МИНИСТЕРСТВО ОБРАЗОВАНИЯ И НАУКИ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
«КАБАРДИНО-БАЛКАРСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
им. Х.М.БЕРБЕКОВА» (КБГУ)
УДК 61
№ госрегистрации 01201064882
Инв. №
УТВЕРЖДАЮ
Ректор, д.т.н.,
профессор
Карамурзов Б.С.
« » 2011 г.
ОТЧЕТ
О НАУЧНО-ИССЛЕДОВАТЕЛЬСКОЙ РАБОТЕ
в рамках федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы
по теме:
«Разработка новых методов индивидуальной коррекции сводно-радикального статуса при бактериальных инфекциях»
(промежуточный, этап № 3)
Наименование этапа: «Экспериментальные исследования факторов персистенции стафилококков. Клинико-лабораторные исследования препаратов с непрямым антибактериальным действием»
Руководитель НИР, заведующий кафедрой микробиологии, вирусологии и иммунологии, д.м.н., профессор
|
__________________
|
З.Ф. Хараева
|
Нальчик 2011
список исполнителей
Руководитель темы
Заведующая кафедрой Микробиологии, вирусологии и иммунологии, д.м.н., профессор
|
12.11.11
|
Хараева З.Ф.
(Реферат, введение, главы 1-9, заключение)
|
Исполнители темы:
|
|
|
Старший научный сотрудник,
НОЦ Прикладная антропология КБГУ, д.б.н., профессор
|
12.11.11
|
Смирнова И.П.
(Главы 2-6)
|
Профессор, кафедра Инфекционные болезни, д.м.н.
|
12.11.11
|
Иванова М. Р.
(Главы 2-6)
|
Старший научный сотрудник, УНИИД, к.б.н.
|
12.11.11
|
Шевченко А. А
(Главы 3-5)
|
Доцент, кафедра Микробиологии, вирусологии и иммунологии, к.б.н.
|
12.11.11
|
Блиева Л. З.
(Главы 5-8)
|
Научный сотрудник, УНИИД, к.б.н.
|
12.11.11
|
Попов П. И. (Главы 7-9)
|
Научный сотрудник, УНИИД, к.б.н.
|
12.11.11
|
Голомазова К. А.
(Главы 8-9)
|
Аспирант кафедры Микробиологии вирусологии и иммунологии
|
12.11.11
|
Мизиева С. М.
(Главы 7-9)
|
Аспирант кафедры Микробиологии вирусологии и иммунологии
|
12.11.11
|
Кузьмицкая Е. Ф.
(Главы 2-4)
|
Аспирант кафедры Инфекционных болезней
|
12.11.11
|
Жемухова Р. Х.
(Главы 2-5)
|
Студент 5 курса медицинского факультета КБГУ.
|
12.11.11
|
Назранов Б. М.
(Главы 4-5)
|
Студентка 5 курса медицинского факультета КБГУ.
|
12.11.11
|
Захохова Д. Р.
(Главы 3-6)
|
Студентка 4 курса Биологического факультета КБГУ.
|
12.11.11
|
Борисова А. А
(Главы 1-2)
|
Студентка 3 курса Биологического факультета КБГУ.
|
12.11.11
|
Макарова М. В.
(Главы 2-3)
|
Нормоконтролер
|
|
Кольченко Е.А.
|
12.11.11
Реферат
Отчет 76 стр., 9 глав, 10 рис., 25 таблиц, 61 источник.
СВОБОДНЫЕ РАДИКАЛЫ, ИММУНОЦИТОКИНЫ, АНТИОКСИДАНТЫ, ФАГОЦИТРАНАЯ АКТИВНОСТЬ, БАКТЕРИАЛЬНЫЕ ИНФЕКЦИИ, СТАФИЛОКОККОВЫЕ ИНФЕКЦИИ, ФАКТОРЫ ПЕРСИСТЕНЦИИ СТАФИЛОКОККОВ.
Одной из основных причин того, что стафилококковые инфекции продолжают оставаться насущной проблемой, является то, что по современным представлениям микроорганизмы становятся резистентными не только к антибиотикам, но и к механизмам иммунитета человека. Клиническими критериями персистенции служат частота хронизации инфекционного процесса, формирование реконвалесцентного бактерионосительства и продолжительность выделения патогена из инфицированных органов и тканей. Патогенность различных штаммов стафилококков тесно коррелирует со степенью индукции бактериальных антирадикальных ферментов, наряду с выявленными антилизоцимной, антикомплементарной и антиинтерфероновой активностями бактерий. Увеличение синтеза и активности бактериальной каталазы тесно связано с выживаемостью стафилококков и других микрооорганизмов в среде с высокой концентрацией перекиси водорода. Напротив, генетически-модифицированные бактерии, утратившие гены, кодирующие белок каталазы, оказывались исключительно чувствительными к бактерицидному действию перекиси водорода. Ясно, что результат борьбы организма хозяина со стафилококком зависит от набора факторов вирулентности, к которым можно отнести и факторы персистенции микроорганизма.
Воздействие на микроорганизм неантибактериальными препаратами, приводящее к повышенной чувствительности бактерий к факторам иммунитета макроорганизма, по-видимому, будет новым перспективным и эффективным направлением в борьбе с инфекционными агентами.
Таким образом, комплексный подход в лечении гнойно-воспалительных заболеваний стафилококковой этиологии, требует внедрения в клиническую практику не только новых хирургических концепций и введения современных препаратов антибиотиков, но и выработки прогностических критериев оценки возможного течения процесса, индивидуальной коррекции иммунитета на разных стадиях развития заболевания, а также современных методов мониторинга и регуляции эффективности проводимого лечения.
Целью исследования на третьем этапе было проведение экспериментальных исследований факторов персистенции стафилококков и клинико-лабораторных исследований препаратов с непрямым антибактериальным действием.
Системный подход в исследовании взаимодействия «нейтрофил-микроорганизм», включающий как изучение антибактериальных механизмов макроорганизма, так и оценку факторов персистенции бактерий, создает предпосылки для открытия новых направлений в раннем прогнозе тяжести течения заболевания и патогенетически обоснованной иммунокоррекции. Полученные результаты доказывают целесообразность учета свободно-радикальной составляющей в патогенезе стафилококковой инфекции, что влечет за собой изменение терапевтического подхода, и помимо использования средств антимикробного воздействия, доказывает необходимость модуляции радикалзависимого воспалительного ответа организма.
Проведено экспериментальное и клиническое исследование эффективности «фитопрепарата на основе ферментированной папайи», обладающего антикаталазным эффектом. Клиническая эффективность местного применения препарата показана в группах больных с лакунарной ангиной и одонтогенными флегмонами.
Проведено клинико-лабораторное исследование эффективности комплексной терапии с подключением выбранного препарата пациентов со стафилококковой инфекцией.
Основные выводы по третьему этапу работ следующие:
При оценке роли факторов персистенции (антилизоцимная, антикомплементрная, антиинтерфероновая, каталазная, супероксид дисмутазная активности), влияющих на устойчивость штаммов Staphylococcusaureus при фагоцитозе нейтрофилами, выявлено, что основным защитным фактором бактерий в процессе фагоцитоза является продукция каталазы.
Эффективность предстимулирующего действия препаратов иммуноцитокинов (ИЛ-1β, ИФН-γ, естественный комплекс цитокинов) на процесс внутриклеточного киллинга стафилококков нейтрофилами зависит от каталазной активности штаммов Staphylococcusaureus: активирующее действие иммуноцитокинов на фагоциты проявляется только на каталазнеактивных штаммах.
Антиоксидантный фитопрепарат – ферментированная папайя увеличивает эффективность внутриклеточного киллинга стафилококков нейтрофилами, как больных, так и здоровых лиц, за счет способности снижать активность бактериальной каталазы. Антибактериальные свойства фитопрепарата являются основой для эффективного его применения при локальных гнойно-воспалительных процессах.
Содержание
Введение 8
Глава 1 Исследование активности факторов персистенции штаммов Staphylococcusaureus – возбудителей инфекционных заболеваний разной степени тяжести и различной локализации: антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной активности 10
1.1 Лабораторные и клинические методы исследования 11
1.2 Исследование активности факторов персистенции штаммов Staphylococcusaureus – возбудителей инфекционных заболеваний разной степени тяжести и различной локализации: антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной активности 22
Глава 2 Изучение антиоксидантных свойств штаммов Staphylococcusaureus в процессе взаимодействия бактерий с лейкоцитом (факторы устойчивости к кислородзависимому механизму фагоцитоза) 27
Глава 3 Исследование роли антиоксидантных свойств штаммов Staphylococcusaureus в процессе взаимодействия бактерий с лейкоцитом (факторы устойчивости к кислородзависимому механизму фагоцитоза) 31
Глава 4 Выявление корреляционных связей между выраженностью факторов персистенции бактериальных штаммов и выживаемостью микроорганизмов в процессе внутриклеточного киллинга 33
Глава 5 Исследование влияния цитокинов на эффективность внутриклеточного киллинга бактериальных штаммов с разной каталазной активностью 34
Глава 6 Подбор препаратов на натуральной основе с непрямым антибактериальным действием, снижающих персистентный потенциал бактерий (оценка люминолзависимой и люцигенинзависимой хемилюминесценции в модельных бесклеточных системах in vitro, влияние обработки препаратами на натуральной основе на эффективность внутриклеточногокиллинга) 36
Глава 7 Оценка влияния выбранных препаратов на внутриклеточный киллинг штаммов с различным антиоксидантным потенциалом 39
Глава 8 Определение эффективности фагоцитоза обработанных фитопрепаратом штаммов Staphylococcusaureus предстимулированными иммуноцитокинами нейтрофилами 40
Глава 9 Клинико-лабораторное исследование влияние выбранных препаратов, снижающих активность бактериальной каталазы, у больных с инфекционными заболеваниями стафилококковой этиологии 43
9.1 Клиническая характеристика эффективности терапии «фитопрепаратом на основе ферментированной папайи» больных острой лакунарной ангиной 43
9.2 Клинико-лабораторное исследование эффективности терапии препаратом «БиоРекс» больных одонтогенными флегмонами 46
Заключение 64
Список использованных источников 71
Введение
Золотистый стафилококк остается одним из приоритетных возбудителей инфекций различной степени тяжести у госпитальных и у амбулаторных больных. По сведениям Национальной комиссии по контролю за инфекционными заболеваниями (NNIS, США), S. aureus является причиной развития 12% всех нозокомиальных инфекций в США, 19% послеоперационных раневых инфекций, 16% ангиогенных инфекций, 20% пневмоний [1,2]. В ходе исследования, проведенного в клинике факультетской хирургии им. С.И. Спасокукоцкого Российского Государственного медицинского университета в 2002-2005 гг., установлено, что S. aureus является наиболее частым возбудителем внутрибольничных инфекций у больных отделений реанимации и интенсивной терапии хирургического профиля. На долю золотистого стафилококка приходится более 70% случаев ангиогенного инфицирования у хирургических больных [2].
Кроме того, с 2000 г. зарегистрирована новая волна увеличения количества пациентов с инфекционными заболеваниями, вызванными S.aureus, причиной которых, по-видимому, является снижение популяционного иммунитета жителей Российской Федерации.
Особую значимость исследованиям методов борьбы со стафилококковыми инфекциями придают 2 фактора: 1. выраженный антибиотикорезистентный потенциал штаммов стафилококков; 2. устойчивость бактерий к иммунным механизмам. В 1999-2002 гг. в рамках Европейской системы наблюдения за антибиотикорезистентностью (EARSS) исследовали распространенность метициллинрезистентных штаммов в разных странах и частоту резистентности к метициллину внутри каждой из стран [3].
Изучили 50759 штаммов золотистого стафилококка, выделенных из крови у пациентов 495 лечебных учреждений в 26 странах. Из всех выделенных штаммов 35% оказались резистентными к метициллину. Повсеместное широкое распространение полирезистентных стафилококков свидетельствует о необходимости поиска новых методов воздействия, как на микроорганизм, так и на основные патогенетические звенья защиты макроорганизма.
Основными неспецифическими клетками-эффекторами в защите от бактериальных инфекционных агентов, в том числе стафилококков, являются полиморфноядерные лейкоциты [4,5,6].
В последнее время нарушение функциональной активности нейтрофилов и цитокинового баланса организма рассматривается как причины и как следствие тяжелой гнойной инфекции и сепсиса [7,8,9,10,11].
Понимание причин неэффективности работы фагоцитарного звена при различных формах инфекционного процесса открывает возможность коррекции иммунодефицита. Одной из причин явлений незавершенного фагоцитоза является высокий персистентный потенциал бактерий.
Описаны следующие виды факторов персистенции: антилизоцимная активность, антиинтерфероновая активность, антикомплементарная активность [12]. С другой стороны известно, что ряд штаммов стафилококков обладают выраженной антиоксидантной активностью и способны синтезировать каталазу и супероксиддисмутазу [12]. Перспективным является разработка новых методических подходов поиска лекарственных препаратов, мишенью действия которых будут факторы персистенции, что определяет особую значимость данной темы исследования.
Целью исследования на третьем этапе было проведение экспериментальных исследований факторов персистенции стафилококков и клинико-лабораторных исследований препаратов с непрямым антибактериальным действием.
Глава 1 Исследование активности факторов персистенции штаммов Staphylococcusaureus – возбудителей инфекционных заболеваний разной степени тяжести и различной локализации: антилизоцимной, антиинтерфероновой, антикомплементарной активности
1.1 Лабораторные и клинические методы исследования
Методы изучения свойств штаммов Staphylococcusaureus
Характеристика выделенных штаммов Staphylococcusaureus
В работе использован 201 штамм Staphylococcusaureus – возбудители локальных и генерализованной форм инфекций (таблица 1). Штаммы выделены из разных источников при посеве на микрофлору (мазок с миндалин, раневое отделяемое, кровь). Выделение бактерий из исследуемого материала и их идентификацию производили общепринятыми методами бактериологического исследования [Меньшиков, приказ № 535, 1985]. Хранили в пробирках с полужидким агаром при 6 0С с пересеиванием каждый месяц. Для работы использовали суспензии бактерий в 0.9% растворе NaCl с оптической плотностью А510 0.2, что соответствует концентрации 1.5х109кл\мл.
Таблица 1 - Распределение штаммов Staphylococcusaureus по источникам выделения.
Источник выделения
|
Количество штаммов
|
1. зев
|
75
|
2. раневое отделяемое
|
104
|
3. кровь
|
22
|
Всего:
|
201
|
Определение факторов персистенции штаммов Staphylococcusaureus.
Определение антилизоцимной активности. Антилизоцимная активность (АЛА) бактерий изучалась по методу Бухарина О.В.. К 1.5% питательному агару добавляли лизоцим в разведении 1 до 7мкг/мл и разливали в чашки Петри. После застывания и подсушивания на поверхность среды наносили суточную культуру исследуемого штамма. Чашки инкубировали 24 часа при 370С. Выросшие колонии убивали парами хлороформа (20-25 минут), а затем на поверхность заливают слой питательного агара (3-4мл) с 0.2мл 1 млн. взвеси суточной агаровой культуры Micrococcuslutensvar. lysodeiticusN2665 и инкубировали 24 часа 370С. Учет опыта проводился по наличию роста Micrococcuslutens. Тест-культура вырастает вокруг колоний тех штаммов, которые нейтрализуют внесенный в среду лизоцим. Для оценки уровня АЛА были приняты следующие критерии: низкий уровень АЛА –1-2мкг/мл, средний –3-5мкг/мл, высокий – свыше 5 мкг/мл.
Определение антикомплементарной активности. Антикомплементарная активность (АКА) бактерий изучалась по методу Бухарина О.В.. На поверхность 1.5% питательного агара наносили суточную культуру исследуемого штамма. Чашки инкубировали 24 часа при 370С. Выросшие колонии убивали парами хлороформа (20-25 минут), а затем на поверхность заливают слой питательного агара (3-4мл) с добавлением комплемента (50ед/мл, 25ед/мл и 12.5ед/мл).
Чашки инкубируют 24 часа. Затем чашки заливали третьим слоем, содержащим 0.1мл 1млн взвеси суточной агаровой культуры E.coli 212 и инкубировали 24 часа 370С. Учет опыта проводился по наличию роста E.coli 212. Тест-культура вырастает вокруг колоний тех штаммов, которые нейтрализуют внесенный в среду комплемент.
Определение антиинтерфероновой активности. Антиинтерфероновая активность (АИА) бактерий изучалась по методу Бухарина О.В.. К 1.5% питательному агару добавляли препарат «интерцид» (Россия), представляющий антибактериальную составляющую интерферона в разведении 1/60-1/40 и разливали в чашки Петри.
После застывания и подсушивания на поверхность среды наносили суточную культуру исследуемого штамма. Чашки инкубировали 24 часа при 370С. Выросшие колонии убивали парами хлороформа (20-25 минут), а затем на поверхность заливали слой питательного агара (3-4мл) с 0.2мл 1млн взвеси суточной агаровой культуры Corynebacteriumxerosis 181 и инкубировали 24 часа 370С. Учет опыта проводился по наличию роста Corynebacteriumxerosis 181. Тест-культура вырастает вокруг колоний тех штаммов, которые нейтрализуют внесенный в среду интерферон.
Определение каталазной активности штаммов Staphylococcusaureus. Активность каталазы штаммов Staphylococcusaureus определяли по методике Бухарина О.В. с соавтор. К 0.2 мл взвеси Staphylococcusaureus, стандартизованной до оптической плотности 0.2 усл. ед., добавляли 1 мл свежеприготовленного 0.0125 М раствора Н2О2 и инкубировали 10 мин при комнатной температуре. Реакцию разложения Н2О2 каталазой бактерий останавливали добавлением 20 мкл2Н раствора HCl.
Затем добавляли 0.5 мл свежеприготовленного 0.025М раствора KI, тщательно перемешивали и осаждали клетки Staphylococcusaureus центрифугированием в течение 15 минут при 3000 g после чего измеряли оптическую плотность не позднее чем через 10 минут после центрифугирования.
Активность каталазы бактерий оценивали по калибровочной кривой, полученной с использованием коммерческого препарата каталазы («Sigma»,USA).
В ряде экспериментов бактериальные культуры обрабатывали препаратом БиоРекс, и затем оценивали каталазную активность микроорганизмов. Обработку проводили следующим способом: к 1 мл суспензии клеток (1,5х109кл/мл) добавляли 1 мл 0,9% раствора БиоРекс (100мг/мл) и инкубировали при 37оС в течение 1 часа.
Затем бактерии трижды промывали 10-кратным объемом NaCl и использовали для дальнейших анализов. Контролем служили бактериальные культуры, необработанные препаратом.
Определение супероксид дисмутазной активности штаммов Staphylococcusaureus. Для определения супероксид дисмутазной активности штаммов Staphylococcusaureus использовали метод, основанный на образовании адренохрома при автоокислении адреналина 13. Автоокисление адреналина регистировали по образованию адренохрома при 480 нм. Стандартные определения проводили в 3 мл 0.05М Na-карбонатного буфера (рН 10.2), содержащего 10-4 М ЭДТА («Sigma»,USA), 50 мкл суспензии бактерий, доведенной до оптической плотности 0.2 (соответствует 1.5 млнкл/мл) или раствора коммерческой СОД («Sigma»,USA), в сантиметровой кювете, термостатируемой при 250С.
Реакцию начинали добавлением 50 мкл 10-2М раствора адреналина («Sigma»,USA). Пробы непрерывно спектрофотометрировали при 480 нм в течение 3 минут при комнатной температуре.
Активность СОД (ед. акт.) штаммов Staphylococcusaureus оценивали по калибровочной кривой, полученной с использованием коммерческого препарата СОД, с учетом разведений всех образцов.
Определение влияния Staphylococcusaureus на образование радикалов в модельной системе Фентона.
Хемилюминесцентным (ХЛ) методом. Реакцию Фентона проводили в 0.01М К-фосфатном буфере (рН 7.4) при комнатной температуре; объем реакционной смеси составлял 1 мл.
В работе использовали два варианта проведения реакции: в первом случае в реакционную смесь, содержащую FeSO4, впрыскивали через диспенсер раствор перекиси водорода; во втором случае реакционная смесь содержала Н2О2, а раствор FeSO4 впрыскивали через диспенсер. При измерении люминольной ХЛ реакционная смесь содержала люминол (50мкМ) и Н2О2 (75мкМ) и FeSO4 (0.5мМ).
При исследовании эффектов Staphylococcusaureus в реакционную смесь, содержащую 0.01М фосфатный буфер, люминол (50мкМ) и Н2О2 (75мкМ), добавляли 50 мкл суспензии стафилококков оптической плотности 0.2 и инкубировали 0.5-15 минут при 25 0С, после чего добавляли FeSO4 (0.5мМ) и измеряли амплитуду ХЛ ответа. В отдельном эксперименте проводили прединкубацию Staphylococcusaureus в реакционной смеси, содержащей FeSO4, а реакцию запускали Н2О2.
Электроннопарамагнитнорезонансным (ЭПР) методом. Спектры ЭПР регистрировали на радиоспектрометре JEOLLFR-30 FreeRadicalAnalyzer (Japan), со строенным компьютером, контролирующим режим измерения и производящим обработку результатов.
Условия измерения: СВЧ0мощность 4мВт, ширина развертки 4мТ, амплитуда сигнала 100, время сканирования 2 минуты, постоянная времени 0.1с., температура внутри резонатора 300К.
Интенсивность сигнала оценивали по интегральной площади спектра поглощения относительно внутреннего стандарта (соль марганца), дающего сигнал постоянной интенсивности.
В качестве спиновой ловушки гидроксильных радикалов в реакции Фентона использовали ДМПО (5,5 диметилпирролин-N-оксид). Кювета ЭПР-спектрометра объемом 200мкл содержала: 0.01М калий-фосфатный буфер –186мкл, 0.1мМ FeSO4 – 5 мкл, ДМПО –1мкл, 0.6 мМ Н2О2 –8мкл, добавленных в указанной последовательности (важно, чтобы ДМПО был добавлен до начала реакции). Далее помещали кювету в резонатор и производили сканирование образца.
Для изучения влияния стафилококков на сигнал ЭПР в системе Фентона в кювету спектрометра перед запуском реакции добавляли бактериальную суспензию (как описано при измерении ХЛ), после чего производили запись спектра ЭПР. Полученные данные выражали в процентах по отношению к контрольным пробам.
Определение фагоцитарной активности нейтрофилов больных и здоровых доноров.
Фагоцитарную активность нейтрофилов оценивали стандартным методом в отношении бактерий Staphylococcusaureus, выделенных у каждого больного. Для этого смешивали 1 мл суспензии нейтрофилов и 1 мл взвеси бактерий (107кл) в растворе Хенкса (рН 7.4).
Смесь инкубировали при помешивании 30 мин при 370С. Приготавливали мазки на стекле, фиксировали и окрашивали по Романовскому-Гимзе.
В мазках на 100 клеток подсчитывали количество фагоцитирующих макрофагов. Полученные данные выражали в виде фагоцитарного индекса и фагоцитарного числа.
Определение эффективности внутриклеточного киллинга нейтрофилами бактерий. Оценку эффективности внутриклеточного киллинга оценивали по методу Nilsen 14.
После постановки фагоцитарной реакции (см. выше) взвесь центрифугировали 10 минут при 1500g, отбирали осадок, добавляли трехкратный объем Н2О и производили высев по методу Гольда на чашку Петри с мясо-пептонным агаром.
Число выживших после фагоцитоза бактерий определяли по количеству колоний в секторах через 24 часа.
Для оценки влияния препарата Биорекс на фагоцитарные реакции бактериальные культуры обрабатывали по следующей методике: к 1 мл суспензии клеток (1,5х109кл/мл) добавляли 1 мл 0,9% раствора БиоРекс (100мг/мл) и инкубировали при 37оС в течение 1 часа.
Затем бактерии трижды промывали 10-кратным объемом NaCl и использовали для дальнейших анализов - оценки фагоцитарной активности и эффективности внутриклеточного киллинга бактерий лейкоцитами больных и здоровых доноров.
Контрольные эксперименты проводились с бактериями, необработанными Биорексом.
Для оценки влияния иммуноцитокинов на фагоцитарные реакции использовали предстимулированные нейтрофилы (IFNγ 150мЕ/мл, IL-1β 100 мЕ/мл или «Суперлимф» 10мкг/мл).
Для изучения процессов предстимуляции нейтрофилы (107кл/мл) инкубировали в растворе Хенкса (рН 7.4) без фенолового красного, содержащем 150мЕ/мл интерферона- (ИНФ-), 100 мЕ\мл интерлейкина-1β (ИЛ-1β) или «Суперлимфа», а (10мкг/мл) в течение 3 часов при 37 0С. Клетки дважды отмывали раствором Хенкса и подсчитывали, оценивая их жизнеспособность с помощью окраски трипановым синим.
При изучении эффекта предстимуляции контролем служили клетки, инкубировавшиеся в растворе Хенкса 3 часа при 370С без иммуноцитокинов. Определение прямого антимикробного действия иммуноцитокинов на бактерии.
Прямое действие иммуноцитокинов на штаммы Staphylococcusaureus оценивали, подсчитывая число колоний суточного роста контрольной и смешанной с цитокином (ИЛ-1 100МЕ/мл, ИНФ- 150МЕ/мл, «Суперлимф» 10мкг/мл) суспензий бактериальных клеток.
Клинические методы исследования эффективности лечения больных препаратом БИОРЕКС.
Характеристика групп больных.
Для исследования эффективности лечения препаратом БиоРекс под нашим наблюдением находилось 4 группы больных (таблица 2):
1 группа – 15 больных с лакунарной ангиной стрептококко-стафилококковой этиологии средней степени тяжести, получавших локальную терапию БиоРексом сочетано с традиционной дезинтоксикационной и антибиотической терапией (группа Фитопрепарат 1).
2 группа – 15 больных с лакунарной ангиной стрептококко-стафилококковой этиологии, получавших традиционную терапию (группа контроль 1).
3 группа – 15 больных с одонтогенными флегмонами стафилококкового генеза средней степени тяжести, получавших локальную терапию БиоРексом сочетано с традиционной дезинтоксикационной и антибиотической терапией (группа БиоРекс).
4 группа -15 больных с одонтогенными флегмонами стафилококкового генеза, получавших традиционную терапию (группа Плацебо БиоРекс).
Способ применения препарата.
Препарат БиоРекс наносился местно 2 раза в сутки в течение недели совместно с традиционной терапией.
В группе больных ангинами препарат наносился на миндалины при местной обработке.
Таблица 2 - Распределение групп больных, участвующих в клиническом эксперименте по оценке эффективности препарата БИОРЕКС, по полу и возрасту.
Возраст
|
Группа фитопрепарат 1
|
Группа контроль1
|
группа БиоРекс
|
Группа плацебо БиоРекс
|
муж
|
жен
|
муж
|
жен
|
муж
|
жен
|
муж
|
Жен
|
От 20 до 40
|
4
|
3
|
5
|
4
|
3
|
6
|
5
|
3
|
От 40 до 60
|
4
|
5
|
2
|
4
|
3
|
3
|
2
|
5
|
Всего
|
8
|
7
|
7
|
8
|
6
|
9
|
7
|
8
|
В группе больных с флегмонами препарат наносился местно под повязку. Переносимость препарата оценивалась по отсутствию местной и системной реакций у больных в период лечения и в более отдаленные сроки.
Клинические методы оценки эффективности действия препарата БИОРЕКС на воспалительный процесс в ткани миндалин при лакунарной ангине.
Клинически у больных групп «фитопрепарат», «контроль 1» оценка воспалительного процесса в ткани миндалин при лакунарной ангине производилась по следующим критериям: размер миндалин, содержимое лакун, выраженность отечности дужек и язычка, гиперемия миндалин и глотки.
В клинической оценке состояния больного также учитывали общие симптомы интоксикации и субъективные ощущения больного, такие как температурная реакция, выраженность болевого синдрома, общее самочувствие (см. пример карты).
Клиническую эффективность терапии оценивали в 3-балльной системе по выраженности симптомов активности воспалительного процесса в ткани миндалин (таблица 3).
Эффект препаратов считался выраженным при купировании признаков локального воспаления в миндалинах до 4-5 баллов, умеренным до 6 баллов, отсутствующим – до 7-8 баллов.
Таблица 3 - Оценка выраженности воспалительного процесса в ткани миндалин (в баллах).
Показатель
|
Баллы
|
3
|
2
|
1
|
Размер миндалин
|
Увеличение 3 степени
|
Увеличение 2 степени
|
Увеличение 1 степени
|
Гиперемия слизистой оболочки ротовой частей глотки, миндалин
|
Выраженная
|
Умеренная
|
Незначительная или отсутствует
|
Отечность дужек, язычка
|
Выраженная
|
Умеренная
|
Незначительная или отсутствует
|
Содержимое лакун
|
Наличие казеозных пробок
|
Слизистое-гнойное
|
Слизистое или отсутствует
|
Пример используемой карты при клиническом испытании действия препаратов на воспалительный процесс в ткани миндалин при лакунарной ангине
Первый день испытаний
Клинические симптомы
|
Степень выраженности
|
+\-
|
Местные клинические симптомы
|
Размер миндалин
|
Увеличение 1 степени
|
|
Увеличение 2 степени
|
|
Увеличение 3 степени
|
|
Содержимое лакун
|
Слизистое\отсутствует
|
|
Слизисто-гнойное
|
|
Наличие казеозных пробок
|
|
Выраженность отека дужек, язычка
|
Слабовыраженный
|
|
Умеренный
|
|
Интенсивный
|
|
Гимеремия ротовой части гллотки, миндалин
|
Незначительная
|
|
Умеренная
|
|
Выраженная
|
|
Общие клинические симптомы
|
Температура тела ,0С
|
Менее 37.4
|
|
37.5-38.0
|
|
Более 38.0
|
|
Болевой синдром
|
Слабовыраженный
|
|
Умеренный
|
|
Интенсивный
|
|
Выраженность интоксикации
|
Слабовыраженная
|
|
Умеренная
|
|
Интенсивная
|
| |
