Сероводород как эндогенный модулятор освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе
Скачать 311.16 Kb.
|
На правах рукописи Герасимова Елена Вячеславовна Сероводород как эндогенный модулятор освобождения медиатора в нервно-мышечном синапсе 03.00.13 – физиология А в т о р е ф е р а т диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук КАЗАНЬ - 2008 Р  абота выполнена на кафедре физиологии человека и животных Государственного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Казанский государственный университет им. В.И. Ульянова-Ленина» Федерального агентства по образованию и науке Российской Федерации. Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент Ситдикова Гузель Фаритовна Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор, Раевский Владимир Вячеславович доктор медицинских наук, профессор, Волков Евгений Михайлович Ведущая организация – Государственное образовательное учреждение «Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова» (г. Москва). Защита состоится «29» апреля 2008 г. в « 12 » часов на заседании диссертационного Совета Д 212.078.02 при ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстана, 2. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Татарский государственный гуманитарно-педагогический университет» по адресу: 420021, г. Казань, ул. Татарстана, 2. Автореферат разослан «19» марта 2008 г. Ученый секретарь диссертационного Совета доктор медицинских наук, профессор Зефиров Т.Л. Актуальность исследования. Исследование механизмов регуляции синаптической передачи является одним из актуальных направлений в нейрофизиологии. В конце прошлого века был открыт новый класс биологически активных веществ - газообразных посредников, осуществляющих как межклеточную, так и внутриклеточную регуляцию различных физиологических функций. В настоящее время к этому классу относят оксид азота, монооксид углерода и сероводород (R. Wang, 2002; D. Boehning, S.H. Snyder, 2003; Ситдикова, А.Л., Зефиров, 2006; L. Li., P.K. Moore, 2008). Оказалось, что физиологическое значение газов не ограничивается регуляцией функций желудочно-кишечного тракта и сосудистой системы, где оно было определено первоначально, но также распространяется на центральную и периферическую нервную систему (R. Wang, 2004; А.В. Яковлев и др, 2005; G.F. Sitdikova et al., 2007; E.V. Gerasimova et al., 2008). Сероводород – газ, обладающий хорошо известными токсическими эффектами, связанными с нарушением окислительного фосфорилирования в клетке (R.J. Reiffenstein et al., 1992). В тканях млекопитающих были обнаружены высокие концентрации сероводорода: в плазме крови крыс 46 мкМ, а в тканях мозга 50-100 мкМ (M.F. Warenycia et al., 1989; C.J. Richardson, 2000; J.E. Doeller, 2005), что предположило возможную физиологическую роль этого газа. Также как оксид азота и монооксид углерода сероводород участвует в расслаблении гладкой мускулатуры (W. Zhao et al., 2001; B. Teague et al., 2002), физиологические концентрации этого газа усиливают активность N-метил-D-аспартат-рецепторов и облегчают индукцию долговременной потенциации в гиппокампе (K. Abe, H. Kimura, 1996). Показано, что сероводород приводит к увеличению внутриклеточного кальция в астроцитах и вызывает кальциевые волны, опосредуя взаимодействие между нейронами и глией (Y. Nagai, 2004). Известными мишенями H2S являются аденилатциклаза (H. Kimura, 2000) и АТФ-зависимые К+-каналы (R. Wang, 2002; G. Tang et al., 2005). При некоторых нейродегенеративных процессах и сердечно-сосудистых заболеваниях наблюдаются изменения уровня сероводорода в тканях (P.K. Moore et al., 2003). Эндогенно сероводород синтезируется из L-цистеина пиридоксаль-5’-фосфат-зависимыми ферментами - цистатионин β–синтазой и цистатионин γ–лиазой, экспрессирующимися практически во всех тканях (K. Eto et al., 2002). Показано, что эндогенный синтез сероводорода в нервной системе вызывается кратковременной активацией цистатионин β–синтазы вследствие нейронального возбуждения и входа кальция (K. Eto et al., 2002), что предполагает нейромедиаторную роль сероводорода, как и других газов. Исследования эффектов экзогенного и эндогенного сероводорода на секрецию медиатора и выявление внутриклеточных механизмов его влияния на функцию нервно-мышечного синапса позволит определить основные мишени действия сероводорода при модуляции синаптических функций. Цель и задачи исследования. Целью исследования являлось определение механизмов, лежащих в основе действия сероводорода на секрецию медиатора, и выявление возможности его эндогенного синтеза в области нервно-мышечного синапса теплокровных и холоднокровных животных. В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
Положения, выносимые на защиту:
Научная новизна. В работе впервые показано, что сероводород является пресинаптическим модулятором передачи возбуждения в нервно-мышечных соединениях холоднокровных и теплокровных животных. Установлено, что сероводород увеличивает вызванное и спонтанное освобождение медиатора, не изменяя электрогенез двигательного нервного окончания. Впервые выявлено, что блокирование ферментов синтеза сероводорода приводит к эффектам, противоположным действию газа, что говорит о его эндогенном синтезе в области нервно-мышечного синапса как холоднокровных, так и теплокровных животных. Определена экспрессия мРНК цистатионин β–синтазы и цистатионин γ–лиазы - ферментов синтеза сероводорода в диафрагме мыши. Впервые исследованы внутриклеточные механизмы действия сероводорода на секрецию медиатора в двигательном нервном окончании лягушки. Показано, что в основе эффектов сероводорода на секрецию медиатора лежит увеличение внутриклеточной концентрации Са2+ за счет активации рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума. Научно-практическая ценность. Полученные в работе данные расширяют представления о возможности модуляции синаптической передачи эндогенными физиологически активными соединениями. Это, в частности, касается вопросов о влиянии газообразных посредников, имеющих уникальные свойства, отличающие их от классических медиаторов, на функционирование нервной системы. Впервые исследована роль газообразного посредника - сероводорода в модуляции секреции медиатора в нервно-мышечном синапсе как холоднокровных, так и теплокровных животных. Научную ценность представляют данные об участии рианодиновых рецепторов эндоплазматического ретикулума в эффектах сероводорода. Поскольку основные закономерности функционирования нервно-мышечного синапса идентичны процессам, происходящим в синапсах центральной нервной системы, результаты работы полезны для объяснения механизмов регуляции процессов секреции нейромедиаторов и гормонов эндогенными газообразными посредниками в секреторных, нейросекреторных клетках и нейронах. Полученные данные имеют не только фундаментальное значение, но и могут быть использованы при разработке средств фармакологической коррекции нарушений нервно-мышечной передачи. Результаты исследования представляют практическую ценность для физиологов, биофизиков, биохимиков, фармакологов и нейрохимиков. Полученные данные используются при чтении лекций на кафедре физиологии человека и животных Казанского государственного университета. Работа выполнена при финансовой поддержке грантов РФФИ (06-04-49125); «Ведущая научная школа» (НШ-4520.2006.4, гос. контракт № 02.445.11.7351); АН РТ (03.3.8-343/2005-2006); АН РТ для молодых ученых (14-7/2005). Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на следующих конференциях и съездах: Всероссийском научном симпозиуме «Растущий организм: адаптация к физической и умственной нагрузке» (Казань, 2006), конференции молодых ученых "Биология - наука 21-го века" (Пущино, 2005), Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005, 2007), XX Съезде физиологического общества имени И.П. Павлова (Москва 2007), IX Всероссийской школе молодых учёных «Актуальные проблемы нейробиологии» (Казань, 2005), Международном симпозиуме «Biological motility» (Пущино, 2006), XIII международном совещании и VI школе по эволюционной физиологии (Санкт-Петербург, 2006), I Съезде физиологов СНГ (Дагомыс, 2005), Международной школе-конференции «Простые нервные системы» (Казань, 2006), Всероссийской конференции «Нейрохимия: Фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), ежегодных научных конференциях в Казанском государственном университете и Казанском медицинском государственном университете. Реализация результатов исследования. По теме диссертации опубликовано 17 печатных работ, в том числе 3 публикаций в рецензируемых журналах (из списка ВАК). Материалы диссертации неоднократно доложены на ежегодных научных конференциях в Казанском государственном университете. Структура и объем диссертации. Диссертация объемом 153 страницы состоит из введения, обзора литературы, описания методики исследования, результатов исследования и их обсуждения, выводов и списка литературы. Список цитируемой литературы включает 311 источников, из них 34 - отечественных и 277- иностранных авторов. Диссертация содержит 22 рисунка и 2 таблицы. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Объект исследования, использованные растворы и химические вещества. Эксперименты проводили на изолированном нервно-мышечном препарате кожно-грудинной мышцы лягушки Rana ridibunda и диафрагме лабораторных белых мышей. Все эксперименты выполнены в условиях постоянной перфузии препарата со скоростью 5 мл/мин. Использовали раствор Рингера для холоднокровных животных следующего состава (в мМ): NaCl - 115; KCl – 2.5; CaCl2 – 1.8; HEPES – 5 (t=20°С, рН 7.2-7.4), и раствор Кребса для теплокровных животных (в мМ): NaCl - 154; KCl – 5; CaCl2 – 2; HEPES – 5 , MgCl2 – 1, глюкоза - 11 (t=20°С, рН 7.2-7.4). Для устранения сокращения мышц в раствор добавляли d-тубокурарин (20-30 мкМ) или использовали раствор Рингера с пониженной (низкой) концентрацией ионов кальция ([Ca2+]о) (0.2-0.4 мМ) и повышенной (высокой) концентрацией ионов магния ([Mg2+]о) (2-4 мМ). В экспериментах использовали следующие фармакологические препараты фирмы Sigma: гидросульфид натрия (NaHS), L-цистеин, аминооксиацетиловая кислота (АОАК), β-цианоаланин (β-ЦА), 8(4-chlorophenylthio)-adenosine-3,5-cyclic monophosphate (pCPT-cAMP), 8(4-chlorophenylthio)- guanosine-3,5-cyclic monophosphate (pCPT-cGMP), cisN-(2-phenylcyclopentyl) azacyclotrideclen-amine hydrochloride (MDL-12330А), 1H-[1,2,4]-oxadiazolo[4,3-a]quinoxalin-l-one (ODQ), кофеин, дантролен, 4-аминопиридин. Водонерастворимые вещества растворяли в диметилсульфоксиде (DMSO). Концентрация DMSO в используемых растворах не превышала 0.01% . Газообразный сероводород (H2S) получали в реакции: Na2S+2HCl = 2NaCl+H2S, которую проводили в вытяжном шкафу (Карякин, 1974). Образовавшимся в результате реакции H2S насыщали 20 мл раствора Рингера в течение 30 мин непосредственно перед экспериментом. С учетом растворимости H2S концентрация базового раствора составляла 98 мМ (Михайленко, 1966). Данный раствор сразу же доводили до используемой концентрации H2S и добавляли в систему перфузии. Гидросульфид натрия (NaHS) широко используется в научных исследованиях в качестве донора H2S (Abe, Kimura, 1996), так как в водных растворах диссоциирует до иона натрия (Na+) и гидросульфидного аниона (HS-), который реагирует с протоном (Н+), образуя H2S. Известно, что в физиологическом растворе одна треть H2S находится в недиссоциированной форме, а остальные две трети существуют в виде HS- (Abe, Kimura, 1996). Электрофизиологический метод. Раздражение двигательного нерва проводили прямоугольными электрическими импульсами сверхпороговой силы длительностью 0.2-0.3 мс с частотой 0.2-0.4 имп/с или пачками ритмических стимулов (500 раздражений) с частотой 10 или 50 имп/с. Регистрацию биопотенциалов производили с помощью микроэлектродов. Методом внеклеточного отведения регистрировали трехфазные ответы нервного окончания (НО) и следующий за ними ток концевой пластинки (ТКП). В условиях низкой [Ca2+]0 (0.2-0.4 мМ) амплитуда 3-й фазы ответа НО в основном отражает величину потенциалзависимых К+-токов (Зефиров, Халилов и др., 1987). Для выявления Са2+-активируемых К+-токов в стандартный раствор Рингера ([Ca2+]0 - (1.8 мМ)) для холоднокровных добавляли 4-аминопиридин (100 мкМ). При добавлении в раствор 4-аминопиридина происходит блокирование потенциалзависимых К+-каналов, что ведет к увеличению длительности потенциала действия и, следовательно, большему входу Са2+ в НО. В результате выходящие Са2+-активируемые К+-токи становятся преобладающими в суммарном выходящем токе. Таким образом, амплитуда 3-й фазы ответа НО будет отражать величину Са2+-активируемых К+-токов (Зефиров, Халилов и др., 1987). Методом внутриклеточного отведения регистрировали вызванные потенциалы концевой пластинки (ПКП) и спонтанные (миниатюрные) ПКП (МПКП). При внеклеточном отведении проводили анализ амплитуды и квантового состава ТКП, параметров второй и третьей фазы ответа НО. Квантовый состав рассчитывался по методу выпадений: М = ln N0/N, где N0 - число раздражений, N - число раздражений, не вызвавших ТКП (Каменская, 1972). Для определения синаптической задержки подсчитывали временной интервал между пиком второй фазы ответа НО и началом одноквантового ТКП (на уровне 20% его амплитуды). При внутриклеточном отведении анализировали амплитуду, время нарастания (RT) и время полуспада (τ) ПКП и МПКП, а также частоту МПКП. Для анализа и последующей обработки параметров сигналов применяли автоматизированную систему, созданную на базе АЦП L-CARD-1250 и Pentium-III с использованием оригинальной программы «Ritm» (автор программы - Т.В Лайков). Среднее значение в серии получали по результатам экспериментов на 5-12 животных. Для статистической обработки экспериментальных данных использовали параметрический t-критерий Стьюдента в программе Microcal Origin 6.1 (Microcal Software, Inc., 1991-2000). Проведение обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР).1 Образец исследуемой ткани (диафрагма мыши) массой 100 мг замораживали в жидком азоте. Для осаждения мРНК полученный гомогенат вводили в лизирующий раствор следующего состава: гуанидинтиоционат (7.5М), фенол(50%), b-меркаптоэтанол (1%), 0.5 мкг/мл дрожжевой тРНК (Chomczynski, Sacchi, 1987). Полученные препараты нуклеиновых кислот вводили в реакцию ОТ-ПЦР. Синтез клонированной ДНК (кДНК) проводили с использованием реакционной смеси следующего состава: диоксирибонуклеотид трифосфат (dNTPs) (0.25 мМ), буфер для М-MuLV-обратной транскриптазы (Трис-HCl (50 мМ), MgCl2 (3 мM), KCl (75 мМ), дитиотреитол (5 мМ), IRNase (2 единицы) (Хеликон, Россия), М-MuLV-обратной транскриптазы (1 единица) (СибЭнзим, Россия), 500 нг олигонуклеотида (dT)15. В реакционную смесь объемом 20 мкл вносили 5 мкл препарата выделенной мРНК. Реакцию проводили при 37°С в течение 1 ч. ПЦР проводили в реакционной смеси следующего состава: dNTPs (0.2 мМ), однократный буфер для Taq ДНК-полимеразы (ТрисHCl (60 мМ), MgCl2 (1.5 мМ), KCl (25 мМ), b-меркаптоэтанол (5 мМ), Тритон Х-100(0.05%), Taq ДНК-полимеразы (1 единица) (СибЭнзим, Россия), олигонуклеотидные праймеры (1 мкМ каждого). В работе использовались олигонуклеотиды следующего состава: CSEm-f (5’-aagcagtggctgcgttg-3’) и CSEm-r (5’-tgtggtgtaatcgctgcc-3’), а также CBSm-f (5’-agccaacttctggcaac-3’) и CBSm-r (5’-caccagcatatccagcttc-3’). В реакционную смесь объемом 20 мкл вносили 5 мкл препарата кДНК. Амплификацию ДНК проводили с использованием системы «Терцик MC2» (ДНК-Технология, Россия) в следующем температурном режиме: 1 цикл: 940С – 5 мин; 42 цикла: 940С – 1 мин, 600С –1 мин, 720С –1 мин; 1 цикл: 720С – 7 мин; хранение 40С. Для проверки специфичности реакции полученные фрагменты ДНК обрабатывали рестриктазой HaeIII (СибЭнзим, Россия). Детекцию результатов ПЦР проводили методом горизонтального электрофореза в 2% агарозном геле, содержащем бромистый этидий (0,5 мкг/мл). Электрофоретическое разделение проводили в трис-боратном буфере (pH 8.0). Результаты визуализировали в УФ-свете (λ=310 нм). Полученные электрофореграммы фотографировали цифровым фотоаппаратом Nikon CoolPix 4500 с оранжевым светофильтром. Для определения размеров амплифицированных фрагментов ДНК использовали молекулярные маркеры (100-1000 пары оснований (п.о.)), произведенные НПО «СибЭнзим» (Россия). |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Медитация дает урок о силе влияния распознавания. Начинаешь видеть,... Тем не менее, по мере того, как медитация продвигается, она предоставляет инструменты для освобождения от этого влияния | | Урок по теме «От освобождения крестьян к «освободительным реформам» Урок по теме «От освобождения крестьян к «освободительным реформам» 1860-1870-х годов» |
 | Разработка урока по теме: «Окончание Смутного времени. 400-летие... Тема «Окончание Смутного времени. 400-летие освобождения Москвы народным ополчением» | | Районный конкурс методических разработок уроков, внеклассных мероприятий:... Районный конкурс методических разработок уроков, внеклассных мероприятий: «400-летие освобождения Москвы народным ополчением» |
| Дата и время Ленинграда от фашистской блокады и освобождения городов Павловска и Пушкина от оккупации | | Темы контрольных работ Юридические основания освобождения страховщика от страховой выплаты и отказ в ней |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Ведь в основе искусства игры лежит техника освобождения от зажимов, которая позволяет перевоплощаться в своего героя, оставаясь при... | | План мероприятий, посвящённых 400-летию освобождения Москвы народным... |
| Конкурс патриотической песни «Отчизне посвятим!» Урок мужества, посвященный 70-летию полного освобождения советских войск г. Ленинграда от блокады | | Пятидесятница, праздник освобождения человеческого духа1 I. порядок применения правил землепользования и застройки городского округа лыткарино и внесения в них изменений |
| Классный час-встреча «Поклонимся великим тем годам» Литературно-музыкальная композиция к 66-й годовщине освобождения села от немецко-фашистских захватчиков | | «Уроки мужества» Демократической Республики Афганистан, 70-летия полного освобождения от блокады Ленинграда, Дню Защитника Отечества, 90-летию образования... |
| Ноябрь декабрь январь февраль март апрель Урок мужества, посвященный семидесятилетию освобождения Орла и Орловской области от немецко – фашистских захватчиков | | Календарно-тематическое планирование 5-й класс. № п/п Понятие питания (правильное, рациональное), режима питания. Значение питания для нормального физического и нервно-психического развития... |
| Закон Российской Федерации «Об образовании» «школьных» заболеваний. К числу таких заболеваний относят, прежде всего, заболевания органов зрения, пищеварительной системы и опорно-двигательного... | | Рабочая программа по предмету «Искусство (музыка)» В большей степени программа ориентирована на реализацию компенсаторной функции искусства: восстановление эмоционально-энергетического... |
