свободной аранозы, провели исследование на мышах (самки гибриды первого поколения BDF1) с перевитыми опухолями лимфоцитарной лейкемии Р-388 и меланомы В-16 при различных путях введения. ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ Выбор состава липосомальной дисперсии аранозы Молярные соотношения липидных композиций липосом подбирали экспериментально с учётом воспроизводимости технологического процесса для получения стандартной и стабильной ЛЛФ аранозы. В качестве основного компонента, формирующего липидный бислой, использовали фосфатидилхолин. Холестерин приводит к увеличению жесткости мембраны липосом, уменьшает текучесть липидного бислоя, а так же увеличивает его упругость и механическую прочность. Таким образом, присутствие Хол способствует повышению стабильности структуры везикул. Для предотвращения захвата липосом в кровяном русле клетками ретикуло-эндотелиальной системы добавляли фосфатидилэтаноламин, конъюгированный с гидрофильным полимером – полиэтиленгликолем, что приводит к увеличению циркуляции липосом в кровяном русле. Для стабилизации аранозы при хранении оптимальное значение рН среды создавали добавлением сорбиновой кислоты. Молярные соотношения компонентов прописи подбирались экспериментально. Для выбора состава ЛЛФ аранозы в ходе исследований были наработаны модельные композиции, качество которых оценивали по ряду показателей, таких как размер липосом, стабильность, эффективность включения, фильтруемость через стерилизующие мембраны. Влияние состава и метода изготовления на размер липосом и эффективность включения аранозы В табл. 1 представлены результаты оценки качества моделей ЛЛФ аранозы по параметрам качества: размер везикул и эффективность включения аранозы. Многослойные липосомы всех модельных составов гомогенизировали путём экструзии через поликарбонатные фильтровальные мембраны. Как видно из табл. 1, состав №1 имел низкий процент включения ЛВ. В составах №2 и №5 наблюдали одинаково высокий процент включения аранозы, но в последнем из перечисленных был более крупный размер везикул и дисперсия значительно хуже экструдировалась. Вероятно, это связано с увеличенным содержанием ФХ, что не оказало положительного влияния на эффективность включения ЛВ. Составы №3 и №4 имели более низкий процент включения аранозы, чем состав №2, что связано с увеличением в прописи количества аранозы. Таблица 1 Изменение эффективности включения аранозы и размера липосом в зависимости от состава
Примечание: А – араноза. Таким образом, наилучшим по оцениваемым параметрам оказался состав № 2, в котором обеспечена высокая эффективность включения (81±2%) и оптимальный размер везикул равный 167±2 нм (Рис. 1). Рис. 1. Размер липосом аранозы (состав 2) В исследованиях показано, что введение альфа-токоферола в состав липосомального бислоя привело к резкому снижению стабильности дисперсии и эффективности включения аранозы. Сравнение эффективности измельчения липосомальной дисперсии методами измельчения ультразвуком, гомогенизации и экструзии на изучаемых моделях показало, что только экструзия позволяет получить гомогенные везикулы нужного размера и сохранить первоначальную эффективность включения аранозы (Табл. 2). Воздействие УЗ привело к незначительному уменьшению размера липосом и к резкому уменьшению эффективности включения ЛВ. Вместе с тем воздействие УЗ катализирует перекисное окисление ФХ, снижая качество липосомального препарата. При гомогенизации липосом на микрофлюидайзере также снижается эффективность включения аранозы. Таблица 2 Влияние способа измельчения на показатели качества липосом аранозы
В табл. 2 видно, что экструзия состава №2 позволила получить стабильные в ходе всего технологического процесса липосомальные дисперсии требуемого размера с высоким значением включения аранозы. Влияние экструзии и фильтрации на размер везикул и эффективность включения аранозы Эффективность включения аранозы и размер везикул до экструзии и фильтрации, а также после экструзии через фильтры с диаметром пор 0,45; 0,22, и 0,1мкм представлены в табл. 3. Таблица 3 Влияние экструзии и фильтрации на размер липосом и включение аранозы
Как видно из табл. 3, при получении однослойных липосом (после экструзии) из многослойных происходит уменьшение размера до оптимального и немного снижается включение аранозы. Выбор криопротектора для лиофилизации липосомальной дисперсии аранозы Основными параметрами качества, определяющими изменения в дисперсной системе, является размер везикул и эффективность включения ЛВ, которые определяли до и после лиофилизации. По изменению данных показателей делали вывод о влиянии криопротектора на стабильность липосом. Результаты влияния криопротекторов: сахарозы, лактозы и глюкозы на показатели качества липосом до и после лиофилизации представлены в табл. 4 и 5. Таблица 4 Влияние концентрации криопротектора на размер липосом
Как видно из представленных в табл. 4 результатов, криопротекторы сахароза и лактоза в концентрации 10% имеют преимущество перед глюкозой по размеру получаемых липосом во всём изученном диапазоне концентраций. Таблица 5 Влияние криопротектора на включение аранозы в липосомы
Из полученных в табл. 5 данных можно сделать следующий вывод: при сравнении показателей качества составов с лактозой и сахарозой, оптимальные значения размера везикул и эффективности включения наблюдали после лиофилизации липосомальной дисперсии аранозы с криопротектором – лактозой с концентрацией 10%. Таким образом, в результате проведённых исследований выбран состав липосомальной дисперсии аранозы с молярным соотношением ФХ:Хол:ФЭ-ПЭГ-2000:А равным 1:0,24:0,017:0,81, соответственно, содержащий сорбиновую кислоту в концентрации 0,08% и криопротектор лактозу в концентрации 10%. Состав ЛЛФ аранозы на 1 флакон представлен в табл. 6. |
Отчет об экспериментальном доклиническом изучении безопасности лекарственной... | Разработка лекарственных форм с флуконазолом для лечения кандидозов... О муниципальной целевой программе «Профилактика терроризма и экстремизма на территории Кировского района рсо-алания» | ||
Особенности состояния систем общего и специфического иммунитета у... Оторых лежат как специфические, так и неспецифические проявления лекарственной гиперчувствительности. Неспецифическое действие лекарственного... | «Анализ и стандартизация лекарственной формы с модифицированным высвобождением... Электронный вариант. Саратов, 2005. Патентное законодательство. Юридические акты и комментарий. М.: "Юрид литература", 1994. Справочник... | ||
Отчет об экспериментальном доклиническом изучении безопасности лекарственной... «Герпезал, мазь для местного и наружного применения 1 %» производства зао «интелфарм» | Темы реферата: 1 Роль лекарственной формы в современной фармакотерапии... ... | ||
Разработка методов получения сложных эфиров диоксановых спиртов из отходов производства изопрена ... | Особенности состояния систем общего и специфического иммунитета у... Среди многообразия побочного действия лекарственных препаратов на организм человека значительное место занимают реакции, в основе... | ||
Отчет о научно-исследовательской работе «Разработка технологической... «Разработка технологической схемы получения кормовых дрожжей из свекловичного жома» | Программа фундаментальных исследований Президиума ран №8 «разработка... «Разработка «безызносных» подшипников скольжения спутниковых антенн для работы в отсутствии смазки в открытом космосе» | ||
Методическая разработка практического занятия по теме: «лекарственная... Цель занятия: освоение навыков постановки диагноза и тактики ведения пациентов с лекарственной болезнью (целенаправленный сбор анамнеза,... | Отчет о научно-исследовательской работе на тему: «Разработка модифицированных... «Разработка модифицированных методов выделения гуминовых веществ для получения биологических препаратов на основе вермикомпоста» | ||
Методическая разработка урока по курсу: «технология. Технический труд» Место занятия в учебном процессе: раздел программы «Технология обработки металла» | Разработка методов получения и цифровой обработки рентгеновских изображений. | ||
Перечень электронных образовательных ресурсов, разработанных учителем... Увеличительные приборы. Строение светового микроскопа и правила работы с ним. Лабораторная работа «Приготовление препарата клеток... | Методическая разработка (в помощь студентам техникума) Собственность: сущность, основные формы. Особенности корпоративной формы собственности |