Скачать 408.33 Kb.
|
Индукция CYP1A1 и CYP1A2 в печени инбредных линий мышей, обработанных 3-метилхолантреном (МХ) и о-аминоазотолуолом (ОАТ) В нашем исследовании были использованы классический индуктор МХ, относящийся к классу ПАУ-соединений (Nebert, 1989; Carretero et al., 2001), и относящийся к классу азобензолов о-аминоазотолуол (ОАТ). По оценке Международного агентства изучения рака (IARC) ОАТ является возможным канцерогеном для человека (IARC, 1975). ОАТ интересен прежде всего тем, что вызывает развитие опухолей исключительно в печени мышей, но не крыс, причем мыши разных инбредных линий различаются по чувствительности к его действию (Каледин и др., 1990). Для выявления межлинейных различий при индукции канцерогенными соединениями были проведены эксперименты по определению содержания белков CYP1A1 и CYP1A2 и их ферментативной активности в печени инбредных линий мышей. Для определения белка был использован метод Вестерн-блот анализа (белковый иммуноблоттинг) с применением моноклональных антител против P450 1А. Данные этого эксперимента приведены на рисунке 1. Рисунок 1. Вестерн-блот анализ белков CYP1A в печени мышей с различным генотипом Ah рецептора. К – в норме; МХ – при индукции 3-метилхолантреном, OAT –при индукции о-аминоазотолуолом. Видно, что в печени мышей всех линий, не обработанных индукторами, регистрировался Cyp1A2, что подтверждает его конститутивную экспрессию независимо от генотипа Ah-рецептора. Введение как МХ, так и ОАТ, мышам ПАУ-индуцибельных линий, C57BL, CBA и A/Sn, приводит к увеличению содержания Cyp1а2, а также к индукции Cyp1а1. В тоже время, при введении индукторов мышам Ah--линий SWR, AKR и DBA (ПАУ-неиндуцибельные линии), подобного эффекта, не обнаружилось. Однако в отдельных случаях регистрировалось незначительное усиление интенсивности белковой полосы, соответствующей Cyp1A2 (линии AKR, DBA). Данные по анализу белка CYP1А были сопоставлены с ферментативной активностью цитохромов Р4501А1 и 1А2 в метаболизме 7-этокси- и 7-метоксирезоруфина соответственно. Результаты этого эксперимента представлены в таблице 1. Как следует из полученных результатов, у контрольных животных не существует статистически значимых межлинейных различий в параметрах ЭРОД и МРОД. Таким образом, базальный уровень активности Cyp1A1 и Cyp1A2 практически одинаков для всех исследуемых линий мышей. Введение как МХ, так и ОАТ, вызывало многократное увеличение ЭРОД и МРОД в печени мышей, обладающих Ah+ генотипом (C57BL, CBA и A/Sn). У мышей линий SWR, AKR, DBA, обладающих генотипом Ah-, введение как МХ, так и ОАТ, не приводило к статистически значимому увеличению общего содержания Р450 и ферментативной активности Cyp1A1 и Сyp1A2. Эти результаты согласуются с данными белкового иммуноблота и с результатами исследований группы Неберта, полученными ранее на ограниченном количестве линий мышей (Nebert, 1989). Таким образом, наши данные подтверждают наличие генетических различий в индуцибельности цитохрома 1А у мышей. Таблица 1. 7-этоксирезоруфин- (ЭРОД) и 7-метоксирезоруфин-(МРОД)-О-деалкилазные активности цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени мышей инбредных линий при индукции МХ и ОАТ.
В таблице приведены средние значения данных, полученные для групп животных из 6-ти особей, стандартное отклонение. Степень индукции указана в скобках. *Статистически значимое отличие от контроля по критерию Стьюдента (P 0,05). Н.о. – не определяли. Исследование экспрессии генов CYP1A1, CYP1A2, AhR и ARNT в зависимости от времени после введения МХ в качестве индуктора Общепринятым на сегодняшний день, является представление о дефекте Ah рецептора, как о причине различий в индуцибельности цитохрома 1А у мышей. Однако до сих пор не исследовали, существует ли корреляция между увеличением ферментативной активности и транскрипцией соответствующего гена, а также существует ли прямая взаимосвязь с изменением экспрессии соответствующих транскрипционных факторов. Поэтому следующим шагом в нашей работе было определение методом мультиплексной ОТ-ПЦР уровня мРНК CYP1A1 и CYP1A2, а также AhR и ARNT в норме и при индукции МХ и ОАТ. На первом этапе необходимо было определить максимум накопления мРНК в зависимости от времени после введения индуктора. Для ответа на вопрос, существует ли корреляция между увеличением ферментативной активности и транскрипцией соответствующего гена были проведены эксперименты по определению уровня мРНК CYP1A1 и CYP1A2, а также транскрипционных факторов AhR и ARNT в норме и при индукции МХ и ОАТ. Рисунок 2. Изменение экспрессии исследуемых генов в зависимости от времени после введения МХ в качестве индуктора у мышей линии DBA (Ah-нечувствительная). А). Электрофореграмма разделения продуктов мультиплексной ОТ-ПЦР в 2%-агарозном геле. К – контрольная группа животных. Б). Данные представлены как средние значения для групп животных из шести особей стандартное отклонение. А) Б) Рисунок 3. Изменение экспрессии исследуемых генов в зависимости от времени после введения МХ в качестве индуктора у мышей линии CBA (Ah-чувствительная). А). Электрофореграмма разделения продуктов мультиплексной ОТ-ПЦР в 2%-агарозном геле. К – контрольная группа животных. Б). Данные представлены как средние значения для групп животных из шести особей стандартное отклонение. Для определения экспрессии генов транскрипционных факторов AhR, ARNT и цитохромов Р4501А в печени мышей был использован метод мультиплексной ОТ-ПЦР, ранее используемый в нашей лаборатории и адаптированный для наших условий. Для определения максимального уровня экспрессии исследуемых генов после введения мышам индуктора 3-метилхолантрена (МХ), было взято несколько временных точек: 4, 8, 16, 20, 24 и 72 часа после действия индуктора. В эксперимент были взяты две линии мышей – DBA (Ah-нечувствительная) и CBA (Ah-чувствительная) (Nebert, 1989; Nebert et al., 2004). Результаты этого эксперимента приведены на рисунках 2 и 3. Как видно, максимальный уровень экспрессии исследуемых генов приходится на 16 – 20-ти часовой интервал после введения индуктора. В дальнейших экспериментах содержание мРНК определяли через 20 часов после введения мышам индуктора. Содержание мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени мышей в норме и при индукции МХ и ОАТ Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены уровни мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени 6-ти инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah-рецептора, т.е. по чувствительности к индуцирующему действию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), в норме и при индукции МХ. Рисунок 4. Уровень экспрессии генов CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей инбредных линий в норме и при индукции МХ и ОАТ. А) Электрофореграмма разделения продуктов мультиплексной ОТ-ПЦР в 2%-агарозном геле: к, группа контрольных мышей; м, при индукции МХ; o, при индукции ОАТ (у мышей линии CBA индукцию ОАТ не исследовали). Б) Данные представлены как средние значения для групп животных из восьми особей, стандартное отклонение. *P<0.05; **P<0.01; ***P<0.001. (Статистически значимые различия между индуцированными и интактными животными по критерию Стьюдента). Среди выбранных мышей три линии обладали AhR+ генотипом (CBA, C57BL, A/Sn) и три линии были нечувствительны к индукции ПАУ (DBA, AKR и SWR – AhR—генотип) (Nebert, 1989; Nebert et al., 2004). Полученные данные представлены на рисунке 4. В печени интактных мышей исследуемых линий мРНК СYр1а1 практически не регистрировался, в то время как конститутивный уровень экспрессии гена СYр1а2 был достаточно высок, что вполне согласуется с результатами Вестерн-иммуноблота, а также с ранее полученными результатами (Kimura et al., 1986). Обнаружено, что в печени всех исследуемых линий мышей регистрируется значительное увеличение количества мРНК цитохрома Р450 1А1 (рис. 4) при индукции 3-метилхолантреном. Этот факт оказался неожиданным, поскольку мыши линий SWR, AKR и DBA традиционно считаются ПАУ-неиндуцибельными (Nebert, 1989), т.е. обладают генотипом Ahd Ahd. Увеличение содержания уровня мРНК CYP1A1 достаточно трудно оценить вследствие её низкого содержания в контроле. Тем не менее, видна разница в уровне мРНК CYP1A1 среди исследуемых линий. Особенно это заметно для линий Ah+ генотипа. У линий, дефектных по Ah-рецептору, также наблюдалось увеличение содержания мРНК CYP1А1, хотя оно было не столь ярко выраженным: в 2 - 3 раза ниже по сравнению с Ah+ линиями. При исследовании экспрессии гена CYP1А2 обнаружено, что, в отличие от CYP1А1, в печени необработанных индуктором мышей регистрируется заметное количество мРНК (рис. 4). Количество мРНК CYP1А2 различается среди исследуемых линий не значительно. Исключение составляют мыши линии SWR, у которых количество мРНК CYP1А2 в контроле в 3-4 раза выше, по сравнению с мышами линий C57BL, A/Sn, CBA, AKR и DBA и сравним с индуцированным МХ. Введение животным 3-метилхолантрена сопровождалось усилением экспрессии CYP1А2 в печени мышей A/Sn, C57BL, CBA и AKR в 3-4 раза. Содержание мРНК CYP1A2 не изменялось у SWR мышей, но статистически значимо (p < 0.05), увеличивалось у DBA мышей при индукции МХ. Аналогичные эксперименты были проведены с использованием ОАТ в качестве индуктора. Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены уровни мРНК цитохромов Р450 1А1 и 1А2 в печени 5-ти инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah-рецептора. Полученные данные представлены на рисунке 4. Как видно, индукция ОАТ проходит схожим с МХ образом. Можно лишь отметить, что уровень индукции в случае ОАТ выше, чем в случае с МХ. Таким образом, вне зависимости от генотипа индуцибельности (генотипа Ah-рецептора) все исследуемые линии мышей реагировали на введение химических канцерогенов (МХ или ОАТ) усилением экспрессии генов Cyp1A1 и Cyp1A2. Этот факт оказался неожиданным, поскольку мыши линий SWR, AKR и DBA традиционно считаются ПАУ-неиндуцибельными. Полученные результаты выявили несоответствие между усилением транскрипции генов CYP1A1 и CYP1A2 и индуцибельностью соответствующих ферментов в печени мышей, что не согласуется с общепринятыми представлениями о механизмах индукции CYP1A1 и CYP1A2. Наличие при индукции МХ и ОАТ увеличения мРНК CYP1A1 у всех линий, независимо от генотипа Ah рецептора указывает на то, что межлинейные различия не связаны с дефектом Ah рецептора, и позволяет предположить существование посттранскрипционных механизмов регуляции CYP1A. Однако невозможно все объяснить с точки зрения только посттранскрипционных механизмов регуляции. Так у Ah+ линий обнаружено увеличение как уровня мРНК для генов CYP1A, так и уровня ферментативных активностей соответствующих ферментов. Также линия SWR ведет себя, как классическая неиндуцибельная линия в отношении CYP1A2. Скорее всего, существует вклад в межлинейные различия индуцибельности CYP1A и на транскрипционном уровне. Содержание мРНК генов AhR и ARNT в печени мышей в норме и при индукции МХ До настоящего времени тестируемые линии не были охарактеризованы по уровню экспрессии генов AhR и ARNT. Поэтому следующим шагом в нашей работе было определение уровня мРНК этих транскрипционных факторов в норме и при индукции. Поскольку предварительно не было обнаружено существенных отличий при индукции CYP1A ОАТ и МХ, то дальнейшие эксперименты проводили только с использованием МХ в качестве индуктора. Методом мультиплексной ОТ-ПЦР были определены уровни мРНК транскрипционных факторов AhR и ARNT в печени 6-ти инбредных линий мышей, различающихся по генотипу Ah-рецептора, т.е. по чувствительности к индуцирующему действию полициклических ароматических углеводородов (ПАУ). Результаты представлены на рисунке 5. На рисунке 5а приведены значения относительного содержания мРНК Ah-рецептора в печени мышей исследуемых линий. Видно, что вне зависимости от генотипа AhR, его экспрессия практически одинакова у всех мышей. И лишь для линии SWR можно отметить почти двукратное снижение его экспрессии по сравнению с другими линиями. Видно также, что экспрессия этого фактора практически не изменяется при введении мышам индуктора. При индукции МХ содержание мРНК AhR статистически значимо (p < 0.05) увеличивалось только у мышей линий AKR и DBA, тогда как у C57BL, A/Sn, CBA и SWR мышей – не изменялось. Аналогичные эксперименты были проведены для ARNT (рис. 5б). И в этом случае нами не было выявлено существенных межлинейных различий и зависимости от введения индуктора. Конститутивный уровень мРНК ARNT различался статистически значимо (p < 0.05), но лишь незначительно среди исследуемых линий мышей: немного повышен у мышей линий CBA и SWR и слегка понижен у AKR и DBA по сравнению с C57BL и A/Sn. После индукции МХ содержание мРНК ARNT не изменялось у мышей с Ah+-генотипом и слегка уменьшалось у мышей с Ah--генотипом. Таким образом, проведенные эксперименты показали, что уровень экспрессии генов AhR и ARNT существенно не зависит от генотипа Ah рецептора и индукции 3-метилхолантреном. |
Молекулярные механизмы регуляции активности цитохромов Р450 подсемейства... Работа выполнена в гу научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики со рамн (Новосибирск, Россия) | Изучение механизмов эпигенетической регуляции экспрессии генов на модели вируса саркомы птиц | ||
Сергей Кириакович завриев Рнк-полимераза может выполнять механическую функцию транспорта фаговой ДНК в бактериальную клетку при инфекции, выявлен принципиально... | Дипломную работу по теме «Исследование кинетики окисления цитохрома р-450 методом флеш-фотолиза» Медицинский, на Медико-биологический факультет, отделение биохимии. На 6-ом курсе выполняла дипломную работу по теме «Исследование... | ||
Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium -опосредованной... Сравнительное изучение эффективности Agrobacterium-опосредованной транзиентной экспрессии гетерологичных генов, кодирующих рекомбинантные... | Циррозы печени. Осложнения циррозов печени В редких случаях возможна непосредственная эволюция острого вирусного гепатита, осложненного массивными печеночными некрозами, в... | ||
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «вектор»... Каскадная регуляция экспрессии генов вируса осповакцины модулируется многоступенчатыми промоторами. Yang Z, Maruri-Avidal L, Sisler... | Реферат: Циррозы печени Цирроз печени — хронические прогрессирующие заболевания, характеризующиеся поражением как паренхимы, так и стромы органа с дистрофией... | ||
Исследование на наличие одного из пяти вирусов гепатита Процедуры физиоаппаратами при заболевании печени и желчных путей, язвенной болезни желудка, почек, мочеточника, грибковых заболеваний... | Исследование полиморфизма генов ариламин n-ацетилтрансфераз и ассоциации... Работа выполнена в гу научно-исследовательском институте молекулярной биологии и биофизики со рамн (Новосибирск, Россия) | ||
Реферат Понимание младшими подростками невербального проявления эмоциональной экспрессии Практическое значение. Данная работа может быть практическим пособием для психологов, учителей, родителей при изучении проявления... | Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с хроническим гломерулонефритом Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии фгуп “Государственный научно-исследовательский институт... | ||
Реферат Радиочастотная аблация является малоинвазивным методом локальной... Применение Радиочастотной аблации в комбинированном лечении злокачественных опухолей печени | Исследование ассоциации ряда генов-кандидатов с ишемической болезнью сердца Работа выполнена в лаборатории молекулярной диагностики и геномной дактилоскопии фгуп «Государственный научно-исследовательский институт... | ||
Progesterone, Thyroid Hormone and Relaxin in the Regulation of the... Апоптоз – важный определяющий элемент, регулирующий рост плаценты. Процесс апоптоза более активен в инвазивных evts, чем в их пролиферативных... | Образовательное учреждение высшего профессионального образования Днк-технологий для выявления генов высокой продуктивности и устойчивости к заболеваниям; диагностики болезней животных посредством... |