Исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени инбредных линий мышей
Скачать 408.33 Kb.
|
На правах рукописи Михайлова Ольга НиколаевнаИсследование РЕГУЛЯЦИИ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ цитохрома Р450 подсемейства 1А в печени ИНБРЕДНЫХ ЛИНИЙ МЫШЕЙ Специальность: 03.00.04 – биохимия 03.00.03 – молекулярная биология А В Т О Р Е Ф Е Р А Тдиссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2007 Работа выполнена в ГУ Научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики СО РАМН (Новосибирск, Россия) Научные руководители: доктор биологических наук, профессор Людмила Федоровна Гуляева кандидат биологических наук Максим Леонидович Филипенко Официальные оппоненты: доктор биологических наук Иван Федорович. Усынин доктор медицинских наук, профессор Андрей Георгиевич Покровский Ведущая организация: Институт цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск) Защита диссертации состоится « 17 » апреля 2007 г. в 12 часов на заседании диссертационного совета Д.001.034.01 в ГУ Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН (630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел. 8 (3833) 33-54-81). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГУ Научно-исследовательского института биохимии СО РАМН. Автореферат диссертации разослан «___» _________2007 г. Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат биологических наук, Г.С. Русских Общая характеристика работыАктуальность темы. Цитохромы Р450 (CYP) подсемейства 1А окисляют многие канцерогены с образованием активных метаболитов, способных связываться с нуклеофильными сайтами макромолекул клетки, что может приводить к различным токсическим процессам, в том числе канцерогенезу (Nebert, McKinnon, 1994; Ioannides, Lewis, 2004). Канцерогены, особенно относящиеся к полициклическим ароматическим углеводородам (ПАУ), вызывают индукцию этих CYP, что сопровождается многократным увеличением уровня их мРНК и ферментативных активностей (Cheung et al, 1994; Shimada, 2006). Токсический эффект от канцерогена, попавшего в живой организм, определяется количеством его активного метаболита, который может образоваться, и эффективностью его детоксификации, что напрямую зависит от уровня индуцируемой формы цитохрома Р450, активирующей канцероген. CYP1А1 и CYP1А2 осуществляют биоактивацию многих прооксидантов и проканцерогенов: Р450 1А1 – бенз[а]пирена и других ПАУ, Р450 1А2 – ПАУ, ароматических аминов, нитрозоаминов, парацетамола, гетероциклических аминов (Ioannides, Lewis, 2004). Показано, что для активации генов CYP1A необходимо взаимодействие цитозольного белка – Ah-рецептора (AhR) с ксенобиотиком, транслокация активированного комплекса в ядро с последующим его взаимодействием с ядерным фактором ARNT и взаимодействие комплекса AhR– ARNT с цис-активными элементами генов CYP1A (Whitlock, 1999; Fujii-Kuriyama, 2005). В окислительном метаболизме лекарств и других ксенобиотиков, как в популяции людей, так и грызунов, существенную роль играет полиморфизм генов CYP1A1 и CYP1A2 (Nebert et al., 2004; Daly, 2003). Впервые такие генетические различия показаны на инбредных линиях мышей. Так, введение ПАУ мышам индуцибельных линий, обладающих Ah+ генотипом, приводит к значительному увеличению активности CYP1A, тогда как у мышей, обладающих Ah- генотипом, этого не наблюдается (Nebert, 1989). Инбредные линии мышей широко используются в качестве модели для изучения механизмов активации генов цитохрома Р450, а также процессов химического канцерогенеза. Показано, что такие мыши различаются по чувствительности к канцерогенному действию ПАУ, аминоазобензолов и других соединений (Gonzalez et al., 1993; Nebert et al., 2004; Каледин и др., 1999; Гуляева и др., 2000). Однако молекулярный механизм таких различий остается до конца не исследованным. Кроме того, выявлен и Ah-независимый механизм индукции цитохрома Р450 1A2 (Chaloupka et al., 1994). Все это говорит о более сложной картине регуляции экспрессии CYP1A в генетически различающихся линиях мышей, чем существующие на сегодняшний день представления, объясняющие это явление лишь различиями в генотипе AhR. В связи с этим представляется весьма актуальным исследование индукции CYP1A в норме и при воздействии ксенобиотиков в печени мышей, различающихся по чувствительности к индуцирующему действию ПАУ-соединений. Целью настоящей работы является исследование регуляции экспрессии генов цитохрома Р450 1А в печени мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора, при индукции химическими канцерогенами и под влиянием физиологических факторов. Для достижения цели решались следующие задачи:
Научная новизна работы Несмотря на то, что исследования механизмов индукции цитохромов Р450 подсемейства 1А и регуляции экспрессии их генов ведутся на протяжении многих лет, вопрос о том, как экспрессируются гены основных транскрипционных факторов AhR и ARNT, оставался нерешенным. В данной работе была впервые определена конститутивная экспрессия этих факторов в печени инбредных линий мышей, различающихся по чувствительности к индукции цитохрома Р4501А различными канцерогенными полициклическими углеводородами (ПАУ). Впервые было проведено комплексное исследование экспрессии транскрипционных факторов AhR, ARNT и их генов-мишеней CYP1А1 и CYP1А2 в печени мышей различных инбредных линий при индукции 3-метилхолантреном. Впервые была измерена динамика накопления мРНК исследуемых генов и выявлен максимум ее синтеза в интервале 10 - 20 часов после воздействия индуктора. Показано, что в печени мышей, как чувствительных к индуцирующему действию ПАУ (Ah+ генотип), так и дефектных по этому рецептору линиях (Ah-), определяется существенное количество мРНК СYP1А2, AhR, ARNT. Впервые показано наличие транскрипта гена CYP1А1 при индукции МХ и ОАТ в печени линий SWR, AKR и DBA, ранее считавшихся нечувствительными к ПАУ-индукции линиями. Эти результаты свидетельствуют о более сложном механизме формирования чувствительности к индуцирующему действию ПАУ, чем это считалось ранее. Наличие при индукции МХ увеличения содержания мРНК CYP1А у всех линий, независимо от генотипа Ah рецептора, указывает на то, что межлинейные различия не связаны с дефектом Ah рецептора. Полученные данные позволяют предположить существование транскрипционных механизмов регуляции CYP1А у мышей Ah+ линий и CYP1А2 у линии SWR (Ah-), и посттранскрипционных – у мышей AKR и DBA (Ah-). В работе впервые показано влияние возраста и стресса на экспрессию генов CYP1А1, CYP1А2, AhR и ARNT. Содержание мРНК исследуемых генов, за исключением Cyp1A1, различается между группами взрослых и старых животных. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше, чем в печени взрослых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению со взрослыми. Кроме того, под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов CYP1А2, AhR и ARNT, что в большей мере проявляется у взрослых особей. Полученные результаты указывают на существенное ослабление реакции адаптации на стресс у старых животных. Научно-практическая значимость По своему содержанию работа носит преимущественно фундаментальный характер и представляет собой исследование молекулярных механизмов индукции CYP1А в печени инбредных линий мышей. Важность исследования экспрессии генов AhR, ARNT, CYP1А1 и CYP1А2, прежде всего, определяется вовлечением кодируемых ими белков в процессы канцерогенеза, особенно на его инициирующих этапах. Этот факт имеет фундаментальное значение для понимания механизма действия канцерогенных химических соединений на организм животных и человека и ведет к раскрытию природы фундаментальных биологических процессов в клетке. Изучение механизмов воздействия канцерогенов на организм имеет также важное практическое значение как для экспериментальной работы, так и клинических исследований в ближайшем будущем. Так, результаты, свидетельствующие об индивидуальных различиях в индукции CYP1A у мышей, генетически различающихся по чувствительности к ПАУ, важно учитывать при изучении механизмов химически индуцированного канцерогенеза, где традиционно используются данные линии мышей. Данные об экспрессии генов CYP1A и их транскрипционных факторов важны в разработке новых высокочувствительных тестов по определению канцерогенной активности химических соединений. Понимание механизмов биоактивации проканцерогенов раскрывает широкие перспективы для предотвращения и/или модификации канцерогенеза в терапевтических целях. Основные положения, выносимые на защиту
Апробация работы Результаты работы были представлены и обсуждены на международном симпозиуме «13th International Symposium on Microsomes and Drug Oxidations» Стреза, Италия, 2000; на международном конгрессе «7th ESACP Congress» Кон, Франция, 2001; на международной конференции «18th European Workshop on Drug Metabolism» Валенсия, Испания, 2002; на Второй научной конференции с международным участием "Эндокринная регуляция физиологических функций в норме и патологии" Новосибирск, Россия, 2002; на международной конференции «11th North American ISSX Meeting» Орландо, США, 2002; на международном конгрессе «3rd European Congress of Biogerontology» Флоренция, Италия, 2002; на международной конференции «8th European ISSX Meeting» Дижон, Франция, 2003; на международном симпозиуме «8th Symposium on Catecholamines and other Neurotransmitters in Stress» Смоленице, Словакия, 2003; на международной конференции «7th International ISSX Meeting» Ванкувер, Канада, 2004. Публикации. По материалам диссертации имеется 13 печатных работ. Структура работы. Диссертационная работа изложена на 120 страницах машинописного текста с полуторным интервалом, содержит 5 таблиц и 15 рисунков и состоит из 6 разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и обсуждения результатов, выводов, а также списка цитируемой литературы, содержащего 13 отечественных и 218 зарубежных источников. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В работе были использованы мыши линий C57BL, CBA, A/Sn, DBA, AKR, SWR, CC57BR, A/He, BALB/c, C3H/a и DD, получаемые из питомника ИЦиГ СО РАН г. Новосибирска. Животные содержались по 2 - 3 особи в условиях естественного освещения при свободном доступе к воде и пище. Эксперименты проводились в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу Министерства здравоохранения СССР от 12.08.1977 г. N 755). Животные находились на стандартной диете и перед забоем сутки не получали еды. В экспериментах по определению межлинейных различий в экспрессии CYP1A индукцию микросомных ферментов осуществляли однократным внутрибрюшинным введением растворенным в 0,3 мл растительного масла МХ (80 мг/кг веса) или ОАТ (225 мг/кг веса). Микросомальную фракцию печени в этих случаях получали через 72 часа, а препараты РНК – через 4 – 72 часа после введения индуктора. Контролем служили животные, получавшие растительное масло (25 мл/кг веса). В экспериментах по влиянию стресса на экспрессию CYP1A каждая экспериментальная группа мышей («молодые» и «старые») была разделена на две подгруппы из семи животных: интактные и те, которые подвергались иммобилизационному стрессу посредством фиксации в положении лежа на спине в течение двух часов. Через час после завершения иммобилизационного воздействия проводили декапитацию животных. В течение семи дней непосредственно перед экспериментом мыши содержались в индивидуальных клетках для снятия эффекта групповых отношений. Микросомы печени выделяли при температуре +4C общепринятым методом дифференциального центрифугирования. Количество белка в микросомах определяли по методу Лоури, общее содержание цитохрома P450 измеряли как описано Омура T. и Сато P. (Omura, Sato, 1964). Скорость О-деалкилирования ряда алкоксирезоруфинов – ЭР, МР определялась спектрофлуориметрически по методу Бурке и Майера (Burke, Mayer, 1974). (Burke et al., 1985). Для детекции белков CYP1A микросомальные белки разделяли электрофорезом (Laemmli, 1970), переносили на нитроцеллюлозную мембрану полусухим способом в буфере 25 мМ Трис-HCl, 195 мМ глицин, 20% этанол на приборе Fastblot “Biometra” (Германия) в соответствии с инструкцией производителя. Мембрану инкубировали с первичными антителами (клон 14H5) против Р450 1А1/2 крыс. Белки визуализировали окрашивая мембраны раствором 5-бромо-4-хлоро-3-индолил фосфата (BCIP) и р-нитротетразолиума голубого (NBT) в буфере АР 9,5. Работа проводилась совместно с Захаровой Л.Ю. Препараты суммарной РНК получали SDS/фенольным методом, как описано (Chattopadhyay et al., 1993). Относительное содержание мРНК генов CYP1A1, CYP1A2, Ahr и ARNT определяли методом мультиплексной ОТ-ПЦР (Wong et al., 1994). В качестве эндогенного внутреннего контроля, относительно которого проводилось выравнивание продуктов амплификации исследуемых генов, были выбраны гены «домашнего хозяйства» β-актин, RPL30 и GAPDH. Для синтеза кДНК in vitro брали по 1 мкг РНК на пробу. ПЦР предварительно оптимизировали по числу циклов, концентрации Mg2+, количеству праймеров. Каждая амплификационная смесь содержала в качестве матрицы количество кДНК, соответствующее 100 нг суммарной РНК, 1 X буфер для ПЦР, 50 мкМ каждого дезоксирибонуклеозидтрифосфата, 20 пкМ каждого праймера для амплификации кДНК CYP1A1, CYP1A1, AhR, ARNT, COMT или GSTМ1 и 2 ед. акт. Taq ДНК-полимеразы. Равные количества (20 пкМ) праймеров для амплификации β-актина, циклофилина или GAPDH были добавлены через несколько циклов. Чтобы определить количество циклов, необходимых, чтобы, с одной стороны, визуализировать продукты амплификации, а, с другой – остановить ПЦР в экспоненциальной фазе амплификации, реакцию амплификации останавливали на разных циклах, и продукты амплификации анализировали гель-электрофорезом. В наших условиях наиболее подходящее число циклов было для β-актина, RPL30 или GAPDH – 22, для CYP1A1 – 30, для CYP1A2 – 27, для AhR и ARNT - 36. Каждую пробу амплифицировали трижды. Продукты ПЦР анализировали электрофорезом в 1,5 - 2% агарозном геле. Гель окрашивали бромистым этидием, сканировали с помощью видеосистемы «DNA Analyzer» (Литех,Москва) и денситометрировали с помощью программы ”ScionImage”. Относительное содержание мРНК генов CYP1A1, CYP1A2, Ahr и ARNT оценивали в относительных единицах как отношение интенсивности окрашивания специфической полосы генов к интенсивности полосы гена «домашнего хозяйства» β–актина, RPL30 или GAPDH. Препараты геномной ДНК получали из печени мышей, как описано ранее (Aljanabi, Martinez, 1997). Очистку продуктов ПЦР (472 п.н.) проводили на спин-колонках (Qiagen, Германия) и далее проводили прямое секвенирование согласно протоколу (dye-terminator method) для ABI-системы капиллярного электрофореза (Applied Biosystems, Великобритания) в соответствии с протоколом производителя. Все продукты ПЦР были секвенированы в обоих направлениях с использованием прямого и обратного праймеров. Статистическую обработку результатов проводили с помощью программ STATISTICA и Excel. Результаты представлены в виде M ± m, где М - среднее, m – ошибка среднего. Для оценки статистически значимых различий между выборками использовался t -критерий Стьюдента. В экспериментах по изучению влияния стресса использовали многофакторный анализ вариации (MANOVA) и метод Tukey для итогового многофакторного сравнения средних величин. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Молекулярные механизмы регуляции активности цитохромов Р450 подсемейства... Работа выполнена в гу научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики со рамн (Новосибирск, Россия) | | Изучение механизмов эпигенетической регуляции экспрессии генов на модели вируса саркомы птиц |
| Сергей Кириакович завриев Рнк-полимераза может выполнять механическую функцию транспорта фаговой ДНК в бактериальную клетку при инфекции, выявлен принципиально... | | Дипломную работу по теме «Исследование кинетики окисления цитохрома р-450 методом флеш-фотолиза» Медицинский, на Медико-биологический факультет, отделение биохимии. На 6-ом курсе выполняла дипломную работу по теме «Исследование... |
| Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium -опосредованной... Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные... |  | Циррозы печени. Осложнения циррозов печени В редких случаях возможна непосредственная эволюция острого вирусного гепатита, осложненного массивными печеночными некрозами, в... |
| Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Каскадная регуляция экспрессии генов вируса осповакцины модулируется многоступенчатыми промоторами. Yang Z, Maruri-Avidal L, Sisler... | | Реферат: Циррозы печени Цирроз печени — хронические прогрессирующие заболевания, характеризующиеся поражением как паренхимы, так и стромы органа с дистрофией... |
| Исследование на наличие одного из пяти вирусов гепатита Процедуры физиоаппаратами при заболевании печени и желчных путей, язвенной болезни желудка, почек, мочеточника, грибковых заболеваний... | | Исследование полиморфизма генов ариламин n-ацетилтрансфераз и ассоциации... Работа выполнена в гу научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики со рамн (Новосибирск, Россия) |
| Реферат Понимание младшими подростками невербального проявления эмоциональной экспрессии Практическое значение. Данная работа может быть практическим пособием для психологов, учителей, родителей при изучении проявления... | | Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии фгуп “Государственный научно-исследовательский институт... |
| Реферат Радиочастотная аблация является малоинвазивным методом локальной... Применение Радиочастотной аблации в комбинированном лечении злокачественных опухолей печени | | Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с ишемической болезнью сердца Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии фгуп «Государственный научно-исследовательский институт... |
| Progesterone, Thyroid Hormone and Relaxin in the Regulation of the... Апоптоз – важный определяющий элемент, регулирующий рост плаценты. Процесс апоптоза более активен в инвазивных evts, чем в их пролиферативных... | | Образовательное учреждение высшего профессионального образования Днк-технологий для выявления генов высокой продуктивности и устойчивости к заболеваниям; диагностики болезней животных посредством... |
