Исследование полиморфизма генов ариламин n-ацетилтрансфераз и ассоциации полиморфных вариантов с раком легкого у европеоидов г. Новосибирска
Скачать 335.85 Kb.
|
На правах рукописи Никишина Марина Владимировна ИССЛЕДОВАНИЕ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ АРИЛАМИН N-АЦЕТИЛТРАНСФЕРАЗ И АССОЦИАЦИИ ПОЛИМОРФНЫХ ВАРИАНТОВ С РАКОМ ЛЕГКОГО У ЕВРОПЕОИДОВ г. НОВОСИБИРСКА 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2007 Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия) Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор В.А.Вавилин Научный консультант: доктор биологических наук, профессор С.Х.Дегтярев Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор А.Р.Колпаков кандидат медицинских наук В.Н.Максимов Ведущая организация: ГУ Научно-исследовательский институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск) Защита состоится "___" _______ 2007 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, г. Новосибирск, ул. академика Тимакова, 2; тел.: 8-(383)333-54-81). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН Автореферат разослан "___" ____________ 2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук, старший научный сотрудник Г.С.Русских ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. В современных молекулярно-эпидемиологических исследованиях многофакторных заболеваний, к которым относятся и онкологические, широко используется подход, основанный на исследовании ассоциаций полиморфных вариантов генов, продукты которых потенциально вовлечены в развитие и регуляцию тех или иных звеньев патогенеза заболевания, так называемый подход кандидатных генов (Пузырев, Степанов, 1997). С этих позиций перспективным объектом исследования представляются ферменты биотрансформации ксенобиотиков (ФБК), которые ответственны за процессы токсификации и детоксификации чужеродных соединений, в том числе и канцерогенных веществ (Galton, Ferns, 1999). Соотношение процессов токсификации и детоксификации сильно варьирует между индивидуумами вследствие высокой популяционной вариабельности генов ФБК (Weber, 1999). Особое значение дисбаланс детоксификации/токсификации ксенобиотиков имеет для онкологической патологии, составляя важную часть процессов стадии инициации. Рак легкого – самое распространенное в мировой популяции злокачественное заболевание. Ежегодно в мире диагностируется около 1 млн новых случаев рака легкого (Трахтенберг, Чиссов, 2000). Острота проблемы обусловлена не только высокой распространенностью заболевания, но и поздней диагностикой, неудовлетворительными результатами лечения и, как следствие, высокой летальностью. Это делает актуальным изучение всех факторов, причастных к начальному этапу канцерогенеза, в том числе и ФБК. К группе ферментов биотрансформации ксенобиотиков относятся ариламин N-ацетилтрансферазы (E.C. 2.3.1.5.): NAT1 и NAT2, осуществляющие N- и O-ацетилирование ароматических и гетероциклических аминов и гидразинов (Hein et al., 2000). Обширный скрининг субстратов показал, что NAT1 и NAT2 имеют перекрывающиеся, но четко отличающиеся профили специфических активностей (Kawamura et al., 2005). Давно известный полиморфизм NAT2 фенотипически проявляется наличием в популяции «быстрых» и «медленных» ацетиляторов, при этом у представителей европеоидной расы частота «медленных» ацетиляторов составляет 40-60% (Evans, 1989). Долгое время считалось, что для NAT1 не свойственен метаболический полиморфизм, но недавно показано, что около 8% европеоидов являются медленными ацетиляторами по специфическим субстратам NAT1 (Butcher et al., 1998). Причиной метаболического полиморфизма ацетилирования являются некоторые нуклеотидные замены в белок-кодирующем регионе гена NAT2 (Grant et al., 1990) и кодирующем и некодирующем регионе гена NAT1 (Weber, Vatsis, 1993). Молекулярные механизмы, ведущие к фенотипу «медленного» ацетилятора до сих пор не совсем понятны. Снижение активности ацетилирования в несколько сотен и даже тысяч раз происходит за счет снижения экспрессии белка (Leff et al., 1999), образования менее стабильного белка (Grant et al., 1997; Delomenie et al., 1997) или усиленной деградации белка (Butcher et al., 2004; Zang et al., 2004). Эти различия в механизмах реализации, а также характерная субстратная специфичность аллозимов (Hickman et al., 1995), свидетельствуют о гетерогенности группы медленных ацетиляторов. После того, как была показана роль ацетилирования в метаболической активации и детоксификации канцерогенов, присутствующих в табачном дыме, окружающей среде и потребляемой пище (Hein et al., 1993; 1994: Fretland et al., 2001; 2002), стали широко проводиться исследования ассоциаций между полиморфизмом NAT и онкологическими заболеваниями. К настоящему времени показано, что статус ацетилирования вносит изменения в риски возникновения рака мочевого пузыря (Inatomi et al., 1999; Hein, 2006) и толстой кишки (Hein et al., 2000; Tamer et al., 2006). Имеющиеся немногочисленные данные литературы о связи полиморфизма NAT и рака легкого противоречивы (Cascorbi et al., 1996; Bouchardy et al., 1998; Wikman et al., 2001). В этих исследованиях по результатам генотипирования делили аллели на две группы: ведущие к фенотипу медленного или быстрого ацетилятора. Однако в свете последних данных о разнообразии проявлений полиморфных вариантов генов NAT, изучение их ассоциации с заболеванием имеет самостоятельное значение. Одним из наиболее востребованных методов обнаружения полиморфных вариантов генов является анализ полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ-анализ). В связи с открытием все новых полиморфизмов в генах NAT, иногда в непосредственной близости от ранее известных, важна более точная локализация выявляемых полиморфизмов (Hein et al., 2000). Поэтому оптимизация метода ПДРФ является актуальной задачей. Генетический полиморфизм NAT2 у европеоидов Западной Сибири, как и вообще России, остается малоизученным. Генетический полиморфизм NAT1 у европеоидов России не изучен вообще. В связи с этим, имеет большое значение изучение распределения частот встречаемости полиморфных вариантов генов NAT у европеоидов России, а также поиск возможных специфических полиморфизмов в нашей популяции. Целью настоящей работы является исследование полиморфизма генов NAT1 и NAT2 методом полиморфизма длин рестрикционных фрагментов и анализ ассоциации полиморфных вариантов с раком легкого у европеоидов г. Новосибирска. Для достижения цели были поставлены следующие задачи: 1. Изучить возможность использования новых эндонуклеаз рестрикции для более надежного и точного обнаружения известных полиморфизмов генов NAT1 и NAT2 и поиска новых полиморфизмов. 2. Изучить частоту встречаемости полиморфных вариантов генов NAT1 и NAT2 у европеоидов г. Новосибирска. 3. Провести анализ ассоциаций аллелей, генотипов и комбинаций генотипов полиморфных вариантов генов NAT c раком легкого. Научная новизна исследования Впервые предложен способ обнаружения полиморфизма Δ1025 гена NAT1 методом ПДРФ-анализа и предложены способы однозначного определения полиморфизмов A752T гена NAT1 и С190Т, G857A гена NAT2 этим методом. Предложенные способы ПДРФ-анализа позволяют различать полиморфизмы С190Т и G191A; G857A и T859C, 859Del гена NAT2. Впервые в России охарактеризована частота встречаемости полиморфных вариантов C97T, С190Т, 350,351G>C, T402C, A752T и Δ1025 гена NAT1 и С190Т, G191A, A434C, C759T, T859C, 859Del гена NAT2. Впервые у европеоидов Западной Сибири определены частоты встречаемости полиморфных вариантов C282T, A803G и G857A гена NAT2. Установлено, что аллель 803G гена NAT2 у мужчин ассоциирован с устойчивостью к раку легкого. Генотип 803АА у мужчин, в том числе курящих, ассоциирован с предрасположенностью к раку легкого. Комбинация генотипов гена NAT2 282ТС/590АG/481CC/803GA/857GG ассоциирована с устойчивостью к раку легкого, а комбинация 282СС/590GG/481TC/803AA/857GG ассоциирована с предрасположенностью к раку легкого. Практическая значимость работы Предложены новые способы ПДРФ-анализа генов NAT, которые позволяют однозначно определить полиморфизмы A752T гена NAT1 и С190Т, G857A гена NAT2, а также различить полиморфизмы С190Т и G191A; G857A и T859C, 859Del гена NAT2. Эти способы применимы в исследованиях, направленных на изучение функциональных проявлений полиморфизмов генов NAT, кинетических характеристик аллозимов NAT и популяционно-генетических исследованиях. Полученные данные о распределении аллелей и генотипов полиморфных вариантов NAT у жителей г. Новосибирска представляют интерес для геногеографических и генетико-эпидемиологических исследований широко распространенных заболеваний человека. Результаты настоящей работы могут быть использованы в учебно-методическом процессе на биологических и медицинских факультетах ВУЗов. Основные положения, выносимые на защиту 1. Предложенные способы ПДРФ-анализа позволяют однозначно определять полиморфизмы C190T и G857A гена NAT2 и A752T гена NAT1, а также различать полиморфизмы С190Т и G191A; G857A и T859C, 859Del гена NAT2. 2. Распределение частот встречаемости полиморфных вариантов генов NAT1 и NAT2 у европеоидов г. Новосибирска соответствует таковому в других популяциях европеоидов. 3. В европеоидной популяции г. Новосибирска аллель 803G гена NAT2 у мужчин ассоциирован с устойчивостью к раку легкого. Генотип 803АА у мужчин, в том числе курящих, ассоциирован с предрасположенностью к раку легкого. 4. Комбинация генотипов 282ТС/590АG/481CC/803GA/857GG гена NAT2 в исследованной популяции ассоциирована с устойчивостью к раку легкого, а комбинация 282СС/590GG/481TC/803AA/857GG ассоциирована с предрасположенностью к раку легкого. Апробация работы. Материалы исследования были представлены на III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); 8-ой Международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2004); на Российской научно-практической конференции, посвященной 25-летию НИИ онкологии ТНЦ СО РАМН «Современное состояние и перспективы развития клинической онкологии» (Томск, 2004); на V молодежной научной конференции СО РАМН «Фундаментальные и прикладные проблемы современной медицины» (Новосибирск, 2004). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ (из них 4 в рецензируемой печати). Структура работы. Диссертационная работа изложена на 125 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 20 таблиц и 14 рисунков и состоит из шести разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов собственных исследований, обсуждения, выводов, а также списка цитируемой литературы, включающего 230 ссылок. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Работа выполнена с использованием банка образцов периферической крови, собранного при выполнении программы «Здоровье населения Сибири», проект «Оценка генетически полиморфных форм ферментов биотрансформации чужеродных соединений как факторов риска развития рака у жителей г. Новосибирска» (руководитель – академик РАМН Ляхович В.В.). Группа больных раком легкого состояла из 122 чел. (мужчин - 78, женщин - 44), средний возраст составил 60.4 ± 10.4 лет. Постановка диагноза по совокупности рентгенологических, клинических и, в части случаев, на основании результатов гистологического исследования, сбор учетной информации и биологического материала проведен врачем-онкологом Наровым Ю.Э. на базе поликлинического отделения онкологического диспансера г. Новосибирска. Контрольная группа людей без признаков онкологических заболеваний состояла из 167 чел. (мужчин - 119, женщин – 48), средний возраст составил 56.8 ± 18.9 лет. Все обследованные индивиды являлись европеоидами и не состояли в родстве. Часть образцов ДНК контрольной группы предоставлена ГУ НИИ терапии СО РАМН, собранных при проведении эпидемиологического исследования по программе ВОЗ «MONIKA». К группе курящих в нашем исследовании относили лиц, курящих на момент исследования, и учитывали суточную дозу в пачках. В качестве объекта исследования были использованы образцы тотальной геномной ДНК, выделенной из лимфоцитов периферической крови. Методы. Выделение ДНК проводили из образцов цельной периферической крови стандартным методом фенол-хлороформной экстракции (Маниатис, 1984). Фрагменты генов NAT1 размером 1552 п.н. и NAT2 размером 1000 п.н., которые включали единственный транслируемый экзон размером 870 п.н., амплифицировали в ходе полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Hickman, Sim, 1991; Payton, Sim, 1998). Подбор эндонуклеаз рестрикции проводился с использованием программ Dnasis и Vector NTI в первичных последовательностях генов NAT1 (GenBank, Acc. Number X17059) и NAT2 (GenBank, Acc. Number AY331807.1). Полиморфные варианты генов NAT (табл. 1) выявляли методом анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов с помощью опубликованных (Hickman, Sim, 1991; Bell et al., 1993; Lin et al., 1994; Cascorbi et al., 1995; Woolhouse et al. 1997; Lin et al., 1998; Leff et al., 1999) и оригинальных способов. Все использованные в работе эндонуклеазы рестрикции произведены в НПО «СибЭнзим» (Россия). Продукты ферментативного гидролиза разделяли путем горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле в трис-ацетатном буфере и визуализировали в проходящем УФ-свете с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Россия). Сравнительный анализ нуклеотидных последовательностей генов NAT1 (GenBank, Acc. Number X17059), NAT2 (GenBank, Acc. Number AY331807.1) и NATP (GenBank, Acc. Number X17060) проводили при помощи компьютерной программы для сравнения нуклеотидных последовательностей CLUSTAL W Multiple Sequence Alignment Program (http://www.ebi.ac.uk/clustalw/). Статистическую обработку полученных результатов проводили с использованием пакета прикладных статистических программ SPSS 11.5 и программы EpiInfo 6. Об ассоциации аллелей, генотипов и комбинаций генотипов с раком легкого судили по величине отношения шансов (ОШ) (Флетчер и др., 1998). Достоверность различий в частотах встречаемости изучаемых признаков между группой больных и контрольной группой оценивалась по критерию 2 с коррекцией Йейтса или по двустороннему критерию Фишера, когда в группе сравнения было менее 5 наблюдений. Таблица 1 Общая характеристика изученных полиморфных вариантов генов NAT
|
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии фгуп “Государственный научно-исследовательский институт... | | Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с ишемической болезнью сердца Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии фгуп «Государственный научно-исследовательский институт... |
| Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с диабетической полинейропатией... Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии фгуп «Государственный научно-исследовательский институт... | | Изучение генетической предрасположенности к атопической бронхиальной... Работа выполнена в лаборатории химической геномики Учреждения Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте... |
| Отчет о выполнении поисковых научно-исследовательских работ по теме Создание и апробация нового способа fiav для быстрой идентификации аллельных вариантов генов” |  | Тесты по обществознанию (пять вариантов) Москва 2011 фио абитуриента На выполнение теста отводится 30 минут. Задания рекомендуется выполнять по порядку, не пропуская ни одного, даже самого легкого.... |
| Как известно, первые вирусы появились давно. Они заражали древние... Одним из вариантов защиты от определения является полиморфизм. В далеком 1990 году он чуть было не погубил всю антивирусную индустрию.... | | Протокол общего годового собрания Ассоциации предприятий мебельной... ... |
| Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства... Работа выполнена в гу научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики со рамн (Новосибирск, Россия) | | Исследование роли гена орнитинаминотрансферазы в развитии и стрессоустойчивости растений ... |
| Годовой отчет о деятельности ассоциации региональных банков россии... На это в первую очередь направлена работа по выстраиванию конструктивных взаимоотношений с органами власти, оптимизации законодательной... | | Образовательное учреждение высшего профессионального образования Днк-технологий для выявления генов высокой продуктивности и устойчивости к заболеваниям; диагностики болезней животных посредством... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Постановление мэрии города Новосибирска от 14. 12. 2012 №12921 «Об утверждении ведомственной целевой программы «Реконструкция жилищного... | | Исследование состава «Авимина-1» Целью исследования является : проведение сравнительной оценки эффективности использования бада «Авимин-1» в коррекции и лечении различных... |
| Автор: А. А. Маслов Вице-президент и исполнительный директор Ассоциации... Ассоциации Шаолиньского ушу по странам Европы и снг, вице-президент Ассоциации боевых искусств России, доктор исторических наук,... | | Исследование цветовой гаммы исследование естественного освещения... Исследование процентного соотношения кабинетов с люминесцентными и электрическими лампами |
