Методы биохимических исследований
Скачать 0.55 Mb.
|
| ТЕМА 3. Выделение, очистка и определение гомогенности белков. Указания к изучению темы. Индивидуальные белки различаются по своим физико-химическим свойствам: форме молекул, молекулярной массе, суммарному заряду молекулы, соотношению полярных и неполярных групп на поверхности молекулы белка, растворимости белков, а также степени устойчивости к воздействию денатурирующих агентов. Белки - высокомолекулярные соединения, однако сильно отличаются по молекулярной массе, которая колеблется от 6000 до 1 000 000 Д и выше. По форме молекул белки делят на глобулярные и фибриллярные. Суммарный заряд белковой молекулы зависит от соотношения ионизированных анионных радикалов Глу и Асп и катионных радикалов Лиз, Apr и Гис. Значение рН, при котором белок приобретает суммарный нулевой заряд, называют "изоэлектрическая точка" и обозначают как pI. В изоэлектрической точке количество положительно и отрицательно заряженных групп белка одинаково. Белки, имеющие суммарный положительный или отрицательный заряд, лучше растворимы, чем белки, находящиеся в изоэлектрической точке. Растворимость белков в воде зависит от всех перечисленных выше свойств белков: формы, молекулярной массы, величины заряда, соотношения полярных и неполярных функциональных групп на поверхности белка. Кроме этого, растворимость белка определяется составом растворителя, т.е. наличием в растворе других растворённых веществ. Для подробного исследования физико-химических и биологических свойств белков, а также для изучения их химического состава и структуры непременным условием является получение белков из природных источников в химически чистом, гомогенном состоянии. Получение индивидуальных белков из биологического материала (тканей, органов, клеточных культур) требует проведения последовательных операций, включающих: дробление биологического материала и разрушение клеточных мембран; фракционирование органелл, содержащих те или иные белки; экстракцию белков (перевод их в растворённое состояние); разделение смеси белков на индивидуальные белки. Белки весьма чувствительны к повышению температуры и действию многих химических реагентов. Поэтому обычные методы органической химии, применяемые для выделения того или иного вещества из смеси, неприемлемы для белков. Белки в этих условиях подвергаются денатурации, т.е.теряют существенные природные (нативные) свойства, в частности растворимость и биологическую активность. Биохимиками разработаны эффективные методы выделения белков в «мягких» условиях, при низкой температуре, с применением щадящих нативную структуру химических реагентов. Перед выделением белков из биологических объектов (органы и ткани животных, микроорганизмы, растения) исследуемый материал тщательно измельчают до гомогенного состояния. Для разрушения биологического материала используют метод попеременного замораживания и оттаивания, обработку клеток ультразвуком и метод «азотной бомбы», при котором клетки (в частности, микробные) сначала насыщают азотом под высоким давлением, затем резко сбрасывают давление – выделяющийся газообразный азот как бы разрывает «оболочку» клетки. Измельчение тканей обычно сочетают с одновременной экстракцией белков из гомогенатов тканей. Большинство белков тканей хорошо растворимо в 8–10% растворах солей. При выделении белков широко применяют различные буферные смеси с определенными значениями рН среды, органические растворители, а также неионные детергенты – вещества, разрушающие гидрофобные взаимодействия между белками и липидами и между белковыми молекулами. После разрушения ткани нерастворимые части осаждают центрифугированием. Центрифугирование гомогената с разной скоростью позволяет получить отдельные фракции, содержащие клеточные ядра, митохондрии и другие органеллы, а также надосадочную жидкость, в которой находятся растворимые белки. Нуклеиновые кислоты, липиды и другие небелковые вещества можно удалить из раствора, используя их особые физико-химические свойства. После получения растворов, содержащих смесь белков приступают к разделению – фракционированию смеси белков на индивидуальные белки. Для этого применяют разнообразные методы: высаливание, тепловую денатурацию, осаждение органическими растворителями, хроматографию, электрофорез, распределение в двухфазных системах, кристаллизацию. Применение в определенной последовательности ряда перечисленных методов позволяет получить белок в очищенном состоянии, содержащий, однако, некоторые низкомолекулярные примеси. Для полного освобождения белков от этих примесей используют методы диализа, гель-хроматографии, кристаллизации, ультрафильтрации. На заключительных стадиях выделения и очистки белков биохимиков интересует вопрос о гомогенности полученного белка. Нельзя оценивать гомогенность индивидуального белка только по одному какому-либо физико-химическому показателю. Для этого необходимо использовать разныме критерии. Наиболее достоверные результаты при определении гомогенности белка дают ультрацентрифугирование в градиенте плотности сахарозы или хлорида цезия, диск-электрофорез в полиакриламидном геле, изоэлектрическое фокусирование, иммунохимические методы и определение растворимости белка. Литература к теме 3:
Вопросы для самоконтроля.
ТЕМА 4. Общие принципы хроматографии, классификация методов хроматографии. Указания к изучению темы. Общие принципы хроматографии, разработанные в 1903 г. отечественным ученым М. С. Цветом, основаны на способности некоторых химических соединений специфически связываться с адсорбентом, заключенном в колонке. В результате происходит разделение анализируемых веществ и их концентрирование в строго определенном слое адсорбента. Затем через колонку пропускают подходящие растворители, которые ослабляют силы адсорбции и выносят с током раствора индивидуальные вещества. Последние последовательно собирают по фракциям. Колоночная хроматография с различными ионообменными смолами, производными целллюлозы и гидроксилапатитом в качестве носителей оказалась очень эффективным средством разделения белков из их смеси. При выделении и очистке белков используют четыре основных типа хроматографии: адсорбционную, распределительную, ионообменную и аффинную. В основе каждого из них лежат. Колоночная хроматография широко применяется не только для разделения белков, но и для разделения многих других веществ, входящих в состав живых организмов. Адсорбционная хроматография. Разделение компонентов смеси основано на их различной сорбируемости на твердом адсорбенте. В качестве сорбентов используют активированный древесный уголь, гель фосфата кальция, оксиды кремния или алюминия. Адсорбент в виде суспензии с растворителем вносят в стеклянную вертикальную колонку и равномерно в ней упаковывают. Образец в небольшом объеме растворителя наносят на колонку – составляющие части разделяемой смеси сорбируются на адсорбенте. Затем приступают к стадии десорбции компонентов из колонки, применяя подходящие элюенты. Сбор фракций осуществляют при помощи коллектора фракций. Распределительная хроматография. В этом случае твердая фаза служит только вместилищем для стационарной жидкой фазы. Часто распределительная хроматографии осуществляется на колонках, в которых в качестве стационарной фазы применяют влажный крахмал или силикагель. Образец растворяют в подходящем растворителе, затем наносят на колонку; разделяемые компоненты, подвергающиеся многократному распределению между неподвижной стационарной фазой и движущейся фазой растворителя, с разной скоростью перемещаются ко дну колонки.Собранные при помощи коллектора фракции пробы, содержащие одно и то же вещество, соединяют для его выделения в чистом виде. Разновидностью распределительной хроматографии является хроматография на бумаге, широко используемая в биохимических лабораториях для разделения пептидов, аминокислот и других веществ. В качестве стационарной фазы при этом служит вода, адсорбированная целлюлозными цепями бумаги. Ионообменная хроматография. Ионообменные смолы являются полимерными органическими соединениями, содержащими функциональные группы, способные вовлекаться в ионный обмен. Различают положительно заряженные анионообменники, представленные органическими основаниями и аминами, и отрицательно заряженные катионообменники, содержащие фенольные, сульфо- или карбоксильные группы. Из сильно- и слабоосновных анионообменников чаще используют производные полистирола и целлюлозы. Катионообменники представлены сульфонированными полистиролами (производными винилбензола или дивинилбензола) и карбоксиметилцеллюлозой. В зависимости от заряда разделяемых белков используют подходящую ионообменную смолу, с функциональными группами которой обменивается и задерживается на колонке часть белков, в то время как остальные белки беспрепятственно элюируются с колонки. Задержавшиеся на колонке белки снимают с нее, используя более концентрированные солевые растворы или изменяя рН элюента. Новейшие методы ионообменной хроматографии, в частности высокоэффективная жидкостная хроматография, широко используются в фармакологии, в клинической биохимии, в биотехнологических процессах и производствах: они позволяют определять вещества в нано- и пикограммных количествах. Аффинная хроматография (хроматография по сродству). Основана аффинная хроматография на принципе избирательного взаимодействия белков с иммобилизованными на носителе специфическими веществами –лигандами, которыми могут быть субстраты или коферменты, антигены (или антитела), гормоны или рецепторы. Благодаря высокой специфичности белков к иммобилизованному лиганду, связанному с наполнителем хроматографической колонки, присоединяется только один какой-либо белок из смеси белков. Снятие с колонки этого белка осуществляют элюированием буферными смесями с измененными рН или ионной силой, а также введением в состав элюента детергентов, ослабляющих связи между белками и лигандами. Несомненным достоинством метода является возможность в один прием выделить заданный белок или другой полимер с необходимой степенью чистоты. Литература к теме 4:
Вопросы для самоконтроля.
|
Похожие:
 | Задание Письменно (лаконично) дайте ответы на следующие вопросы:... Цикл: «Современные методы биохимических исследований в лабораторной диагностике» | | Программа по разработке нетрадиционных, энерго-информационных методов... Охватывает огромный материал и требует проведения глубоких физиологических и биохимических исследований, мы считает оправданным выделения... |
| Отчет о научно-исследовательской работе по Государственному контракту... Этап второй: «Выбор направлений исследований и этап предварительных исследований по мембранным коллоидным системам» | | М. Н. Лазарева, председатель цикловой методической комиссии Из опыта проведения студенческих конференций по дисциплине «основы биохимии с методами клинико-биохимических исследований» |
| Программа дисциплины Методология научных исследований в менеджменте:... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления подготовки 080200.... |  | Программа дисциплины Методология научных исследований в менеджменте:... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления подготовки 080200.... |
| Программа дисциплины Методология научных исследований в менеджменте:... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления подготовки 080200.... | | Программа дисциплины Методология научных исследований в менеджменте:... Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления подготовки 080200.... |
| Учебно-методический комплекс по дисциплине «Методология и методы... Дисциплина «Методология и методы психолого-педагогических исследований» представляет блок общепрофессиональных дисциплин Госстандарта.... | | Т. Ю. Денисова Методы научных исследований Денисова, Т. Ю. Методы научных исследований в связях с общественностью: учеб метод пособие / Т. Ю. Денисова; Сургут гос ун-т хмао-югры.... |
| Химия жизненных процессов «структура ↔ свойства ↔ биологические функции»; освоение и углубление знаний по вопросам единства, взаимозависимости и структурно-функциональной... | | Программа дисциплины «Методы научных исследований в менеджменте» Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления подготовки/ специальности... |
| Программа дисциплины «Методы научных исследований в менеджменте» Программа предназначена для преподавателей, ведущих данную дисциплину, учебных ассистентов и студентов направления подготовки/ специальности... | | Магистерская программа «Растениеводство» Цели и задачи дисциплины:... Целью освоения дисциплины «Инструментальные методы исследований» является овладение инструментальными методами исследования почвенного... |
| Рабочая программа дисциплины география поволжья Курс «География Поволжья» является логическим продолжением предшествующего модуля «Физическая география», некоторых разделов модуля... | | Примерная программа наименование дисциплины агрохимические методы исследований ... |
