Сравнительная характеристика мезенхимальных стромальных клеток костного мозга, жировой ткани и плаценты человека 14. 00. 36 Аллергология и иммунология
Скачать 316.3 Kb.
|
На правах рукописи ПЕТРОВСКИЙ ЯРОСЛАВ ЛЕОНИДОВИЧ СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТРОМАЛЬНЫХ КЛЕТОК костного мозга, жировой ткани и плаценты ЧЕЛОВЕКА 14.00.36 – Аллергология и иммунология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск 2009 Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор Останин Александр Анатольевич Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор Идова Галина Вениаминовна кандидат медицинских наук Повещенко Ольга Владимировна Ведущая организация: Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (г. Москва) Защита состоится «___» ___________ 2009 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН Автореферат разослан «___» ___________ 2009 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Кудаева Ольга Тимофеевна ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы В связи с развитием клеточных подходов в регенеративной медицине все больший интерес привлекает возможность получения достаточного количества клеточного материала за счет экспансии клеток in vitro. В этих целях наиболее перспективными и востребованными признаются мезенхимальные стромальные клетки (МСК). МСК относятся к классу соматических стволовых клеток, которые характеризуются способностью к самоподдержанию и дифференцировке в клетки тканей мезодермального происхождения [Caplan A.I., 1994]. В 2006 году Комитетом по стволовым клеткам Международного общества клеточной терапии была проведена согласительная конференция и определены «минимальные» критерии, специфичные для МСК: а) адгезия к пластику и фибробластоподобная морфология, б) характерный иммунофенотип (экспрессия CD73, CD90, CD105 и отсутствие экспрессии CD34, CD45, HLA-DR) и в) способность дифференцироваться в остеогенном, адипогенном и хондрогенном направлении [Dominici M., 2006]. Кроме того, на различных экспериментальных моделях показана способность МСК дифференцироваться в клетки тканей экто- и эндодермального происхождения. Например, клетки нервной, мышечной тканей, а также эпителиальные клетки, что предполагает наличие у МСК потенциала плюрипотентных стволовых клеток [Barry F., 2001; Bianco P., 2001; Bruder S.P., 1997; Gronthos S., 2003; Pittenger M.F., 1999]. Не менее важной биологической особенностью МСК является их низкая иммуногенность, способность к миграции в очаг повреждения, гемопоэзстимулирующая и иммуномодулирующая активность, что позволяет рассматривать их, как потенциально активных индукторов/регуляторов репаративных процессов [Зубов Д.А., 2008; Шевцов В.И., 1999; Haynesworth S.E., 1996; Kim H.J., 1999]. Так, в настоящее время активно обсуждается возможность использования МСК с целью ускорения восстановления кроветворения и профилактики развития РТПХ при трансплантации стволовых кроветворных клеток пациентам гемобластозами после высокодозовой химиотерапии [Ball L.M., 2008; Le Blanc K., 2006]. Разрабатываются новые подходы по использованию МСК для восстановления репаративного остеогенеза [Деев Р.В., 2004; Зорин В.Л., 2004; Шевцов В.И., 1999], а также в терапии ряда других патологий [Аскаров М.Б., 2009; Черных Е.Р., 2007]. Как правило, МСК выделяют из костного мозга, где они и были впервые идентифицированы Фриденштейном А.Я. с соавт. [Friedenstein A.J., 1976]. Однако получение аспирата костного мозга из крыла подвздошной кости представляет инвазивную и травматичную процедуру. Кроме того, показано, что с возрастом человека количество, дифференцировочный потенциал и жизнеспособность костномозговых мезенхимальных клеток резко снижается [Stolzing A., 2008]. В этой связи проводится поиск альтернативных источников получения МСК. Одним из таких источников может быть жировая ткань [Zuk P.A., 2002], другим – плацента [Fukuchi Y., 2004; Igura K., 2004]. Однако, морфо-функциональные характеристики жировых и плацентарных МСК, а также их иммунорегуляторные свойства в настоящее время изучены недостаточно полно. Сравнительный анализ МСК различного тканевого происхождения имеет немаловажное теоретическое и практическое значение. С фундаментальной точки зрения важно понимать, имеются или нет какие-либо специфические отличия МСК в зависимости от их локализации в тех или иных тканевых нишах (например, в строме костного мозга или в жировой клетчатке), а также в зависимости от их принадлежности к развивающимся (плацента новорожденного) или зрелым, дефинитивным тканям (костный мозг, жировая ткань взрослого человека). Результаты сравнительных исследований различных типов МСК могут иметь и практическую ценность, например, для оптимизации технологий трансплантации МСК. В клинической практике наиболее безопасным считается использование аутологичного клеточного материала. Однако использование МСК в целях аутотрансплантации диктует необходимость предварительной оценки их функционального состояния. Очевидно, что эффективность лечения с использованием МСК во многом будет определяться их биологической активностью, которая, в свою очередь, может непосредственно зависеть от таких факторов, как источник их получения и особенности экспансии in vitro. Цель исследования. На основе анализа морфо-функциональных и иммунорегуляторных свойств фибробластоподобных клеток, выделенных из костного мозга, липоаспирата и плаценты человека, провести сравнительную характеристику мезенхимальных стромальных клеток различного тканевого происхождения. Задачи исследования.
Научная новизна Впервые установлено, что в жировой ткани количество клоногенных прекурсоров МСК достоверно выше, чем в костном мозге и плаценте. Вне зависимости от типа тканей показана способность МСК к самоподдержанию и активному клеточному росту. Впервые установлено, что в популяции плацентарных клеток в отличие от КМ- и Ж-МСК преобладают клетки с диаметром менее 20 мкм. При этом П-МСК характеризуются наиболее выраженным пролиферативным потенциалом, о чем свидетельствует количество клеток, генерируемых в первичных культурах, а также динамика удвоений клеточной популяции в процессе культивирования. Впервые выявлено, что костномозговые МСК обладают более выраженным остеогенным потенциалом, чем П-МСК и, особенно, Ж-МСК. После культивирования в индукционной среде пик продукции депозитов кальция регистрируется в культурах КМ-МСК, в которых количество клеток в 2 и 8 раз меньше, чем в культурах П-МСК и Ж-МСК, соответственно. На основе анализа конститутивной продукции 24 биологически активных медиаторов впервые показано, что МСК различного тканевого происхождения обладают функциональным потенциалом для поддержания кроветворения (через продукцию G-CSF, GM-CSF, эритропоэтина), иммуномодуляции (через продукцию IFN-γ, IL-2, IL-6, IL-1β, TNF-α и хемокинов – IL-8, MCP-1, MIP-1β) и стимуляции репаративных процессов (через продукцию VEGF, FGF-basic, IGF-1, IL-6, TIMP-1/MMP-9). Впервые установлено, что по характеру и уровню спонтанной (базальной) продукции цитокинов Ж-МСК в большей степени проявляют провоспалительный (IL-1β, TNF-α), иммунорегуляторный (IFN-γ, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, MCP-1, MIP-1β) и гемопоэзстимулирующий (G-CSF, GM-CSF) фенотип, но при этом характеризуются более низкой чувствительностью к ЛПС-стимуляции, чем КМ- и П-МСК. Показано, что МСК исследуемых тканей обладают иммуносупрессорной активностью, которая проявляется в ингибиции пролиферативного ответа активированных Т-лимфоцитов. При этом впервые установлено, что КМ-МСК отличаются наиболее выраженной супрессией в отношении Т-клеток, активированных анти-CD3-антителами, тогда как Ж- и П-МСК – в отношении Т-лимфоцитов, активированных аллоантигенами в СКЛ. При изучении клеточно-молекулярных механизмов анти-пролиферативного эффекта МСК получены новые данные о том, что иммуносупрессорная активность МСК сопряжена со снижением экспрессии на Т-клетках активационных молекул (CD25, HLA-DR), а также реализуется через продукцию растворимых изоформ HLA-G и простагландина E2. Кроме того, действие МСК частично может опосредоваться через модуляцию функциональной активности дендритных клеток. Показано, что как КМ-МСК, так и П-МСК и Ж-МСК характеризуются наличием гемопоэзстимулирующей активности, которая проявляется в их способности усиливать дифференцировку гемопоэтических клеток-предшественников в эритроидном и гранулоцитарно-макрофагальном направлении. Теоретическая и практическая значимость Теоретическая значимость работы заключается в получении новых сведений о морфо-функциональных свойствах мезенхимальных стромальных клеток в зависимости от локализации в различных тканевых нишах (костного мозга и жировой ткани), а также в зависимости от их принадлежности к развивающимся (плацента новорожденного) или зрелым, дефинитивным тканям (костный мозг, жировая ткань взрослого человека). Практическая значимость работы заключается в разработке нового метода полуколичественной оценки интенсивности остеогенной дифференцировки МСК (Патент 2370771 РФ «Способ оценки остеогенного потенциала мезенхимальных стромальных клеток»). Предложенный метод может повысить эффективность использования МСК, например, в травматологии и ортопедии, поскольку позволяет определять наиболее оптимальные условия функционирования МСК в зависимости от типа тканевого источника, клеточной плотности МСК, кратности/длительности пассирования МСК in vitro, концентрации ростовых сывороточных факторов в микроокружении. Результаты исследований по изучению костномозговых МСК были использованы при разработке новой медицинской технологии «Использование совместной трансплантации мезенхимальных стволовых стромальных клеток и стволовых кроветворных клеток при гемобластозах и аутоиммунных заболеваниях», зарегистрированной Федеральной службой по надзору в сфере здравоохранения и социального развития (ФС № 2008/014 от 30 января 2008 г). Полученные данные, характеризующие функциональные свойства плацентарных МСК, а также разработанные протоколы по их выделению и количественной экспансии могут послужить основой для расширения сферы деятельности существующих Банков пуповинной крови. Основные положения, выносимые на защиту.
Апробация работы: Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Всероссийских научно-практических конференциях «Дни иммунологии в Сибири» (Красноярск, 2006; Омск, 2007; Томск, 2008); на XI и XIII Всероссийских научно-практических форумах «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2007; 2009); на 3-ей Международной конференции «Фундаментальные науки – медицине» (Новосибирск, 2007); на II Объединенном иммунологическом форуме (Санкт-Петербург, 2008), а также на ежегодном конгрессе Европейской Группы по гематологии и трансплантации костного мозга – 34th Annual Congress EBMT (Florence, 2008). Апробация диссертации состоялась 5 ноября 2009 года на расширенном семинаре НИИ клинической иммунологии СО РАМН. Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК, а также получен 1 патент. Объем и структура диссертации: Диссертация написана в традиционном стиле и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 4 глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 109 страницах машинописного текста, включающего 21 таблицу и 13 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 177 литературных источников, в том числе, 164 иностранных. Работа выполнена в лаборатории клеточной иммунотерапии НИИ КИ СО РАМН (зав. лабораторией – д.м.н., проф. Черных Е.Р.). Образцы тканей для получения МСК были любезно предоставлены д.м.н., проф. Добряковой О.Б. и к.м.н. Дробинской А.Н. Автор выражает искреннюю признательность научному руководителю д.м.н., проф. Останину А.А. Реализация диссертационной работы была бы невозможна без квалифицированной помощи и активного участия в моделировании экспериментов к.м.н. Шевела Е.Я., технической поддержки Сычёвой Н.В. и Салимовой Г.М., а также без всесторонней поддержки д.м.н., проф. Черных Е.Р. Всем им, а также многим другим сотрудникам НИИ клинической иммунологии СО РАМН автор выражает искреннюю признательность и благодарность. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Диссертационная работа основана на результатах исследования МСК, выделенных из костного мозга (n=30), жировой (n=41) и плацентарной ткани (n=31) человека. Получение и культивирование мононуклеарных и ядросодержащих клеток Костный мозг получали путём трепанобиопсии из крыла подвздошной кости. МНК выделяли страндартно центрифугированием на градиенте плотности фиколла-верографина. Определяли количество клеток и их жизнеспособность. Ткань плаценты получали после физиологических родов, при наличии информированного согласия матери. Ткань измельчали, отмывали в PBS от остатков крови и обрабатывали раствором 0,25% трипсина, 0,02% ЭДТА и 0,1% коллагеназы 1а типа (Sigma-Aldrich, США) в течение 40 минут. После отмывки полученные клетки ресуспендировали в среде α-MEM, подсчитывали количество и жизнеспособность ядросодержащих клеток. Жировую ткань получали в ходе операций эстетической хирургии, при наличии информированного согласия пациента. Липоаспираты отмывали в PBS и обрабатывали 0,1% раствором коллагеназы 1а (Sigma-Aldrich, США) в течение 40 минут. Полученную клеточную суспензию отмывали в PBS с удалением оставшихся фрагментов ткани. Клетки ресуспендировали в среде α-MEM, определяли их количество и жизнеспособность. Для получения популяции МСК костномозговые МНК и ядросодержащие клетки жировой/плацентарной ткани культивировали в среде α-MEM («БиолоТ», С-Пб) c 20% FCS («БиолоТ», С-Пб) в CO2-инкубаторе. Через 24 ч неприкрепленные к пластику клетки удаляли, а фракцию адгезивных клеток культивировали до покрытия клетками 80-90% площади флакона. Отделение МСК от поверхности флакона при пассировании осуществляли посредством раствора 0,25% трипсина (Sigma-Aldrich, США) и 0,02% ЭДТА (ICN, США) в течение 10 минут. Исследовали МСК после 1-3 пассажей. Исходное количество клоногенных прекурсоров МСК в исследуемых тканях определяли по числу фибробластных колониеобразующих единиц (КОЕ-Ф). Для этого 1х106 МНК костного мозга или ядросодержащих клеток жировой ткани/плаценты культивировали в чашках Петри (Nunclon, Дания) в среде αМЕМ с 20% FCS в течение 14 суток. По окончании культивирования клетки окрашивали по Романовскому-Гимза, затем подсчитывали число колоний, содержащих не менее 50 фибробластоподобных клеток. Интенсивность деления МСК оценивали по времени достижения конфлюэнтного роста в первичных культурах (1-й пассаж) и по количеству генерированных «дочерних» клеток в пересчете на 1 КОЕ-Ф. Количество удвоений клеточной популяции оценивали по формуле logN/log2, где N – частное от деления количества клеток, полученных при первом пассаже, на исходное количество КОЕ-Ф. Морфометрию МСК проводили в мазках, окрашенных азур-эозином, с использованием компьютеризированной видеосистемы со встроенным интерфейсом (MicroMed Images 1.0) с последующей оценкой характера распределения клеток по величине их диаметра в интервале <10 — >60 мкм с шагом 10 мкм. Фенотипический анализ МСК проводили методом проточной цитофлюориметрии на лазерном клеточном анализаторе FACSCalibur (Becton Dickinson, США) с использованием FITC- или PE-меченных моноклональных анти-CD3, -CD14, -CD16, -CD20, - CD34, -CD73, -CD90, -CD105, -HLA-DR антител. Клеточный цикл и уровень апоптоза в популяции CD90+МСК оценивали методом проточной цитометрии с окрашиванием клеток пропидиум иодидом (Propidium iodide, Sigma-Aldrich). Оценка остеогенной и адипогенной дифференцировки МСК. МСК, полученные при первом пассаже, культивировали 24-48 ч, после чего в опытных образцах полностью заменяли культуральную среду на индукционную, содержащую β-глицерофосфат, дексаметазон и аскорбиновой кислоты-2-фосфат в случае остеогенной дифференцировки, либо дексаметазон, 3-изобутил-1-метилксантин и индометацин в случае адипогенной. В контрольных культурах клетки культивировали в стандартной среде. Через 18 суток оценивали эффективность дифференцировки МСК с помощью окраски по von Kossa в первом случае и Oil Red O (Sigma-Aldrich, США) во втором. Маркером остеогенной дифференцировки являлась продукция кальций-содержащего матрикса, окрашиваемого нитратом серебра в черный цвет, адипогенной – появление в цитоплазме клеток липидных вакуолей, окрашиваемых в красный цвет. Полуколичественный метод оценки остеогенного потенциала МСК Для сравнительного анализа выраженности/интенсивности остеогенной дифференцировки МСК нами был разработан полуколичественный метод (Патент 2370771 РФ), основанный на измерении оптической плотности культур МСК в заданном диапазоне 2-х кратно возрастающих клеточных концентраций после их культивирования в остеогенной индукционной среде и окрашивания депозитов кальция по von Kossa. МСК помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета в 2-кратно возрастающей концентрации от 625 до 10 000 клеток/лунку. Через 48 ч в культуральную среду в опытных образцах полностью заменяли на индукционную остеогенную среду. Через 18 сут оценивали эффективность дифференцировки, окрашивая культуры клеток по von Kossa. Интенсивность цветовой реакции оценивали на фотометре Multiskan Ascent (Thermo Electron Corp., Финляндия) при длине волны 492 нм. Интенсивность дифференцировки выражали в виде Индекса Остеогенной Дифференцировки (отношение оптической плотности в опытных образцах к таковой в контрольных). Исследование функциональной активности МСК. Спектр и концентрацию секретируемых биологических медиаторов изучали в супернатантах МСК, полученных в стандартизованных условиях культивирования (50х103 МСК/лунку; 48 ч). Оценивали уровень спонтанной и ЛПС-стимулированной продукции медиаторов (липополисахарид E.coli в дозе 10 мкг/мл; Sigma-Aldrich, США). Определение концентраций цитокинов проводили на анализаторе BioPlex Protein Assay System (BioRad, США) с использованием набора Human Cytokine 17-Plex Panel (IL-1b, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-17, G-CSF, GM-CSF, IFN-γ, MCP-1 (MCAF), MIP-1β, TNF-α). Методом ИФА оценивали содержание эритропоэтина (Pro-Con EPO-HS, Протеиновый контур, Россия), инсулиноподобного фактора роста-1 (IGF-1, Diagnostic System Laboratories, США), основного фактора роста фибробластов (Human FGF basic, Biosource, Бельгия), эпидермального ростового фактора (Pro-Con EGF, Протеиновый контур, Россия), сосудисто-эндотелиального фактора роста (Human VEGF Immunoassay Kit, Invitrogen, США), матричной металлопротеиназы-9 (Human MMP-9, R&D Systems, США) и тканевого ингибитора металлопротеиназ-1 (Human TIMP-1 Immunoassay Kit, Biosource, Бельгия). Влияние МСК на пролиферативный ответ активированных Т-клеток оценивали в анти-CD3-стимулированных культурах МНК и двунаправленной смешанной культуре лимфоцитов (СКЛ). МСК культивировали в течение 24 ч в питательной среде в плоскодонных 96-луночных планшетах. После этого к моносолою МСК добавляли МНК здоровых доноров в различных соотношениях. В случае двунаправленной СКЛ в лунки вносили по 0,1х106 МНК от двух доноров и культивировали в течение 5 сут в среде RPMI-1640 с 10% FCS. Митоген-индуцированный пролиферативный ответ оценивали в 3-суточных культурах МНК доноров, активированных анти-CD3 моноклональными антителами ICO-90 (анти-CD3, «Медбиоспектр», Москва) в концентрации 1 мкг/мл. Интенсивность пролиферации оценивали по включению 3Н-тимидина. Контролем служил уровень пролиферативного ответа МНК в отсутствии МСК. Для изучения роли простагландинов и индоламин-2,3-диоксигеназы (ИДО) в реализации иммуносупрессорной активности МСК использовали индометацин (ингибитор секреции простагландинов), и ингибитор ИДО – 1-метилтриптофан (1-МТ). В экспериментах по изучению влияния МСК на пролиферацию Т-клеток в анти-CD3-стимулированных культурах и в СКЛ, дополнительно оценивали эффект предобработки МСК (45 мин, 370С) индометацином (100 мкг/мл) и 1-МТ (500 мМ). Для изучения возможной роли растворимых молекул HLA-G в реализации иммуносупрессорной активности МСК определили уровень продукции HLA-G в супернатантах цельных культур МСК на этапе их конфлюэнтного роста методом ИФА (sHLA-G ELISA, Exbio, Чехия). Для оценки влияния МСК на экспрессию активационных молекул на Т-лимфоцитах МНК доноров помещали на монослой МСК (в соотношении МНК:МСК=10:1) в RPMI-1640 с 10% FCS, и стимулировали моноклональными анти-CD3-антителами (1 мкг/мл). Через 72 ч собирали неприкрепленные к пластику клетки, и методом проточной цитометрии оценивали относительное количество CD25+ и HLA-DR+ клеток в лимфоцитарном гейте. Контролем служили анти-CD3-стимулированные МНК, культивированные в отсутствии МСК. Для оценки влияния МСК на аллостимуляторную активность ДК, последние генерировали из прилипающей к пластику фракции МНК здоровых доноров по «интерфероновому» протоколу. Моноциты выделяли путем прилипания к пластику МНК. Полученные моноциты культивировали в RPMI-1640 с 10% FCS, дополненной GM-CSF (Sigma, США) и IFN-α (Роферон-А, Roche, Швейцария). Через 48 ч отлипшие от пластика предшественники ДК переносили на монослой МСК в соотношении 1:1. Через 48 ч индуцировали конечное дозревание ДК с помощью ЛПС (10 мкг/мл, LPS E.coli 0114:В4, Sigma, США). Через 24 ч получали популяцию ДК, аллостимуляторную активность которых оценивали в СКЛ при сокультивировании с МНК доноров в соотношении 1:10. Интенсивность пролиферации МНК оценивали на 5 сут по включению 3H-тимидина. Влияние МСК на колониеобразующую активность гемопоэтических предшественников оценивали по количеству эритроидных, гранулоцитарно- макрофагальных и смешанных колоний, полученных в результате 14-дневного культивирования МНК костного мозга в отсутствие/присутствии МСК (1:1 и 1:10) в полужидкой метилцеллюлозной среде МethoCult (Stem Cell Technologies, Канада). Математическую обработку полученных результатов проводили с использованием программы «STATISTICA 8.0». |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Морфофункциональная характеристика мезенхимальных стромальных клеток... Работа выполнена в Федеральном Государственном бюджетном учреждении Государственном научном центре Российской Федерации – Институте... | | Павел Михайлович Влияние моделирования эффектов микрогравитации на... Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Государственном научном центре Российской Федерации – Институте медико-биологических... |
 | Сравнительная характеристика натуральных киллерных клеток человека... Охватывает те же этапы, что и протокол предложенный Хиллом, но компания предлагает использовать свою среду неизвестного пользователю... | | Рабочая учебная программа по дисциплине Изучить морфологические, цито-, биохимические и функциональные особенности клеток крови, особенности картины периферической крови... |
| Клинико-иммунологическая характеристика больных атопическим дерматитом... Учитель истории и обществознания Гусевской средней общеобразовательной школы Бабаева С. В | | Влияние пониженного содержания кислорода на культивируемые мезенхимальные... |
| Приказ Минздрава России от 20. 12. 2012 n 1279н ... | | Отек головного мозга это универсальная реакция мозговой ткани на... Отек мозга может быть местным (фокальным), если развивается, например, в зоне ушиба мозга, в дальнейшем может распространиться на... |
| Феноменология иммунного ответа на т-независимые антигены 2-го типа... В этом плане явились мероприятия, проведенные в 9-11 классах «Нет – наркотикам», «Мы за здоровый образ жизни» с приглашением мед... | | Программа факультативной дисциплины «Аллергология и иммунология» Формирование специальных профессиональных знаний и умений в области клинической иммунологии, аллергологии, необходимых для эффективной... |
| Программа факультативной дисциплины «Аллергология и иммунология» Формирование специальных профессиональных знаний и умений в области клинической иммунологии, аллергологии, необходимых для эффективной... | | Реферат по экономической географии на тему «Сравнительная характеристика... «Сравнительная характеристика Центрального и Северо-Кавказского экономических районов» |
| С троение спинного мозга В сером веществе находятся тела нервных клеток, а в белом — их отростки. В передних рогах серого вещества спинного мозга (в передних... | | Реферат: Циррозы печени Цирроз печени — хронические прогрессирующие заболевания, характеризующиеся поражением как паренхимы, так и стромы органа с дистрофией... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Образовательный стандарт послевузовской профессиональной подготовки врача по специальности «аллергология и иммунология», образовательные... | | Реферат по дисциплине “Международные экономические отношения” Тема:... Тема: Место Северной и Южной Кореи в мировых экономических связях. Сравнительная характеристика |
