Павел Михайлович Влияние моделирования эффектов микрогравитации на цитоскелет и экспрессию генов у мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга человека in vitro
Скачать 446.92 Kb.
|
На правах рукописи ГЕРШОВИЧ Павел Михайлович Влияние моделирования эффектов микрогравитации на цитоскелет и экспрессию генов у мезенхимальных стромальных клеток-предшественников костного мозга человека in vitro 14.03.08 – авиационная, космическая и морская медицина 03.03.04 - клеточная биология, цитология, гистология А В Т О Р Е Ф Е Р А Т диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва – 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем РАН Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Буравкова Людмила Борисовна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Оганов Виктор Сумбатович доктор биологических наук, профессор Киселев Сергей Львович Ведущая организация: Учреждение Российской академии наук Институт молекулярной генетики РАН Защита диссертации состоится «16» сентября 2010 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 002.111.01 в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических проблем РАН (ГНЦ РФ – ИМБП РАН) по адресу: 123007, г. Москва, Хорошевское шоссе, д. 76 а. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНЦ РФ – ИМБП РАН Автореферат разослан « »______________2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор биологических наук М.А. Левинских ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Гравитация является фундаментальным механическим фактором, определяющим особенности эволюции и структурно-функциональной организации живых организмов на Земле. Известно, что в условиях микрогравитации происходят атрофические перестройки костной ткани, выраженность которых во многом зависит от расположения кости по отношению к вектору гравитации [Ступаков Г.П., Воложин А.И., 1989; Газенко О.Г., Григорьев А.И., Егоров А.Д., 1997; Оганов В.С., Богомолов B.B., 2009; Vico L. et al., 2001]. Локальная потеря массы костной ткани в условиях дефицита механической нагрузки или микрогравитации позволяет предположить, что рецепция механического сигнала (или его отсутствия) может осуществляться, в том числе и на клеточном уровне. Обусловленное микрогравитацией изменение способности костной ткани к самовозобновлению указывает на то, что в этот процесс могут быть вовлечены стволовые клетки и остеогенные клетки-предшественники. Не исключено, что пусковым механизмом могут служить различные изменения в структурах цитоскелета клеток остеогенной природы. В ряде недавних работ было показано участие определенных структур цитоскелета стволовых клеток в выборе пути их дифференцировки [Sordella R. et al., 2003; McBeath R. et al., 2005]. Цитоскелет живой клетки наряду с мембранными компонентами является одной из ведущих базовых структур клетки, обеспечивающих ее морфологическую целостность и функциональную активность. Ремоделирование актинового цитоскелета происходит под влиянием факторов различной природы: факторов роста, межклеточной адгезии и адгезии клеток к субстрату, осуществляемой, главным образом, интегриновыми рецепторами, а также при действии механических сигналов [Юдинцева Н.М. и др., 2008; Buravkova L.B. et al., 2001; Bershadsky A.D. et al., 2003; Crawford-Young S.J., 2006]. Существуют исследования, свидетельствующие об участии актинового цитоскелета и ассоциированных с ним внеклеточных и внутриклеточных белков в процессах проведения сигнала и регуляции экспрессии генов [Пинаев Г.П., 2009; Aplin A.E., et al., 1998; Janmey P.A., 1998]. Кроме того, показано, что в ходе остеогенной дифференцировки мезенхимальных клеток-предшественников организация актинового цитоскелета изменяется [Rodríguez J.P. et al., 2004]. Однако, по-прежнему, остается неясной роль цитоскелета, как потенциально гравитационно-чувствительной структуры клеток, в механизмах их адаптации к микрогравитации, а также в том, какое значение могут иметь перестройки цитоскелета или изменения в экспрессии генов компонентов цитоскелета для нормальной функциональной активности клеток-предшественников. Мультипотентные мезенхимальные стромальные или стволовые клетки (ММСК) являются популяцией клеток-предшественников стромы костного мозга [Pittenger M.F. et al., 1999; Conget P.A., Minguell J.J., 1999; Caplan A.I., Bruder S.P., 2001; Bianco P. et al., 2001]. Дифференцировочный потенциал, а также другие особенности функционирования этих клеток могут быть сравнительно легко изучены в культуре, в том числе и при оценке влияния различных физических факторов [Altman G.H. et al., 2002; Sordella R.et al., 2003; McBeath R. et al., 2005]. Перспективность всестороннего изучения биологии ММСК, а также их клинического использования определяется, прежде всего, их способностью восстанавливать дефекты и повреждения соединительных тканей (костной, хрящевой и мышечной). Точные молекулярные механизмы гравитационной чувствительности ММСК и более коммитированных остеогенных клеток-предшественников остаются не до конца ясными, что обусловлено сложностью объекта исследования, многоуровневой системой регуляции их дифференцировочного потенциала и функциональной активности. В частности, показано, что моделирование эффектов микрогравитации приводит к ингибированию остеогенной дифференцировки ММСК и преостеобластов и к активации программы адипогенной дифференцировки ММСК [Zayzafoon M. et al., 2004; Meyers V.E. et al., 2004; 2005; Pardo S.J. et al., 2005; Dai Z.Q. et al., 2007; Patel M.J. et al., 2007; Pan Z. et al., 2008; Gershovich J.G. et al., 2008; Capulli M. et al., 2009; Huang Y. et al., 2009], что выражается в подавлении уровня экспрессии определенных генов-маркеров остеогенного коммитирования, и связывается с перестройками актинового цитоскелета клеток и изменением уровня экспрессии ассоциированных с цитоскелетом механочувствительных адгезивных рецепторов клетки (интегринов). В целом, исследования, посвященные изучению гравитационной чувствительности ММСК in vitro, по-прежнему, весьма немногочисленны. Таким образом, изучение состояния цитоскелета и молекулярно-генетических свойств ММСК в условиях моделирования эффектов микрогравитации является актуальным вопросом, решение которого позволит приблизиться к более глубокому пониманию процессов, происходящих с клетками-предшественниками в условиях реальной микрогравитации. Цель работы: изучение особенностей организации цитоскелета, ассоциированных с ним элементов и молекулярно-генетическая характеристика мультипотентных мезенхимальных стромальных клеток (ММСК) костного мозга человека в условиях моделирования эффектов микрогравитации. Задачи исследования: 1) изучить динамику реорганизации актинового и тубулинового цитоскелета культивируемых ММСК на различных этапах наземного моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM; 2) исследовать адгезивные свойства ММСК и экспрессию некоторых рецепторов адгезии при моделировании эффектов микрогравитации; 3) оценить уровень экспрессии генов основных белков цитоскелета и ассоциированных с ним элементов на различных этапах наземного моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM; 4) провести профилирование экспрессии 84 генов – «маркеров стволовых клеток человека» с помощью наборов Stem Cell RT² Profiler™ PCR Array на различных этапах наземного моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM; 5) провести анализ уровня экспрессии ключевых маркеров остеогенной дифференцировки ММСК при длительном моделировании эффектов микрогравитации. Научная новизна. • Впервые показано, что моделирование эффектов микрогравитации с помощью RPM приводит к реорганизации актинового цитоскелета ММСК костного мозга человека уже после нескольких минут воздействия, которая является обратимой при более продолжительной экспозиции (120 часов) и при статической ре-адаптации в течение 24 часов, и потере ими периферических винкулиновых сайтов фокальной адгезии, не влияя на организацию тубулинового цитоскелета клеток. • Впервые выявлена динамика изменения уровня экспрессии генов цитоскелета в ММСК. В частности, показано, что экспозиция на RPM вызывает транзиторное изменение уровня экспрессии структурных и регуляторных генов, связанных с актиновым цитоскелетом, наиболее выраженное на этапе 48 часов, которое частично компенсируется на конечных сроках экспозиции (120 часов) и полностью при ре-адаптации клеток в статических условиях в течение 24 часов, что может отражать процесс адаптации цитоскелета к моделированию эффектов микрогравитации. • Впервые установлено, что моделирование эффектов микрогравитации (120 ч) приводит к достоверному изменению паттерна экспрессии генов - «маркеров стволовых клеток» (Stem Cell RT² Profiler™ PCR Array, SABiosciences) в ММСК костного мозга человека. При этом, моделирование эффектов микрогравитации вызывает как активацию, так и угнетение экспрессии 54 различных генов, кодирующих белки, принимающие участие во внутриклеточной сигнализации, клеточной адгезии, регуляции пролиферации и дифференцировки стволовых клеток. • Показано, что коммитирование ММСК к остеогенезу в условиях длительного моделирования эффектов микрогравитации (10-20 сут) сопровождается снижением уровня экспрессии генов, кодирующих основные маркеры остеогенной дифференцировки клеток, в том числе и ключевого мастер-транскрипционного фактора, контролирующего программу остеогенной дифференцировки ММСК – RUNX2. Теоретическая и практическая значимость работы. Обнаруженные структурные и молекулярно-генетические изменения в культурах ММСК свидетельствуют о наличии гравитационно-зависимых внутриклеточных механизмов, которые обуславливают как ранние, так и поздние ответные реакции клеток-предшественников на моделирование эффектов микрогравитации. Полученные приоритетные данные существенно дополняют имеющиеся теоретические представления о механизмах восприимчивости клеток-предшественников взрослого организма к изменению параметров гравитационной среды, по крайней мере, в условиях in vitro и о роли актинового цитоскелета, как базовой структуры клеток, в том числе и стволовых, в качестве гравитационно-сенсорной клеточной структуры. Результаты работы подтверждают возможность использования мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека в качестве удобной экспериментальной модели для изучения роли гравитации и микрогравитации в процессах функционирования и дифференцировки клеток-предшественников взрослого организма, а также для исследования механизмов клеточной гравитационной чувствительности. Полученные в работе результаты являются основой для разработки проекта технического задания для проведения космического эксперимента с целью дальнейшего изучения морфофункциональных и молекулярно-генетических свойств ММСК в условиях микрогравитации. Положения, выносимые на защиту: 1. Актиновый цитоскелет и ассоциированные с ним элементы представляют собой гравитационно-чувствительные структуры клетки, которые наиболее быстро реагируют на постоянное изменение положения ММСК в пространстве, что подтверждается наблюдаемой транзиторной реорганизацией актинового цитоскелета, и изменением в уровне экспрессии связанных ним структурных и регуляторных генов, начиная с самых ранних сроков экспозиции на RPM (30 мин - 48 ч). Восстановление структуры актинового цитоскелета ММСК на более поздних этапах (120 ч) сопровождается активацией адгезии клеток и частичным восстановлением уровня экспрессии цитоскелетных генов, что может быть важным звеном в механизме адаптации цитоскелета клеток-предшественников к условиям моделирования эффектов микрогравитации. 2. Под влиянием моделирования эффектов микрогравитации в ММСК человека происходит как угнетение, так и активация экспрессии ряда генов, отвечающих за поддержание свойств мультипотентности и дифференцировки стволовых клеток различных типов. В отличие от генов, связанных с актиновым цитоскелетом, паттерн экспрессии генов, кодирующих маркеры «стволовых клеток» в ММСК человека, наиболее значительно изменяется после 120 часов экспозиции в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM, что отражает временные различия между механизмами изменения экспрессии структурных и регуляторных генов, ответственных за различные типы внутриклеточных процессов в стволовых клетках. 3. Подавление процесса индуцированной остеогенной дифференцировки ММСК в условиях моделирования эффектов микрогравитации с помощью RPM может быть обусловлено как угнетением экспрессии генов, кодирующих ключевые маркеры остеогенной дифференцировки клеток, а именно, RUNX2, ALPL и OMD, так и активацией экспрессии анти-остеогенных и про-адипогенных факторов, таких как PPARγ. Апробация работы. Основные результаты и положения диссертации были доложены и обсуждены на: 7-й – 8-й Конференциях молодых учёных и специалистов, аспирантов и студентов, посвящённых дню Космонавтики. Москва, 2008, 2009; 11-й, 12-й, 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология-наука XXI века». Пущино, 2007, 2008, 2010; International symposium «Biological motility»: Achievements and Perspectives. Pushchino. 2008; 29th Annual International Physiology Meeting. Angers. France. 2008; 17th Humans in Space Symposium. Moscow. 2009; French-Russian-Belarussian Conference «Neurovascular impairment induced by environmental conditions: molecular, cellular and functional approach». Angers. France. 2010. По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, в том числе 4 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ. Диссертация апробирована на заседании секции Ученого совета ГНЦ РФ – ИМБП РАН “Космическая физиология и биология” 15.06.2010 г. Связь работы с научными программами. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ №08-04-01607-а, контракта с Роснауки № 02.518.11.7059 и программы Фундаментальных исследований ГНЦ РФ - ИМБП РАН. Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов исследования и их обсуждения, заключения, выводов и списка литературы. Текст диссертации изложен на 150 страницах, содержит 18 рисунков и 8 таблиц. Список литературы состоит из 307 цитируемых источников, из которых 34 - на русском и 273 - на иностранном языке. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Культивирование ММСК. Объектом исследования являлись культуры мезенхимальных стромальных клеток костного мозга человека, любезно предоставленные д.б.н. Романовым Ю.А. (Научно-практическая лаборатория стволовых клеток человека НИИ РКНПК Росмедтехнологий). В качестве среды для поддержания роста ММСК использовали среду DMEM-LG с концентрацией глюкозы 1 г/л (Gibco, США), содержащую 2 мМ глутамина (MP Biomedicals, США), 1 мМ пирувата натрия, 12,5 мМ HEPES-буфера (Gibco или Sigma, США), 100 ед/мл пенициллина и 100 μг/мл стрептомицина (Биолот, Россия), 10% эмбриональной телячьей сыворотки (Gibco, США). Замену среды проводили каждые 3-4 дня. Культивирование в стандартных условиях проводили при 37оС в СО2-инкубаторе (Sanyo, Япония). Моделирование эффектов микрогравитации. Для моделирования эффектов микрогравитации использовали Устройство для рандомизации положения - Random Positioning Machine (dRPM, Dutch Space, Leiden, The Netherlands). В процессе работы RPM происходит рандомизация положения объекта относительно вектора гравитации за счет разнонаправленного вращения двух взаимоперпендикулярных рамок, к которым крепится платформа с экспериментальными образцами, за счет чего имитируется эффект снижения влияния силы тяжести на культуру клеток [van Loon J.J.W.A., 2007]. В результате испытаний был выработан оптимальный набор предварительно устанавливаемых параметров вращения симуляции микрогравитации (100 радиан в мин для внешней рамки и 80 для внутренней, при активной функции смены направления вращения). |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Сравнительная характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного... Сборник нормативных документов. Биология. Сост. Г. М. Пальдяева. – 3-е изд. Стереотип. –М.: Дрофа, 2011. и образовательных программ... | | Влияние микрогравитации на межклеточное взаимодействие иммунокомпетентных... |
| Морфофункциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток... Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Государственном научном центре Российской Федерации – Институте... | | Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные... |
| Рабочая учебная программа по дисциплине Изучить морфологические, цито-, биохимические и функциональные особенности клеток крови, особенности картины периферической крови... | | Перечень научно-исследовательских, опытно-конструкторских и технологических... Изучение закономерностей дифференцировки стволовых и прогениторных клеток из различных источников в условиях in vitro и in vivo и... |
 | Приказ Минздрава России от 20. 12. 2012 n 1279н ... | | Вещества, входящие в семейство витамина а, стастически значимо снижают... |
| Влияние предшественников на урожайность сортов озимой пшеницы, технологические... | | Гуровиц Владимир Михайлович Кротков Павел Андреевич Помощник заместителя Министра экономического развития Российской Федерации Руководителя Росимущества |
| С троение спинного мозга В сером веществе находятся тела нервных клеток, а в белом — их отростки. В передних рогах серого вещества спинного мозга (в передних... | | Исследование in vivo Влияние различных доз препарата «ga-40» на накопление... Влияние различных доз препарата «ga-40» на накопление антитело образующих клеток (аок) и массу и клеточностьезенки у мышей 5 |
| «Влияние вибрации на организм человека» Теперь мы осознали, что любая деятельность человека оказывает влияние на окружающую среду, а ухудшение состояния биосферы опасно... | | Стимуляция ангио/миогенеза при сердечно-сосудистой патологии с использованием... Работа выполнена в Научном Центре Сердечно-Сосудистой Хирургии им. А. Н. Бакулева рамн |
| Реферат По физике На тему: «Влияние электромагнитного излучения на организм человека» Влияние электромагнитных лучей, исходящих от сотовых телефонов, на организм человека | | «Происхождение человека» Предметные: создать условия для формирования понятия об особенностях внешнего строения, образе жизни предшественников человека: австралопитетеков,... |
