А
 
Б
Рисунок 5. Эффект МХ на относительное содержание мРНК AhR (А) и ARNT (Б) в печени мышей разных линий. Данные представлены как средние значения для групп животных из шести особей стандартное отклонение. *P<0,05; **P<0,01; ***P<0,001 (Статистически значимые различия между МХ-индуцированными и интактными животными по Критерию Стьюдента).
Анализ полученных данных позволяет сделать ряд важных заключений. Во-первых, стабильная экспрессия AhR и ARNT, регулирующих транскрипцию генов CYP1A, обнаруживается у всех исследуемых линий мышей, различающихся по чувствительности к ПАУ-индукции, причем введение МХ не влияет существенно на их экспрессию. Во-вторых, изменение экспрессии генов CYP1A в ответ на индукцию МХ обнаруживается у всех исследуемых линий мышей независимо от генотипа Ah рецептора. Можно допустить, что у мышей с Ah+ генотипом (C57BL, CBA и A/Sn) индукция CYP1A осуществляется через традиционный транскрипционный механизм, как это было предложено ранее другими исследователями (Nebert, 1989; Gonzalez et al., 1984). В то же время у мышей с Ah- генотипом (SWR, AKR и DBA) включается другой механизм индукции CYP1A, который, возможно, не связан напрямую с AhR-опосредованным механизмом регуляции. Эти результаты свидетельствуют в пользу AhR-независимого механизма индукции CYP1A1 и CYP1A2, что подтверждается случаями, известными для CYP1A2 (Chaloupka et al., 1994; Nerurkar et al., 1993; Adams et al., 1993). Механизм феномена AhR-независимого пути остается неизвестным. Предполагается, что он реализуется благодаря активации посттранскрипционных механизмов стабилизации мРНК и/или посттрансляционной стабилизации комплекса фермент-индуктор. По-видимому, также в отсутствие Ah рецептора, другие транскрипционные факторы способны связываться со специфической последовательностью ДНК (DRE) с последующей инициацией транскрипции гена CYP1A2 (Corcos et al., 1998), хотя для CYP1A1 такой механизм до сих пор не показан. Другая гипотеза может быть связана с существованием у мышей с Ah- генотипом посттранскрипционного механизма регуляции CYP1A, который ингибирует синтез белков CYP1A. Отсутствие накопления белков во время стабильной транскрипции соответствующих генов может указывать на дефекты в трансляции CYP1A1 и CYP1A2. Для определения точного механизма данного явления требуется более глубокое исследование молекулярной генетики Ah рецептора, а также дальнейшее исследование посттранскрипционных механизмов регуляции генов CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей различных инбредных линий.
В результате нашего исследования показаны индивидуальные различия в конститутивном и индуцированном уровне экспрессии генов CYP1A1, CYP1A2, AhR и ARNT для каждой исследуемой линии мышей, даже если некоторая корреляция была обнаружена в отношении генотипа Ah рецептора. Таким образом, инбредные линии мышей представляют уникальную модель для изучения индивидуальных различий в механизме экспрессии генов цитохрома P450 1A, что, возможно, является основной причиной различной индивидуальной чувствительности к канцерогенам.
Сравнительный анализ регуляторной последовательности гена CYP1A2 (от -4675 до -4204) у мышей инбредных линий
В настоящей работе было показано, что в случае мышей линии SWR содержание мРНК в норме существенно повышено по сравнению с мышами других исследуемых линий. К тому же, не было обнаружено увеличения количества мРНК CYP1A2 при индукции МХ и ОАТ, как в случае мышей остальных тестируемых линий мышей (рис. 4). Мы предположили, что такая неодинаковая картина экспрессии гена CYP1A2 под действием индукторов у инбредных линий при стабильной экспрессии транскрипционных факторов может быть связана с мутациями/заменами в ДНК-связывающей области промотора гена CYP1A2. Ранее в промоторе гена Cyp1A2 мыши была идентифицирована область, содержащая два энхансерных элемента, которая, как было показано, необходима для конститутивной экспрессии гена Cyp1A2 (Uchida et al., 2002) (рис. 7). В нашем эксперименте мы проверили гипотезу, что возможные полиморфизмы в этой регуляторной области гена CYP1A2 могут вносить вклад в генетические различия экспресии и/или индукции CYP1A2 среди различных инбредных линий мышей.
Для этого в микросомах печени мышей была определена МРОД активность, которая, как считается, отражает ферментативную активность CYP1A2. Для анализа использовали 11 линий мышей, различающихся по генотипу Ah рецептора и чувствительности к гепатоканцерогенному действию ОАТ (табл. 2).
Таблица 2. Используемые в эксперименте линии мышей
|
Чувствительные
к индукции ПАУ**
|
Нечувствительные
к индукции ПАУ**
|
Чувствительные к ОАТ-индуцированному канцерогенезу *
|
C57BL, A/Sn, A/He, CBA, C3H/а
|
DBA, SWR, DD
|
Устойчивые к ОАТ-индуцированному канцерогенезу *
|
BALB/c, CC57BR
|
AKR
|
*Каледин, Захарова, 1984; Каледин и др., 1990; ** Nebert, 1989
Результаты эксперимента представлены на рисунке 6. Можно заметить различия среди исследуемых линий: некоторые из них имеют сравнимый конститутивный уровень ферментативной активности CYP1A2, в то время как у других он повышен (CC57BR) или понижен (C3H/a, A/Sn, AKR, SWR).
Рисунок 6. Конститутивная активность МРОД в печени мышей различных линий.Статистический анализ проведен с использованием Критерия Стьюдента. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение для группы из восьми животных.
Для проверки, не является ли причиной обнаруженных различий возможный полиморфизм в регуляторном районе гена CYP1A2, была секвенирована последовательность ДНК гена CYP1A2 от -4675 до -4204, содержащая необходимые для конститутивной экспрессии элементы E1 и E2, у всех исследуемых линий мышей (рис. 7).
Рисунок 7. Нуклеотидная последовательность исследуемого района. Энхансерный район и 5- и 3-фланкирующие последовательности представлены заглавными и прописными буквами соответственно. Энхансерные элементы E1 и E2 подчеркнуты.
В результате анализа не было обнаружено полиморфизмов в исследуемом фрагменте ДНК, который, по-видимому, является консервативным и не связан с межлинейными различиями в экспрессии CYP1A2 и чувствительности к гепатоканцерогенному действию ОАТ.
С другой стороны, подобная стабильность в регуляторном районе гена может отражать ключевую роль, которую этот район играет в конститутивной экспрессии гена CYP1A2. В этом случае фенотипические различия могли бы быть связаны с регуляцией экспрессии этого гена или, возможно, с полиморфизмами других районов гена CYP1A2.
Идентификация возможных полиморфных вариантов гена имеет значение для фармакогенетических исследований, включая экспрессию гена CYP1A2, так же как и поиск новых детерминант метаболизма ксенобиотиков в токсикологии. Действительно, недавно несколько полиморфизмов были обнаружены в гене CYP1A2 в экспериментах с APN и C3H/HeJ мышами, различающимися по скорости метаболизма кофеина (Casley et al., 1999; Casley et al., 2000). Таким образом, представляют интерес дальнейшие исследования других районов гена CYP1A2 среди различных линий мышей.
Влияние стресса на индукцию цитохрома Р4501А, AhR и ARNT
В возрастных изменениях особое значение имеют сдвиги на двух уровнях: изменения в регуляции работы генов и изменения в нервной и гормональной регуляции. Известно, что и при стрессе в основе многих изменений клеточного метаболизма лежат гормональные сдвиги (Frolkis, 1993). У человека активность ферментов метаболизма ксенобиотиков в печени существенно снижается при старении (Anantharaju et al., 2002). Данные по экспрессии цитохромов Р450 у экспериментальных животных при старении на сегодняшний день не систематизированы. Из многочисленных исследований следует, что возрастная зависимость экспрессии этих ферментов различается у различных видов и линий животных, у мужских и женских особей (Pegram et al., 1995; Mote et al., 1990; Cao et al., 2001).
Показано, что продолжительность жизни животных, находящихся в обычных условиях, в условиях умеренных стрессов, больше, чем тех, которые жили при резком ограничении стрессовых воздействий или, наоборот, в условиях частых “сильных” стрессов. Многие проявления старения сходны с теми изменениями, которые наступают у взрослых животных, у людей при стрессе. Например, общими для старения и стресса являются повышение концентрации адреналина, вазопрессина, АКТГ и кортизола в крови, снижение концентрации тестостерона, тироксина, трийодглобулина, падение инсулиновой активности крови.
Недавние исследования обнаружили непосредственное влияние как психологического, так и физиологического стресса на экспрессию генов CYP1A1 и CYP1A2 в печени мышей и крыс (Konstandi et al., 2004; Konstandi et al., 1998). Очевидно, реакция системы фементов метаболизма ксенобиотиков на внешние регуляторные факторы может модифицироваться в условиях с измененной физиологической регуляцией. Широко известно, что рак чаще всего развивается при старении, что, в свою очередь, связано с динамикой возрастных генорегуляторных изменений. Таким образом, существует очевидная связь между стрессом, старением и системой ферментов цитохрома Р450.
Поскольку CYP1A участвуют в метаболизме не только экзогенных, но также и эндогенных соединений, то определенный интерес представляют исследования воздействия физиологических и психологических факторов на систему ферментов метаболизма ксенобиотиков. В связи с этим, следующим этапом нашей работы было изучение влияния стресса и старения на регуляцию генов CYP1A1 и CYP1A2.
В работе проведено исследование экспрессии генов Cyp1A1, Cyp1A2, AhR и ARNT в печени взрослых (3-месячных) и старых (26 месячных) мышей-самцов линии C3H/a, подвергнутых иммобилизационному стрессу.
На рисунке 8 показана типичная электрофореграмма разделения продуктов амплификации мультиплексной ПЦР. Результаты эксперимента представлены на рисунке 9. В печени мышей исследуемых линий мРНК CYP1A1 не регистрировался, как у интактных животных, так и у подверженных иммобилизационному стрессу (данные не представлены). Содержание мРНК ARNT было чрезвычайно низким у молодых животных и достаточно высоким у старых.
Статистическая обработка данных с использованием многофакторного анализа вариации (MANOVA) показала эффекты старения (FA) и стресса (FS) на экспрессию гена CYP1A2 (FA(1,22) = 173,02, P<0,00001; FS(1,22) = 11,70, P<0,003) и AhR (FA(1,22) = 721,34, P<0,00001; FS(1,22) = 113,47, P<0,00001), а также взаимодействие двух факторов Старение×Стресс (F(1,22) = 31,50, P<0,00002 для CYP1A2; F(1,22) = 62,90, P<0,00001 для AhR).
Методом Tukey для итогового многофакторного сравнения средних величин были обнаружены различия между экспериментальными группами. В печени старых интактных мышей по сравнению с молодыми интактными значительно увеличивалось содержание мРНК CYP1A2 (в 3,9 раза, P<0,001) и уменьшалось содержание мРНК AhR (в 2,9 раза, P<0,001). В печени молодых животных, подверженных стрессу, по сравнению с молодыми контрольными увеличивалось содержание мРНК CYP1A2 и AhR (в 2,4 раза, P<0,001 и в 1,6 раза, P<0,001 соответственно). В печени старых, подверженных стрессу мышей по сравнению со старыми контрольными животными содержание мРНК статистически значимо увеличивалось в случае AhR (в 1,3 раза, P<0,05) и ARNT (в 1,6 раза, P<0,001) и не изменялось в случае CYP1A2.
Из результатов нашего эксперимента видно, что имеет место ощутимое влияние стресса на экспрессию исследуемых генов, которое в большей мере проявляется у молодых особей (рис. 9). Обнаружены статистически значимые различия между молодыми и старыми животными внутри контрольной группы для всех исследуемых генов, за исключением Cyp1A1. Так содержание мРНК Cyp1A2 и ARNT в печени старых мышей выше, чем в печени молодых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению с молодыми.
Рисунок 8. Электрофореграмма разделения продуктов мультиплексной ОТ-ПЦР в 2%-агарозном геле.
Рисунок 9. Относительное количество мРНК в печени мышей. Данные представлены как среднее ± стандартное отклонение для группы из семи животных. ***P<0,001 в сравнении с молодыми контрольными животными; ###P<0,001, #P<0,05 в сравнении со старыми контрольными животными.
В печени интактных взрослых мышей мРНК Cyp1A1 практически не регистрировалась, в то время как содержание мРНК Cyp1A2 было достаточно высоким, что подтверждает результаты наших исследований и вполне согласуется с полученными ранее данными (Kimura et al., 1986; Tukey, Nebert, 1984). По нашим оценкам содержание мРНК CYP1A1 у интактных животных было приблизительно на два порядка ниже содержания мРНК CYP1A2 (данные не представлены). Не обнаружено влияния стресса и старения на содержание мРНК CYP1A1. Напротив, содержание мРНК CYP1A2 было выше у старых интактных животных по сравнению с молодыми и увеличивалось под воздействием стресса у молодых особей. У старых животных содержание мРНК Cyp1A2 было почти в 4 раза выше по сравнению с молодыми и практически не изменялось при стрессе.
Ранее было показано, что ЭРОД и ацетанилид-4-гидроксилазная активности, отражающие ферментативную активность CYP1A1 и CYP1A2 соответственно, были одинаковы как у молодых (10-недельного возраста), так и у старых (28-месячного возраста) мышей линии C57BL/6N (Pegram et al., 1995). У мышей линии B10.RIII (H-2r) 28-месячного возраста содержание мРНК CYP1A1 и CYP1A2 существенно уменьшалось на 65 и 95% соответственно, по сравнению с мышами 4-месячного возраста. Однако у мышей линии C57BL/10 (H-2b) не было обнаружено существенных изменений в конститутивном содержании мРНК CYP1A1 и CYP1A2 (Mote et al., 1990). У женских особей мышиной линии C3B10RF1 было показано уменьшение экспрессии генов N-сульфотрансферазы и трех генов цитохрома P450, включая CYP1A2, а также гена S-трансферазы omega 1 (фермента II фазы) при старении (Cao et al., 2001). Эти данные противоречат результатам нашего исследования, где у старых интактных мышей-самцов линии C3H/a содержание мРНК Cyp1A2 было почти в 4 раза выше по сравнению с молодыми. Повышенное содержание мРНК CYP1A2 у старых животных могло бы быть объяснен гипотезой, что хронические индукции этого фермента ПАУ и многими другими ксенобиотиками на протяжении всей жизни приводят к высокому уровню конститутивной экспрессии гена CYP1A2. Однако это может зависеть и от используемой линии мышей или, что наиболее вероятно, являться сложной функцией от изменений в генной экспрессии, включая несколько ядерных факторов, и гормонального статуса.
В большинстве известных случаев, индукция CYP1A1 и CYP1A2 осуществляется через так называемый Ah-зависимый рецепторный механизм, в котором непосредственное участие принимают транскрипционные факторы Ah рецептор и ARNT. В связи с этим, возникает определенный интерес изучить особенности экспрессии AhR и ARNT при стрессе и старении.
В настоящей работе показано, что содержание мРНК AhR у старых интактных животных почти в три раза ниже по сравнению с молодыми. Эти результаты согласуются с данными по онтогенезу AhR у крыс Sprague-Dawley: концентрация печеночного и легочного Ah рецепторов быстро увеличивалась после рождения и оставалась на максимальном уровне со 2-ого по 21-ый день. После этого концентрация AhR в этих тканях медленно снижалась с возрастом (Gasiewicz et al., 1984). Интересно, что мы не смогли оценить уровень экспрессии ARNT у молодых животных вследствие весьма низкого содержания его мРНК, хотя линия C3H/a традиционно считается ПАУ-индуцибельной. Кроме того, в других экспериментах мы обнаружили достаточно высокую экспрессию ARNT у молодых мышей других линий, как ПАУ-индуцибельных, так и ПАУ-неиндуцибельных.
У старых животных, однако, содержание мРНК ARNT было достаточно высоким. Можно предположить, что подобное увеличение экспрессии ARNT при старении могло бы способствовать транслокации Ah рецептора и его аккумуляции в ядре, приводя к транскрипционно активному комплексу AhR-ARNT, способному индуцировать экспрессию генов-мишеней, включая CYP1A2, содержание мРНК которого было значительно увеличенным у старых мышей по сравнению с молодыми.
В некоторых исследований было показано, что как психологический, так и физиологический стресс могут модулировать экспрессию генов ферментов ММС (Konstandi et al., 1998; Konstandi et al., 2004). У грызунов под воздействием различных стрессов было показано уменьшение скорости оксидативного метаболизма ксенобиотиков (Pollack et al., 1991), что могло модифицировать токсичность этих соединений. Различные модели стресса, как было установлено, различаются по своим эффектам на ферменты биотрансформации. Например, при стрессе ограничения пространства (restraint stress) увеличиваются некоторые ферментативные активности в печени мышей и уменьшаются другие, в то время как умеренный непредсказуемый стресс (unpredictable mild stress) действует по другому, иногда даже противоположному пути (Konstandi et al., 1998; Konstandi et al., 2004; Matamoros, Levine, 1996).
До сих пор при изучении животных используются многие стрессовые воздействия, такие как касание или ношение в руках, иммобилизационный стресс, ожидание болевых стимулов и гипотензивное кровотечение. Ханс Селье был первым исследователем, применившим иммобилизационный стресс в экспериментах на крысах (Selye, 1936). Впоследствии данный тип стресса был хорошо изучен в отношении различных аспектов эндокринной и нервной системы. В нашем эксперименте мы использовали в качестве модели модель иммобилизационного стресса, описанную ранее (Kvetnansky, Mikulaj, 1970). Было показано, что воздействие иммобилизационного стресса в течение 30-180 мин приводит к изменениям мРНК уровня ряда генов в тканях различных органов (Pacak, Palkovits, 2001; Kvetnansky et al., 1995). Однако до сих пор немного известно о системе ферментов метаболизма в период поздних стадий развития организма и в условиях стресса.
Можно предположить, что благодаря индукции Cyp1A2 у мышей, подвергнутых иммобилизационному стрессу, и повышенному уровню экспрессии гена Cyp1A2 у старых животных, в печени может происходить ускоренное разложение какого-либо эндогенного субстрата, и, соответственно, падение его уровня в крови. В этом случае нарушается сигнальная система, функционирующая по принципу обратной связи, что может способствовать усиленной гормональной секреции, и, как следствие, развитию опухолей. Так, например, гипофиз, в который не поступает тироксин, постоянно выделяет ТТГ (тиреотропный гормон), что вызывает пролиферацию клеток щитовидной железы с последующим развитием опухоли (Fagin, 1994).
Полученные нами результаты определенным образом согласуются с данными по исследованию активности НАДН: и НАД(Ф)Н: 2,6-дихлорфенолиндофенол редуктаз в микросомах печени взрослых и старых крыс, подвергнутых иммобилизационному стрессу. Было показано, что активность обеих редуктаз резко снижена у старых животных по сравнению со взрослыми. При стрессе у взрослых крыс происходило выраженное уменьшение активности НАДН-редуктазы (Рудько, Давыдов, 2001).
Таким образом, нами показано, что содержание мРНК исследуемых генов, за исключением Cyp1A1, различается между контрольными группами взрослых и старых животных. Содержание мРНК CYP1A2 и ARNT в печени старых мышей заметно выше, чем в печени взрослых особей, в то время как содержание мРНК AhR у старых животных понижено по сравнению со взрослыми.
Кроме того, под влиянием стресса увеличивается экспрессия генов CYP1А2, AhR и ARNT, что в большей мере проявляется у взрослых особей. Полученные результаты указывают на существенное ослабление реакции адаптации на стресс у старых животных. Дальнейшее изучение данного вопроса помогло бы объяснить причины изменений функции печени при старении и установить роль стресса в формировании возрастной патологии этого органа. |
