Государственный стандарт качества лекарственного средства общая фармакопейная статья
Скачать 140.63 Kb.
|
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННОГО СРЕДСТВА ОБЩАЯ ФАРМАКОПЕЙНАЯ СТАТЬЯ Спектроскопия ядерного ОФС магнитного резонанса Взамен ст. ГФ XII, ч.1, ОФС 42-0046-07 Спектроскопия ядерного магнитного резонанса (ЯМР-спектроскопия) – метод, основанный на поглощении радиочастотного электромагнитного излучения ядрами образца с ненулевым магнитным моментом, помещенного в постоянное магнитное поле (B0). Ненулевые магнитные моменты имеют изотопы ядер элементов с нечетной атомной массой (1H, 13C, 15N, 31P, 19F и др.). Общие принципы. Вращающееся вокруг своей оси ядро имеет собственный момент количества движения (угловой момент, или спин) P. Магнитный момент ядра μ прямо пропорционален спину: μ = γP (γ – коэффициент пропорциональности или гиромагнитное отношение). Угловой и магнитный моменты являются квантованными, т.е. могут находиться в одном из 2I+1 спиновых состояний (I – спиновое квантовое число). Различные состояния магнитных моментов ядер обладают одинаковой энергией, если на них не действует внешнее магнитное поле. При помещении ядер во внешнее магнитное поле B0 энергетическое вырождение ядер снимается и возникает возможность энергетического перехода с одного уровня на другой. Процесс распределения ядер между различными энергетическими уровнями протекает в соответствии с законом распределения Больцмана и приводит к появлению макроскопической равновесной продольной намагниченности Мz. Время, которое требуется для создания Мz после включения внешнего магнитного поля В0, называется временем продольной или спин-решеточной релаксации (Т1). Нарушение равновесного распределения ядер происходит под действием радиочастотного магнитного поля (B1), перпендикулярного B0, которое вызывает дополнительные переходы между энергетическими уровнями, сопровождающиеся поглощением энергии (явление ядерного магнитного резонанса). Частота ν0, при которой возникает поглощение энергии ядрами (Ларморова или резонансная частота поглощения), изменяется в зависимости от величины постоянного поля B0: ν0 = γB0/2π. В момент резонанса происходит взаимодействие между индивидуальными ядерными магнитными моментами и полем В1, которое выводит вектор Мz из его равновесного положения вдоль оси z. В результате появляется поперечная намагниченность Мxy. Ее изменение, связанное с обменом внутри спиновой системы, характеризуется временем поперечной или спин-спиновой релаксации (Т2). Зависимость интенсивности поглощения энергии ядрами одного типа от частоты радиочастотного магнитного поля при фиксированном значении В0 называется одномерным спектром ЯМР ядра данного типа. Спектр ЯМР может быть получен двумя способами: при непрерывном облучении образца радиочастотным полем с изменяющейся частотой, в результате чего регистрируется непосредственно спектр ЯМР (спектроскопия с непрерывным облучением), или при воздействии на образец короткого радиочастотного импульса (импульсная спектроскопия). В импульсной ЯМР-спектроскопии регистрируется затухающее во времени когерентное излучение, испускаемое ядрами при возвращении в исходное спиновое состояние (сигнал спада свободной индукции, ССИ) с последующим преобразованием временной шкалы в частотную (Фурье-преобразование). В молекулах электроны атомов уменьшают величину действующего внешнего магнитного поля B0 в месте нахождения ядра, т.е. проявляется диамагнитное экранирование: Bлок = B0 X (1 – σ), где Bлок – напряженность результирующего поля; σ – константа экранирования. Разница в резонансных частотах сигналов ядер, равная разнице в их константах экранирования, называется химическим сдвигом сигналов, обозначается символом – δ, измеряется в миллионных долях, м.д. Взаимодействие магнитных моментов ядер через посредство электронов химической связи (спин-спиновое взаимодействие) вызывает расщепление сигнала ядерно-магнитного резонанса (мультиплетность, m). Количество компонент в мультиплетах определяется спином ядра и количеством взаимодействующих ядер. Мерой спин-спинового взаимодействия является константа спин-спинового взаимодействия (J, измеряется в герцах). Значения δ, m и J не зависят от величины постоянного магнитного поля. Интенсивность сигнала ЯМР ядра в спектре определяется заселенностью его энергетических уровней: N–/N+ = exp(–μB0/IkT), где: N– и N+ – количество ядер на верхнем и нижнем энергетических уровнях; k – постоянная Больцмана, μ – магнитный момент ядра, T – абсолютная температура, I – спин ядра. Из ядер с естественным содержанием изотопов наиболее интенсивные сигналы дают ядра водорода. На интенсивность сигналов ЯМР также влияет время продольно-поперечной релаксации (большие Т1 ведут к уменьшению интенсивности сигнала). Ширина сигналов ЯМР (разница между частотами на полувысоте сигнала) зависит от Т1 и Т2. Малые времена T1 и Т2 обуславливают широкие и мало интерпретируемые сигналы спектра. Чувствительность метода ЯМР (предельно обнаруживаемая концентрация вещества) зависит от интенсивности сигнала ядра. Для метода протонного магнитного резонанса (ПМР) чувствительность составляет 10-9 ÷ 10-11 моль. Источником повышения чувствительности на ядрах со спином ½ является ядерный эффект Оверхаузера (ЯЭО, NOE), который представляет собой изменение интенсивности одного сигнала при возбуждении другого (устранение разности заселенности его уровней при облучении слабым радиочастотным полем). Источником ЯЭО является диполь-дипольное взаимодействие ядер. Корреляции различных спектральных параметров (например, химических сдвигов различных ядер в пределах одной молекулярной системы) могут быть получены гомо- и гетеро-ядерными методами в формате 2D или 3D. Прибор. В настоящее время используются широкополосные импульсные ЯМР-спектрометры, которые позволяют получать спектры практически всех элементов периодической системы. Требования к рабочей частоте ЯМР-спектрометра приводятся в фармакопейных статьях. Импульсный ЯМР-спектрометр с высокой разрешающей способностью состоит из:
и может также включать:
Сильное магнитное поле генерируется катушкой сверхпроводимости в сосуде Дьюара, заполненного жидким гелием. Следует проверять надлежащее функционирование ЯМР-спектрометра. Для проверки используются соответствующие испытания, включающие, как правило, измерение ширины спектральной линии на полувысоте определенных пиков при определенных условиях (разрешение), воспроизводимость положения сигнала и отношение сигнал/шум S/N (отношение между интенсивностью определенного сигнала в ЯМР-спектре и случайных колебаний в области спектра, не содержащего сигналов от определяемого вещества) для стандартных смесей. В программном обеспечении современных спектрометров имеются алгоритмы по определению S/N. Все изготовители приборов предоставляют спецификации и протоколы измерения этих параметров. ЯМР-спектометрия образцов в растворах Методика. Испытуемый образец растворяют в растворителе, к которому может быть добавлен соответствующий эталон для калибровки химического сдвига, как указано в фармакопейной статье. Величина относительного химического сдвига ядра вещества (δв-во) определяется следующим выражением: δв-во = (νв-во – νэталон)/νприбора, где νв-во – частота резонанса ядра вещества, Гц; νэталон – частота резонанса ядра эталона, Гц; νприбора – рабочая частота ЯМР-спектрометра (частота, на которой выполняются условия резонанса для ядер водорода при данном B0, МГц). Для растворов в органических растворителях химический сдвиг в спектрах 1H и 13C измеряется относительно сигнала тетраметилсилана (ТМС), положение которого принято за 0 м.д. Отсчет химических сдвигов ведется в сторону слабого поля (влево) от сигнала тетраметилсилана (дельта - шкала химических сдвигов). Для водных растворов в качестве эталона в спектрах ЯМР 1H используется 2,2-диметил-2-силапентан-5-сульфонат натрия (ДСС), химический сдвиг протонов метильной группы которого равен 0,015 м.д. Для спектров 13C водных растворов в качестве эталона используют диоксан (ДО), химический сдвиг которого равен 67,4 м.д. При калибровке спектров 19F в качестве первичного эталона с нулевым значением химического сдвига используют трифторуксусную кислоту или трихлорфторметан; спектров 31P – 85 % раствор ортофосфорной кислоты или триметилфосфат; спектров 15N – нитрометан либо насыщенный раствор аммиака. В 1Н и13С ЯМР, как правило, используют внутренний эталон, который непосредственно прибавляют к испытуемому образцу. В 15N, 19F и 31Р ЯМР, часто используют внешний эталон, который находится отдельно в коаксиальной цилиндрической пробирке или капилляре. При описании спектров необходимо указывать растворитель, в котором растворено вещество, и его концентрацию. В качестве растворителей используют легкоподвижные жидкости, в которых для уменьшения интенсивности сигналов растворителей атомы водорода заменены атомами дейтерия. Дейтерированный растворитель выбирают, исходя из следующих критериев:
Атомы растворителя дают сигналы, которые легко идентифицируются по их химическому сдвигу и могут использоваться для калибровки оси химического сдвига (вторичный эталон). Химические сдвиги (м.д.) сигналов остаточных протонов дейтерированных растворителей имеют следующие значения: хлороформ - 7,26; бензол - 7,16; вода - 4,7; метанол - 3,35 и 4,8; диметилсульфоксид - 2,50; ацетон - 2,05; положение сигнала воды и протонов гидроксильных групп спиртов зависит от pH среды и температуры. Для количественного анализа растворы не должны содержать нерастворенных частиц. При некоторых количественных определениях может потребоваться добавление внутреннего стандарта для сравнения интенсивности испытуемого и стандартного образцов. Соответствующие стандартные образцы и их концентрации указаны в фармакопейных статьях. После помещения образца в пробирку и укупорки, образец вводят в магнит ЯМР установки, устанавливают параметры испытания (параметры настройки, регистрации, оцифровки сигнала ССИ). Основные параметры испытания, приводимые в фармакопейных статьях, записывают или сохраняют в компьютере. Для предотвращения дрейфа спектра во времени выполняют стабилизационную процедуру (дейтериевый лок), используя сигнал 2Н (дейтерия), вызываемый дейтерированными растворителями, если в фармакопейной статье не указано иначе. Прибор регулируют для получения наиболее оптимальных условий резонанса и максимального соотношения S/N (шиммирование). ЯМР-испытание может включать выполнение многократных последовательностей циклов «импульс-сбор данных-пауза» с последующим суммированием отдельных сигналов ССИ и усреднением уровня шума. Время задержки между импульсными последовательностями, в течение которого система ядерных спинов восстанавливает свою намагниченность (D1) для количественных измерений должно превышать время продольной релаксации T1: D1≥5T1. В программном обеспечении современных спектрометров имеются алгоритмы по определению T1. Если величина T1 неизвестна, рекомендуется использовать значение D1=25 c. В случае наблюдения за Х-ядрами стандартное испытание может включать широкополосную протонную развязку, то есть возбуждение всех протонов во время испытания. При количественных измерениях рекомендуется проводить ЯМР-испытание без вращения образца во избежание появления боковых сигналов. После проведения Фурье-преобразования сигналы в частотном представлении калибруют под выбранный эталон и измеряют их относительную интенсивность путем интегрирования – измерения отношения площадей резонансных сигналов. В спектрах 13С интегрируют только однотипные сигналы. Точность интегрирования сигнала зависит от соотношения сигнал: шум (S/N):
где u(I) – стандартная неопределенность интегрирования. Число накоплений ССИ, необходимое для достижения удовлетворительного соотношения S/N, приводят в фармакопейных статьях. При количественных измерениях рекомендовано использовать диапазон интегрирования, равный 64-кратной ширине интегрируемой линии на высоте 99 % от ее максимальной амплитуды и исключать из диапазона интегрирования углеродные сателлиты. Наряду с одномерными в аналитических целях используют гомо- и гетероядерные двумерные корреляционные спектры, основанные на определенной последовательности импульсов (COSY, NOESY, ROESY, HSQC, HMBC, HETCOR, CIGAR, INADEQUATE и др.). В двумерных спектрах взаимодействие между ядрами проявляется в виде сигналов, называемых кросс-пиками. Положение кросс-пиков определяется значениями химических сдвигов двух взаимодействующих ядер. Двумерные спектры предпочтительно использовать для определения состава сложных смесей и экстрактов, т.к. вероятность наложения сигналов (кросс-пиков) в двумерных спектрах существенно ниже, чем вероятность наложения сигналов в одномерных спектрах. Для быстрого получения спектров гетероядер (13C, 15N и др.) применяют методики (HSQC, HMBC), которые позволяют получать на ядрах 1H спектры других ядер, используя механизмы гетероядерного взаимодействия. Методика DOSY, основанная на регистрации потери фазовой когерентности ядерных спинов за счет трансляционных перемещений молекул под действием градиента магнитного поля, позволяет получать спектры индивидуальных соединений (спектральное разделение) в смеси без их физического разделения и определять размеры, степени агрегированности и молекулярные массы молекулярных объектов (молекул, макромолекул, молекулярных комплексов, супрамолекулярных систем). Области применения. Многообразие структурной и аналитической информации, содержащейся в спектрах ЯМР, позволяет использовать метод ЯМР для проведения качественного и количественного анализа. Применение ЯМР-спектроскопии в количественном анализе основано на прямой пропорциональности молярной концентрации магнитно-активных ядер интегральной интенсивности соответствующего сигнала поглощения в спектре. 1. Установление подлинности действующего вещества (ДВ). Установление подлинности ДВ осуществляют путем сравнения спектра испытуемого образца со спектром стандартного образца или с опубликованным стандартным спектром. Спектры стандартных и испытуемых образцов должны быть получены с использованием тех же самых методик и условий. Пики в двух спектрах должны совпадать по положению (отклонения значений δ испытуемого и стандартных образцов в пределах ±0,1 м.д. для ЯМР 1Н и ±0,5 м.д. для ЯМР 13С), интегральной интенсивности и мультиплетности, значения которых следует приводить при описании спектров. При отсутствии стандартного образца можно использовать рабочий стандартный образец, идентичность которого подтверждают самостоятельной структурной интерпретацией спектральных данных и альтернативными методами. При подтверждении подлинности образцов нестехеометрического строения (например, природных полимеров переменного состава) допускают несовпадение пиков испытуемого и стандартных образцов по положению и интегральной интенсивности сигналов. Сравниваемые спектры должны быть подобны, т.е. содержать одинаковые характеристические области сигналов, подтверждающие совпадение фрагментного состава испытуемого и стандартных образцов. Для установления подлинности смеси веществ (экстрактов) допускают использование одномерных спектров ЯМР целиком, как «отпечатков пальца» объекта, без детализации значений δ и мультиплетности отдельных сигналов. В случае использования двумерной ЯМР-спектроскопии при описании спектров (фрагментов спектра), заявленных на подлинность, следует приводить значения кросс-пиков. 2. Идентификация посторонних примесей / остаточных органических растворителей. Идентификацию посторонних примесей (остаточных органических растворителей) осуществляют аналогично установлению подлинности ЛВ, ужесточая требования к чувствительности и цифровому разрешению. При установлении строения примесного соединения, не указанного в фармакопейной статье, проводят самостоятельную интерпретацию спектральных данных. В этом случае структура примесного соединения должна быть подтверждена альтернативными методами. При перекрывании сигналов примесного соединения с сигналами ЛВ в спектре испытуемого образца используют следующие приемы: смена растворителя; изменение температуры регистрации спектра; преобразование лоуренсовой формы линии в гауссову и т.п. 3. Определение содержания посторонних примесей (остаточных органических растворителей) относительно ЛВ. Метод ЯМР является абсолютным методом определения мольного соотношения ЛВ и примесного соединения (nлв/nпримесь):  где S'лв и S'примесь – нормированные значения интегральных интенсивностей ЛВ и примеси. Нормировку проводят по числу ядер в структурном фрагменте, обуславливающих измеряемый сигнал. Стандартная неопределенность количественного измерения мольного соотношения ЛВ и примеси определяется стандартной неопределенностью количественного измерения отношения интегральных интенсивностей сигналов компонентов смеси. Массовую долю примеси (остаточного органического растворителя) относительно ЛВ (Xпр) определяют по формуле:  где: Mпр – молекулярная масса примеси; Mст – молекулярная масса ЛВ; S'пр – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала примеси; S'лв – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала ЛВ. 4. Количественное определение содержания вещества (ЛВ, примеси, остаточного растворителя) в фармацевтической субстанции. Абсолютное содержание вещества в фармацевтической субстанции определяется методом внутреннего стандарта, в качестве которого выбирается вещество, сигналы которого находятся вблизи сигналов определяемого вещества, не перекрываясь с ними. Интенсивности сигналов опредяляемого вещества и стандарта не должны существенно различаться. При выборе вещества-стандарта следует отдавать предпочтение не гигроскопичному, не образующему кристаллосольватов веществу. Процентное абсолютное содержание определяемого вещества в испытуемом образце в пересчете на абсолютно сухое вещество (X %масс) вычисляют по формуле: X %масс= 100 x (S'а /S'ст) x (Mа x mст /Mст x mа) x (100/(100 - W)), где: S' – нормированное значение интегральной интенсивности сигнала; Mа – молекулярная масса определяемого вещества; Mст – молекулярная масса стандарта; mа – навеска испытуемого образца; mст - навеска вещества-стандарта; W – содержание влаги, в процентах. В качестве веществ-стандартов можно использовать следующие вещества: малеиновая кислота (2H; 6,60 м.д., M = 116,07), бензилбензоат (2H; 5,30 м.д., M = 212,25), малоновая кислота (2H; 3,30 м.д., M = 104,03), сукцинимид (4H; 2,77 м.д., M = 99,09), ацетанилид (3H; 2,12 м.д., M = 135,16), трет-бутанол (9H; 1,30 м.д., M = 74,12). Относительное содержание вещества в фармацевтической субстанции определяется методом внутренней нормализации, как доля компонента в смеси компонентов. Мольная (Xмоль) и массовая (Xмасс) доля компонента i в смеси n веществ определяется по формулам:
Методика определения относительного содержания вещества в фармацевтической субстанции должна быть валидирована в отношении отсутствия наложения соответствующих сигналов. 5. Определение молекулярной массы белков и полимеров. Молекулярные массы белков и полимеров определяют сравнением их подвижности с подвижностью соединений-стандартов с известной молекулярной массой, используя методики DOSY. Измеряют коэффициенты самодиффузии (D) испытуемых и стандартных образцов, строят график зависимости логарифмов молекулярных масс соединений-стандартов от логарифмов D. По полученному таким образом графику методом линейной регрессии определяют неизвестные молекулярные массы испытуемых образцов. Полное описание DOSY-испытания приводится в фармакопейной статье. ЯМР спектрометрия твердых веществ Образцы в твердом состоянии анализируют с помощью специально оборудованных ЯМР спектрометров. Определенные технические операции (вращение порошкообразного образца в роторе, наклоненном под магическим углом (54,7°) к оси магнитного поля В0, силовое распаривание, перенос поляризации от легковозбудимых ядер к менее поляризуемым ядрам – кросс-поляризация) позволяют получать спектры органических и неорганических соединений с высокой разрешающей способностью. Полное описание процедуры приводится в фармакопейной статье. Основная область применения данной разновидности ЯМР спектроскопии – изучение полиморфизма твёрдых лекарственных средств. | ||||||
,
и 
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Министерство здравоохранения российской федерации государственный... ... | | Государственный стандарт качества лекарственного средства общая фармакопейная статья Этот процесс реализуется перед вторым масс-анализатором, при помощи которого анализируют продукты распада (дочерние ионы) |
| Государственный стандарт качества лекарственного средства общая фармакопейная статья Успешное выполнение многих фармакопейных испытаний и методик количественного и качественного анализа требуют регулирования или поддержания... | | Государственный стандарт качества лекарственного средства общая фармакопейная статья Агар. Пористые пластины толщиной не более 20 мм или пленки толщиной не более 0,5 мм белого или светло-желтого цвета; допускается... |
| Государственный стандарт качества лекарственного средства фармакопейная статья Вакцина состоит из живых микобактерий вакцинного штамма бцж Mycobacterium bovis, cубштамм bcg-1 (Russia), лиофилизированных в 1,5... | | Государственный стандарт качества лекарственного средства фармакопейная... Сыворотка против яда змеи гадюки лошадиная представляет собой иммуноглобулиновую фракцию сыворотки лошади, содержащую специфические... |
| Государственный стандарт качества лекарственных средств общая фармакопейная статья В зависимости от источника происхождения различают масла жирные растительного происхождения (растительные жирные масла) и масла жирные... |  | Инструкция по применению ксенона (29) и защищена Фармакопейная статья... Ректор Академик го дпо рамн л. К. Мошетова), кафедра анестезиологии и реаниматологии (зав каф проф. И. В. Молчанов) |
| Оригинал Translation Настоящая общая фармакопейная статья распространяется на жидкие лекарственные формы для приема внутрь | | Общая фармакопейная статья Радиофармацевтические препараты применяются для радионуклидной диагностики и лечения различных заболеваний с использованием методов... |
| Статья опубликована в энциклопедическом словаре "Этика" (М.: Гардарики, 2001) Федеральный государственный образовательный стандарт среднего профессионального образования по специальности 111101 зоотехния | | Государственный образовательный стандарт Общая характеристика специальности 032500. 00 География с дополнительной специальностью |
| Государственный образовательный стандарт Общая характеристика направления подготовки дипломированного специалиста "приборостроение" | | Государственный образовательный стандарт Общая характеристика направления подготовки дипломированного специалиста "приборостроение" |
| Государственный образовательный стандарт Общая характеристика направления подготовки дипломированного специалиста «строительство» | | Государственный образовательный стандарт Общая характеристика специальности 053300 Режиссура театрализованных представлений и праздников |
