Сравнительные физико-химические и морфологические свойства трубчатых (пястных) костей крупного рогатого скота и лосей 06. 02. 01 диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных
Скачать 377.19 Kb.
|
1 2
На правах рукописи Пименов Михаил Юрьевич Сравнительные физико-химические и морфологические свойства трубчатых (пястных) костей крупного рогатого скота и лосей 06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата ветеринарных наук Кострома 2011 Работа выполнена на кафедре анатомии и физиологии животных ФГОУ ВПО «Костромская государственная сельскохозяйственная академия» Научный руководитель: заслуженный деятель науки РФ, доктор ветеринарных наук, профессор Ложкин Эдуард Федорович. Официальные оппоненты: доктор ветеринарных наук, профессор Зеленевский Николай Вячеславович; доктор ветеринарных наук, профессор Сулейманов Фархат Исмаилович. Ведущая организация − ФГОУ ВПО «Вятская государственная сельскохозяйственная академия». Защита состоится “ 02 ” июня 2011 г. В 12 часов на заседании диссертационного совета Д 220.059.01 при ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» по адресу: 196084, Санкт-Петербург, Черниговская ул., 5. Тел/факс 388-36-31. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины». Автореферат разослан “__02 _” апреля 2011 г. и размещен на сайте ФГОУ ВПО СПбГАВМ http: // spbgavm/ru. Ученый секретарь диссертационного совета доктор ветеринарных наук Крячко О.В. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Установление закономерностей адаптационных возможностей костной системы млекопитающих в условиях измененного внешнего механического поля является одной из актуальных проблем современной медико-биологической науки и сельскохозяйственной практики. В практике скотоводства (разведения крупного рогатого скота и лосей) животные в течение многих поколений оказываются в весьма ограниченных условиях подвижности и проявления других поведенческих реакций (Аврунин А.С., Иоффе И.Д., 2001; Мещеряк М.С., 1964; Мирзоян Э.И., 1961). Созданный искусственно режим содержания качественно отличается от природных условий, вследствие этого не может не сказаться на физиологическом состоянии животных, их физическом развитии, репродуктивных способностях и в конечном итоге на количественных показателях мясо-молочности. Изучаемый вопрос тесно примыкает к проблеме адаптации, в частности, здорового организма к экстремальным условиям внешней среды. Это имеет большое теоретическое и прикладное значение. В настоящее время этот вопрос еще не получил, четкой разработки. Сдерживающим фактором является не только отсутствие общей количественной теории гомеостаза, но и отсутствие информативных критериев оценки и прогнозирования состояния организма в конкретных ситуациях. Повышенный интерес к исследованию структуры и механического поведения компактной костной ткани, как представителя класса жестких биокомпозитных материалов, вызван двумя обстоятельствами: во-первых, благодаря познанию внутреннего строения и механических свойств костной ткани станет возможным использование полученных результатов для усовершенствования уже существующих, и создания некоторых новых схем армирования конструкционных материалов, в том числе и искусственной костной ткани, реологически соответствующей своему биопрототипу, во-вторых, исследование костной ткани, как адаптивной композитной структуры, способной перестраиваться под воздействием различных факторов, является, несомненно, важным фактором, при разработке методов диагностики ее физического состояния, как в нормальных, так и в экстремальных условиях. Костная ткань способна эффективно работать при различных видах нагружения и перестраивать свою структуру, благодаря особому ее строению. Основное место в этой структуре принадлежит двум составляющим - органической и минеральной компонентам, изучение механических свойств которых важно для объяснения работы костной ткани, как биокомпозита. Цель и задачи исследования Изучить морфологические и физико-химические особенности пястной трубчатой кости крупного рогатого скота и лосей, в сравнительном и видовом аспекте. Для выполнения цели работы были поставлены следующие задачи: 1) Сопоставить анатомические особенности пястной трубчатой кости у крупного рогатого скота и лосей с целью выяснения уровня их адаптивных возможностей. 2) Изучить макроморфометрические характеристики пястной кости лосей и крупного рогатого скота в постнатальном онтогенезе. 3) Установить связь морфологических индексов пястных костей с их прочностными характеристиками в возрастном аспекте. 4) Определить содержание и влияние основного макроэлемента костной ткани – гидроксиапатита кальция на прочностные характеристики пястной кости у крупного рогатого скота и лосей. 5) Выявить направленность качественных и количественных изменений в структурной организации пястной кости в возрастном аспекте у крупного рогатого скота и лосей. 6) Провести сравнительный анализ влияния среды обитания на развитие трубчатых костей, в частности, пястной у крупного рогатого скота и лосей. Научная новизна На основании макро - и микроморфологии, биомеханики, химии, многомерной статистики разработаны критерии количественной оценки адаптивных возможностей костной системы животных соответственно для крупного рогатого скота и лосей. Показано, что длительная гипокинезия инициирует замедление темпов остеопластического процесса и внутренней реконструкции кости. На основании оценки структурных адаптаций скелета у животных разных видов и находящихся в условиях различной биодинамики выявлено, что динамические механические нагрузки являются одним из факторов, определяющих уровень ростовых и реформационных процессов, протекающих в кости. В результате изучения структурных особенностей пястных костей крупного рогатого скота и лосей на микро уровне было выявлено, что преобладание биостатики ведет к формированию кости малоприспособленной к выдерживанию нагрузок (крупный рогатый скот), которые достаточно легко выдерживает кость, находящаяся в более длительном состоянии биодинамики (лось), степень преобладания которой формирует отличную картину микроархитектоники костной ткани. У этого животного впервые определены физико-химические и гистологические особенности трубчатой кости лосей разного возраста. Теоретическая и практическая ценность работы Установлено, что у лосей, отдельно взятые морфометрические показатели меняются (варьируют), но соотношения между ними остаются постоянными на всем периоде постнатального онтогенеза. Этот принцип является одним из свойств костного гомеостаза. Подтверждены положения о высокой мобильности костной системы, что служит теоретическим обоснованием практически значимому выводу о принципиальной возможности усиления адаптивных свойств разводимых животных путем целенаправленного воздействия на скелет. Разработано в процессе изучения свойств и особенностей пястных костей у крупного рогатого скота и лосей ряд модификаций к общепринятым методикам по проведению исследований на пястных трубчатых костях в условиях лаборатории.
Полученные результаты могут быть использованы для прогнозирования физиологического состояния опорно-двигательного аппарата животных, рационализации режимов содержания в промышленном животноводстве с целью повышения его экономической эффективности. Найденная сравнительная (крупный рогатый скот, лось) адаптационная особенность микроструктур кости, подтвержденная при помощи микроморфологии архитектоники костной ткани, учитывающая особенности структурной организации и адаптивного ремоделирования кости при действии биодинамического и статического факторов, является существенным вкладом в морфологию опорно-двигательного аппарата животных. Они представляют интерес для общей физиологии скелета, для теории и практики, для спортивной медицины и физиологии труда. Положения, выносимые на защиту
Внедрение результатов исследований Основные положения и результаты исследований используются в учебном процессе Омского, Оренбургского Ставропольского, государственных аграрных университетов, Брянском государственном университете имени академика И.Г. Петровского, Рязанском государственном аграрном университете имени Костычева, Ивановской государственной сельскохозяйственной академии, Чувашской государственной сельскохозяйственной академии, Вятской государственной сельскохозяйственной академии, Ярославской государственной сельскохозяйственной академии, Витебской государственной академии ветеринарной медицины, Санкт-Петербургской академии ветеринарной медицины, Уральской государственной академии ветеринарной медицины. Апробация результатов научных исследований. Отдельные результаты проводимых исследований были доложены, обсуждены и одобрены на 60-й и 61-й международной научно-практической конференции «Актуальные проблемы АПК» (Кострома, 2009 и 2010). Публикация результатов исследований. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, из них 2 - в рецензируемом издании, рекомендованном ВАК России. Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 131 странице компьютерного текста и включает разделы: общая характеристика работы, обзор литературы, собственные исследования, обсуждение результатов исследования, выводы, практические предложения, список литературы. Список использованной литературы включает 160 источников, в том числе 55 - зарубежных. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 41 рисунками (фотографиями, микрофотографиями, диаграммами). СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Материал и методы исследования В настоящее время развитие сельскохозяйственных животных изучается в довольно широких масштабах и различными методами. При этом изучается в основном постнатальное развитие, в котором основное внимание уделяется влиянию морфологическому и физико-химическому составу костной ткани трубчатых костей крупного рогатого скота и лосей. Перед тем, как приступить к более обстоятельному изучению пястных костей были определены макроморфометрические показатели животных, трех возрастных групп, как у крупного рогатого скота, так и у лосей, а именно: длина пястной кости, проведение промеров трех участков пястной кости. Для определения макроморфометрических показателей использовалось измерительная лента - полуавтомат максимальной длиной 3 метра (с миллиметровой градуировкой). В соответствии с поставленной задачей, мы исследовали развитие крупного рогатого скота и лосей (n=30) в процессе их онтогенеза (три возрастных периода) на примере изучения пястных костей. В отношении крупного рогатого скота исследования проводили на примере костромской породы. Биоматериал по крупному рогатому скоту (n=15) был взят с убойной площадки в ОАО племенном заводе «Караваево». Были взяты пястные трубчатые кости от животных различного возраста: 6- мес., 12- мес., и 18- мес. Следует отметить, что в «Караваево» действует привязная система содержания взрослых животных крупного рогатого скота. Костный биоматериал лосей (n=15) брался от диких животных, как от павших животных, так и при отстреле в период охоты их в Костромской области. Так же как и у крупного рогатого скота, пястные трубчатые кости были взяты от животных трех возрастных периодов: 6-мес., 12-мес. и 18-мес. При определении возраста лосей мы исходили из довольно определенных сроков гона их (1 сентября - 15 октября), времени рождения лосят (май месяц). Отобранный костный материал тщательно упаковывался в полиэтиленовые пакеты, которые в последующем укладывались в специальный контейнер. Крупные кости взвешивались на весах до 10 кг с точностью до одного грамма, а мелкие – на весах до 100 г с точностью до 1 мг. Измерялась длина и периметр (обхват) костей. Учитывая неодинаковую выраженность мышечных бугров костей у животного даже одного и того же возраста, за длину кости мы принимали расстояние между ее сочленовными поверхностями. Для сохранения и последующего изучения трубчатые кости лосей и крупного рогатого скота подвергались легкому, в течение 30 минут вывариванию и в последующем были помещены в холодильную установку. В дальнейшем, измеряя длину каждой кости в отдельности, при помощи листовой пилы пястные кости разрезали на равные отрезки. По завершению подготовки биоматериала, отрезки пястной кости были отсортированы по ее участкам: диафизу и эпифизам (проксимальному и дистальному). В диафизарном участке по два отрезка, в эпифизарных – проксимальных и дистальных по одному. Отобранный материал, был подвергнут исследованию в нескольких направлениях: определение физических свойств костной ткани, пястных трубчатых костей на прессовальной машине (ПМ-3), определение содержания неорганического вещества путем помещения костного материала в муфельную печь, также проводилось определение плотности и порозности костной ткани пястной трубчатой кости, изучение гистологической структуры трубчатых костей крупного рогатого скота и лосей, а также изучалась микроморфология кристаллов гидроксиапатита кальция (рис.1.). Для каждого вида исследования были подобраны и тщательно проработаны методические программы. Практически во все общепринятые методики были нами внесены соответствующие типу исследования модификации.  Рис. 1. Методы исследования пястной кости крупного рогатого скота (n=15) и лосей (n=15) При определении свойств упругости пястной кости у крупного рогатого скота и лосей придерживались строгих правил и подходов на пути осуществления данного исследования. Сущность этих требований заключается в следующем:
Перед тем как приступить к определению упругости костных участков кости крупного рогатого скота и лосей, из цельных костей, при помощи листовой пилы были выпилены костные отрезки от каждого отдела пястной кости. Перед выпиливанием цельная кость прочно фиксировалась в тисках специального фиксирующего устройства, чтобы избежать возникновения неровностей при спиливании, которые могли бы существенно повлиять на результаты исследования. Подготовленные таким образом костные отрезки имели одинаковую оптимальную длину 4,5 см и гладкие ровные поверхности. Затем, все костные отрезки пястной кости предварительно измерили на аналитических весах их изначальную массу, положили в фарфоровые тигли и поместили в термостат для сушки при температуре 180º С на 45 минут. а) Проведение испытаний
б) Испытание на сжатие
Определение плотности и порозности трубчатой (пястной) кости у крупного рогатого скота и лосей. Среднюю плотность образца костной ткани определяли отношением его массы к объему. Для чего высушенную до постоянной массы и обезжиренную костную ткань взвешивали на аналитических весах. Геометрические размеры определяли микрометром или путем взвешивания в жидких средах: воде. Кость или ее фрагмент помещали в сосуд с жидкостью так, чтобы образец полностью был погружен в нее, и взвешивали на аналитических весах. Расчет объема производили по следующей формуле (в нашей модификации):  , где - объем; - разность массы кости в жидкости и массы кости на воздухе;  – плотность жидкости. Для исследования степени порозности находили объем высушенного и обезжиренного образца костной ткани в инертных, по отношению к кости растворителе: ксилоле - это начальный объем кости. Затем выдерживали образец в растворителе в течение 7 суток при нормальных условиях для заполнения пор растворителем. При достижении максимальной массы рассчитывали объем по приведенной выше формуле. Это так называемый «чистый» объем кости. Разница между начальным и конечным объемами определяется как объем пор. Отношение «чистого» объема к начальному, отражает степень порозности костной ткани. Воздействие высокой температуры на трубчатые (пястные) кости крупного рогатого скота и лосей с целью определения содержания органических и неорганических веществ в различных участках кости. Для проведения эксперимента было взято 30 фарфоровых тиглей по числу отобранных костных участков (отрезков пястной кости) по каждому из двух видов животных. Костные отрезки отбирались из разных участков пястной трубчатой кости (диафиз, эпифиз проксимальный, эпифиз дистальный). Костные отрезки взвешивались на аналитических весах, как перед началом эксперимента (до сжигания), так и по завершению его (после сжигания). Исследование было поделено на две части, по очередности их следования. Первая часть заключалась в отмеривании навески костных отрезков пястной кости крупного рогатого скота, и помещение их в муфельную печь при температуре 600º С. Вторая часть исследования стало помещение в муфель 20 (в 2 партии) тиглей с уже отмеренной навеской костных отрезков пястной трубчатой кости лосей. Сжигание проводилось при температуре 600º С. Определение содержания неорганического вещества (гидроксиапатита кальция) в пястных костях крупного рогатого скота и лосей основывалась на сжигании пробы концентрированными кислотами (HNO₃, H₂SO₄, HClO₄). Особенность данного исследования заключалась в незначительной затрате времени, но постоянном слежении за ходом процесса, достаточно умеренном расходовании кислот и более качественном разложении исследуемого органического вещества. В нашей модификации этот метод был назван методом выделения кристаллов кальция. Применение цельной методики – без модификаций, вело к значительному увеличению времени проведения исследования, а также приводило к частой замене растворов кислот, для очищения от органических остатков во время проведения исследования, что увеличивало расход используемых кислот. Пробы выдержали при температуре 135° С в среднем от 1 часа 15 минут (крупный рогатый скот), до 1 часа 35 минут (лоси). После чего массу каждого из них измеряли повторно (разница в массе костных отрезков крупного рогатого скота и лосей учитывалась при подсчете результатов по окончании проведения исследования). Количество потерянной влаги составляло после сушки в среднем от 8 мл до 14 мл. Колебание в весе костных отрезков составляло друг от друга при этом от 3 до 6 грамм. Далее, исследуемый материал помещался в емкость из термостойкого стекла - объемом 250 мл, в которую прилили 75 мл - H₂SO₄, 75 мл - HNO₃, 35 мл - HClO₄, в соотношении 2:2:1. Длительность фиксации исследуемого материала в смеси кислот составило 35 минут для каждого из отрезков пястной трубчатой кости, как крупного рогатого скота, так и лосей. Заливка биологического материала происходила последовательно. По мере того, как у первых емкостей с исследуемым материалом процесс сжигания завершался, другие заливались смесью кислот и оставлялись в течение определенного времени (35 минут) для проведения фиксации. После этого на каждую электроплитку (использовалось 3 электроплитки) имеющую спираль, и закрытую закрыта асбестовым подносом, каркас которого составляла металлическая сетка ставилось по 4 термостойких стакана. Сжигание исследуемого материала производили, постепенно увеличивая температуру до тех пор, пока раствор не стал слегка желтоватым и на дне емкости не отложился беловатый осадок (гидроксиапатит кальция). По завершении эксперимента образовавшийся осадок промывался деионезированной водой с последующей фильтрацией. Отфильтрованный осадок высушивался при температуре 65° С в течение одного часа. По окончании сушки проводили измерение массы высушенного гидроксиапатита кальция. В последующем, отбирали по небольшой порции от подвергнутого исследованию костного материала (от каждого из участков пястной кости – диафиза, проксимального и дистального эпифизов) кристаллы гидроксиапатита кальция и помещали их под микроскоп с тем, чтобы изучить микроморфологию этих кристаллов. Данное исследование проводили в программе «Motic Images Plus 2,0». Проведение исследования декальцинации и гистоморфологии пястной кости крупного рогатого скота и лосей трех возрастных групп. Общепринятая методика была нами модифицирована. Преобразование методики относилось к подбору декальцинирующих жидкостей, по характеру чувствительности исследуемого костного материала в зависимости от возрастного периода (6; 12 и 18 месяцев) как для крупного рогатого скота, так и лосей. Применение цельной методики без модификаций ведет к ухудшению качества костного биоматериала: растворению костных отрезков в растворе декальцинирующей жидкости, увеличению времени пребывания в декальцинирующем растворе, некачественной (неполной) декальцинации объектов исследования. Для осуществления исследования было взято 30 специальных емкостей с плотно притертой крышкой, 1400 мл раствора 7,5 % - азотной кислоты, 600 мл – 17 % - соляной кислоты и 600 мл - уксусной кислоты; 1400 мл – 40 % спирта, 1400 мл – 70 % спирта, 1400 мл – 90 % спирта, 1400 мл - хлороформа, дистиллированная вода, парафин, воск пчелиный, квадратной формы картонные формочки размером 1,5  1,5 см, пинцет, препаровальные иглы - прямые и изогнутые. А также волосяная кисточка для снятия срезов с микротомного ножа, фильтровальная бумага, предметные (размером 7525 мм, толщиной 3 мм) и покровные стекла (0,15-0,2 мм толщины), карандаш по стеклу, чашки Петри, пипетки. Перед началом проведения эксперимента на рабочем столе, предназначенном для непосредственной работы по приготовлению препаратов, накрыли стеклом и расположили под ним небольшие (912 см) листы белой и черной бумаги. Первым этапом в данном исследовании стало проведение декальцинации.Декальцинация достигается обработкой костной ткани с помощью декальцинирующих жидкостей обладающих свойствами растворять неорганические соли, не повреждая структурные элементы кости. Декальцинация пястных костей проводилась в водном растворе азотной кислоты, концентрация которой была подобрана нами отдельно, как для крупного рогатого скота, так и лосей и составила 10 % и 7,5 % соответственно. Такая концентрация была подобрана для пястных костей, взятых от животных в возрасте 18 месяцев. Раствор азотной, соляной кислот и дистиллированной воды, в соотношении: 3:2:1 использовался для декальцинации костей отобранных от животных в возрасте 12 месяцев. В растворе соляной и уксусной кислот, в соотношении 2,5:1 декальцинировалась пястная кость 6-ти месячных лосят и крупного рогатого скота. Для приготовления рабочего раствора в мерную посуду наливалась 7,5-8,5 мл химически чистая концентрированная азотная кислота и доливалась до 100 мл дистиллированной водой. После того как, налив нужное количество жидкости в специальную стеклянную колбу объемом 100 мл с плотно притертой резиновой пробкой, подвешивался подготовленный к декальцинации костной осколок пястной трубчатой кости. Раствор сменялся ежедневно до наступления полной декальцинации. Средняя продолжительность декальцинации участков пястной трубчатой кости в азотной кислоте составляет 1-1,5 суток. По истечению определяемого временного отрезка костный осколок тщательно промывался в течение 1-2 суток в проточной воде. При декальцинации костных участков пястной трубчатой кости в растворе соляной и уксусной кислот в химический стакан приливалось 66 мл соляной кислоты и 34 мл уксусной кислоты. Продолжительность нахождения костного отрезка (участка кости) в этом растворе составила 9 часов. При применении раствора азотной, соляной кислот и воды, в соотношении 3:2:1 (50 мл - азотной кислоты, 33 мл - соляной кислоты и 17 мл - дистиллированной воды) продолжительность декальцинации костного отрезка (участка пястной кости) составила 11 часов. По окончании проведения декальцинации лишенный кальция костный материал зафиксировали этиловым спиртом, относящимся к группе простых фиксаторов. Цель фиксации – убить клетку, прекратить происходящие в ней процессы (прежде всего ферментативные) и по возможности, сохранить ее прижизненное строение. Фиксация проводилась нами в соответствии с общими правилами. Используемые нами кусочки пястной кости длиной 1,0 0,5 см и фиксировались в течение 6 часов от взрослых (18 месяцев) животных, как крупного рогатого скота, так и лосей. От животных в возрасте 12 и 6 месяцев фиксация длилась 4,5 часа. Разность в интервалах времени заключалась в особенностях тканевой структуры кости взятых для исследования от животных разного возраста. Следующим этапом исследования стало промывание. Цель этой процедуры - освободить исследуемый объект (костную ткань) от излишнего количества фиксатора. Промывание нами кусочков костной ткани производилось в проточной водопроводной воде. Исследуемый объект заворачивали в марлю, подвешивали за нитку и опускали в сосуд с проточной водой. Использование марли обеспечивает постоянную циркуляцию воды. Верх сосуда закрывали марлей и проделывали в ней небольшое отверстие. На водопроводный кран привязывали шнур (полоску бинта), свободный конец которого пропускали через марлю в сосуд и пускали по нему несильную струю воды. Время промывания кусочков костной ткани составило 24 часа. После промывания кусочки костной ткани подвергли дальнейшему уплотнению путем обезвоживания в спиртах увеличивающейся концентрации, применили так называемый гистологический ряд. Для проведения этой процедуры приготовили 30 колбочек с широкими горлышками и хорошо притертыми резиновыми пробками. Затем залили их спиртами возрастающей концентрации: 40 %, 50 %, 60 %, 70 % + раствор йода 5 % , 96 % (по две колбочки) и 100 % (две колбочки) абсолютный спирт. Такой последовательный ряд получил название гистологической батареи. Спирты нужной крепости приготавливали заранее, по специальной таблице разведения из 96 % этилового спирта. Для приготовления абсолютного этилового спирта использовали обычный спирт - ректификат, содержащий 96 % чистого спирта и 4 % воды. Главным условием для получения абсолютного спирта является извлечение воды. Нами применялось обезвоживание при помощи прокаленного медного купороса (сульфат меди). Для удаления спирта и подготовки к пропитыванию парафином материал обрабатывался хлороформом. Обезвоженные и уплотненные костные отрезки перекладывались из 90 % спирта в смесь 90 % с хлороформом (1:1) на 6 часов, а затем в чистый хлороформ, где они вначале плавали, выступая над поверхностью, а затем по мере пропитывания постепенно погружались. В процессе удаления спирта хлороформ меняли 3 раза каждые 20 минут часов при величине костного отрезка 1,0 0,5 см, его держали в хлороформе 60 минут. Затем соблюдая принцип постепенного замещения хлороформа парафином – отрезки пястной кости помещались в смесь равных объемов парафина и хлороформа, где находились при температуре 37° С 4,5 часа (крупный рогатый скот и лоси 18-ти месяцев) и 3 часа (крупный рогатый скот и лоси 12-ти и 6-ти месяцев). Для полного освобождения от парафина костные отрезки проводились через 3 порции расплавленного парафина. Время нахождения костных отрезков пястной кости, при величине 1,00,5 см колебалось от 5 часов для костей от взрослых животных (18 месяцев), до 3,5 часов для костей, взятых от животных в возрасте 12 и 6 месяцев. Следующим этап – это проведение пропитывания и заливки костных отрезков пястной кости крупного рогатого скота и лосей. Наиболее употребительным для этих целей является парафин. Нами применялся обычный продажный парафин. В таком парафине значительное содержание газообразных примесей, которые при заливке образуют пузырьки, придающие парафину повышенную ломкость и значительно ухудшающие качество резки исследуемого материала. Для избавления от этих примесей, свежий парафин оставили на 3,5 часа в расплавленном виде в 10 чашках Петри, для приготовления 120 парафиновых блоков (для каждого возрастного периода, как крупного рогатого скота, так и лосей по 20 блоков). Это делалось с тем, чтобы увеличить площадь для выделения газов при температуре 75º С. Для поддержания такой температуры чашки Петри поместили в сушильный шкаф, предварительно подложив под дно чашки два деревянных бруска длиной 10 см, шириной 2 см и толщиной 7 мм. Такая подготовка парафина к использованию велась в течение 2-х дней. После этого в расплавленный парафин добавили 12 % воска, для того чтобы придать парафину большую эластичность. Предназначенный для заливки парафин подогревался до 60° С и аккуратно наливался в подготовленную (из картона в виде квадрата 2,0 2,0 см) формочку заполняя ее до самых краев и избегая образования пузырьков воздуха. Затем подогревался пинцет и быстро переносился на нем подготовленный к заливке объект в формочку с парафином и ориентировался в необходимом положении (продольном или поперечном по отношению к поверхности разреза). После чего формочку, содержащую костный отрезок, залитый в парафин, постепенно опускался в сосуд с водой и оставался плавать до полного застывания парафина.Наклейку блоков производили на деревянные бруски, предварительно обрезав канцелярским ножом все лишние выступающую за объект толщу парафина, с тем, чтобы улучшить доступ к исследуемому объекту. Получение срезов осуществлялось при помощи санного микротома (МС-2) полученные срезы достигали в толщину 5-7 мкм. Чтобы получились качественные гистологические срезы, выбрали необходимый угол наклона ножа (17º) и подобрали угол резания (30º). Выбор такого угла наклона объясняется тем, что плоскость заточки ножа расположена параллельно верхней поверхности блока. Предпочтение такому углу резания связано со свойствами парафина. Следующим этапом стало приготовление гистологических срезов. Наклеенный на деревянную платформу (размерами 9 2,5 см) парафиновый блок прочно закрепляли в зажиме микротома, расположив длинной осью параллельно длиннику микротома. Затем, установив необходимый угол резания и правильный угол наклона ножа, его прочно закрепляли винтовыми зажимами и расположили над блоком. После этого, регулируя винтами, механизм подачи, блок устанавливали таким образом, чтобы верхняя его плоскость находилась в горизонтальном положении и не доходила до лезвия ножа на 0,5-1 мм. Когда предварительная подгонка блока к ножу закончена, установили микрометрическую шкалу на получение толстых (25-30 мкм) срезов и движением ножевых салазок начали подавать блок вверх до получения с него первых полных срезов. Затем производили моделирование блока: срезали скальпелем избыточный парафин, оставляя вокруг залитого объекта слой не более 2-З мм, и придавали блоку прямоугольную форму. После этого установили микрометрическую шкалу на нужную толщину среза и приступили к окончательной резке материала. При резке срезы часто закручивались. Чтобы избежать этого срезы придерживали и приподнимали кисточкой за передний край в процессе резки. Следили за тем, чтобы срез не был прижат к ножу, так как при этом происходит его приклеивание и повреждение. Готовый срез осторожно снимали с ножа влажной кисточкой, (в направлений от спинки к лезвию), и переносили либо на подготовленное предметное стекло, и в чашку с теплой (З5-40° С) дистиллированной водой. Применение последней манипуляции давало более качественные срезы по ряду свойств: более плотное прикрепление к предметному стеклу, более чистое (свободное от парафина). Последнее свойство способствовало улучшению окраски среза. Воду предварительно кипятили, чтобы предупредить появление на нижней поверхности срезов пузырьков воздуха (который может быть растворен в воде), мешающих равномерному приклеиванию срезов к стеклу. При приготовлении срезов внимательно следили, чтобы волоски от кисточки не попадали под режущий край ножа, так как это приводит к повреждению лезвия. Для наклеивания парафиновых срезов нами использовался метод, основанный на приготовлении раствора белка с глицерином. Использование желатина оказалось неприемлемым из-за снижения качества обзора в микроскопе гистологических срезов, в связи с неплотной фиксацией срезов на предметном стекле. К белку из свежего куриного яйца добавили равное (1:1) по объему количество химически чистого глицерина и хорошо взболтали. Приготовленный раствор профильтровали через влажный складчатый бумажный фильтр, вставленный в стеклянную воронку, которую поместили в чистый химический стакан. Во избежание гниения белка к фильтрату добавили 3 маленьких кусочка (размером с пшеничное зерно) формалина (1:100). И тщательно закупорили хорошо притертой резиновой пробкой, при тщательном соблюдении этого условия в закрытом сосуде раствор сохраняется длительное время. Подготовку предметных стекол к наклеиванию произвели до начала резки парафинового блока на микротоме, поместив на тщательно очищенную поверхность стеклянной палочкой небольшую каплю раствор белка с глицерином (1:1) и растерев ее до получения равномерного слоя. Растирание производили пальцем (предварительно протерев его ваткой, смоченной эфиром). Приготовив предметные стекла, приступили к резке парафинового блока. Нами использовался метод расплавления и наклеивания срезов: срезы были перенесены для расправления в теплую воду, а смазанное белком с глицерином предметное стекло подвели в наклонном положении под плавающие срезы, натянули их на стекло с помощью препаровальной иглы и придали им правильное положение. Срезы располагали на предметном стекле в два ряда. В среднем на предметном стекле помещалось по 12-14 срезов. Затем удалили излишнюю воду (наклонив стекло и осторожно придерживая срезы за парафиновую каемку), клали стекла на планшеты и поместили в термостат или сушильный шкаф (при 42-45° С) на 24 ч, где и произошло окончательное высушивание и приклеивание срезов. Окрашивание депарафинированных срезов велось при помощи гематоксилина-эозина по общепринятой методике. Используемые для окраски растворы сливались во флаконы, с тем, чтобы снова произвести окраску следующей серии срезов. В используемые растворы опускались срезы при помощи анатомического пинцета, на определенное время, предусмотренное общепринятой методикой. Микроморфометрические исследования проводили в программе «Motic Images Plus 2,0». Подсчет остеонов в пястной кости крупного рогатого скота и лосей в разных возрастных периодах (6; 12 и 18 месяцев) велся по следующей формуле (в нашей модификации, так как формул определяющих именно количество остеонов в пястной кости при анализе методик не было):  , где – количество остеонов в пястной кости; – количество остеонов на 1 см²;  – толщина диафиза пястной кости; – обхват пясти. |
1 2
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Программа вступительного экзамена в аспирантуру по дисциплине «Философия» Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных | | Программа вступительного экзамена в аспирантуру по дисциплине «Иностранный язык» Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных |
 | Структура вступительного испытания ... | | Диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных Рекомендации разработаны авторским коллективом сотрудников фгу «фцтрб-вниви» и Главного управления ветеринарии км рт |
| Патоморфологические изменения и дифференциальная диагностика при... Протоиерей Серафим Слободской. «Закон Божий» Иллюстрированное издание в 2-х томах. Издательство «Ковчег», «Схолия», Москва, 2004 | | Программа вступительного экзамена для подготовки научно-педагогических... Целью вступительного экзамена является выявление уровня знаний поступающих в аспирантуру по теоретическим разделам дисциплины |
| Перечень лабораторных исследований, проводимых бу чр "Чувашская республиканская... Ррс свиней, ротавирусную инфекцию крупного рогатого скота, коронавирусную инфекцию крупного рогатого скота, стельность коров | | Лейкоз лейкоз крупного рогатого скота Лейкоз крупного рогатого скота – хроническое вирусное заболевание, которое протекает бессимптомно или проявляется лимфоцитозом и... |
| Значение ассоциаций микроорганизмов в этиологии и профилактике инфекционных... ... | | Реферат Тема: Животноводство в годы ВОВ. Работу В украинской сср поголовье крупного рогатого скота уменьшилось на 44%, овец и коз — на 74, свиней — на 89, лошадей — на 70%. В районах... |
| Бизнес-план Создание фермы по разведению крупного рогатого скота для получения мяса 2011 год Концепция проекта предусматривает создание фермы по разведению крупного рогатого скота для получения мяса в Алматинской области | | Формирование мясной продуктивности молодняка крупного рогатого скота... Лазаренко Виктор Николаевич, доктор сельскохозяйственных наук, профессор кафедры генетики и разведения сельскохозяйственных животных... |
| Адаптация чёрно-пёстрого скота разных эколого-генетических типов в условиях ростовской области Акклиматизационно-адаптивные и продуктивные качества крупного рогатого скота | | Морфофункциональная характеристика зубочелюстного аппарата у собак... Работа выполнена в фгу «Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии Росмедтехнологий»... |
| Рабочий план по эпизоотологии и инфекционным болезням для студентов... Диагностика и мероприятия при чуме крупного рогатого скота, злокачественной катаральной горячке | | 1 обзор литературы Особенности лейкоза крупного рогатого скота и современные методы его диагностики |
