3. Филогенетический анализ.
Для уточнения филогенетических отношений между видами C. sinensis и O. felineus и для оценки времени расхождения видов от последнего общего предка были использованы последовательности маркеров cox1 и ITS1. В качестве представителя внешней группы были использованы депонированные в Genbank последовательности Metagonimus yokogawai (Trematoda, Heterophyidae) JN638321 для ITS1. Для cox1 представителем внешней группы послужил M. bilis (Trematoda, Opisthorchiidae) FJ423739. Филогенетические деревья, построенные с помощью различных алгоритмов, показали сходную топологию.
Проведенный филогенетический анализ не выявил какой-либо внутривидовой структуры у обоих видов. Средняя генетическая дистанция между видами составила 4,5% замен по ITS1 и 15% - по cox1. Принимая за скорость накопления мутаций 2,5% для cox1 и 0.8% для ITS1 (Attwood [et al.], 2008; Despres [et al.], 1992), мы получили время расхождения видов ~5,6-6,0 млн. лет назад по обоим маркерам.
Известно, что до плиоцена (5.3 – 2.5 млн. лет назад) в умеренной зоне северного полушария климатические условия были довольно мягкими и однообразными. Фауна характеризовалась наличием большого количества сино-индийских видов. Первое отчетливое похолодание климата было отмечено 5.4 – 4.9 млн.л.н. Анализ зоогеографической структуры малакофауны плиоцена показал, что фаунистический обмен между Западной Сибирью и Восточной Азией полностью прекратился 3.2 млн.л.н. в связи с поднятием горных систем внутренней Азии (Зыкин, 1991). Возможно, до этих географических и климатических изменений ареал предкового вида находился на всей или большей части территории Азии. Однако указанные события могли привести к изоляции популяций на территории Северной и Восточной Азии, с дальнейшим образованием двух новых видов.
4.Популяционно-генетический анализ и филогеография O. felineus и C. sinensis. 4.1 Генетическое разнообразие O. felineus и C. sinensis.
Для изучения генетического разнообразия этих двух видов мы использовали два наиболее вариабельных маркера – cox1 и ITS1. Выбор маркеров также был обусловлен тем, что эти маркеры традиционно используются в популяционной генетике. Соответственно, мы получили возможность включить в наш анализ данные по этим маркерам из Genbank для исследуемых видов, а также проводить сравнительный анализ с данными опубликованных ранее исследований по другим видам трематод.
Анализ 181 секвенированных в данной работе образцов ДНК O. felineus выявил 19 гаплотипов для маркера cox1, 5 для ITS1 и 8 для ITS2. Анализ 192 образцов (из которых 46 было секвенировано нами и 184 взято из Genbank) C. sinensis по двум маркерам, выявил 19 гаплотипов для cox1 и 22 для ITS1. У обоих видов по каждому маркеру мы обнаружили преобладание одного (мажорного) гаплотипа, доля которого для O. felineus составила 60-90%, а для C. sinensis 40-60%. Кроме того, во всех случаях мы находим большой процент синглетных гаплотипов (у O. felineus 67% всех гаплотипов по cox1 и 60% – по ITS1; у C. sinensis по cox1 и ITS1 – 63% и 35% гаплотипов соответственно).
Значения стандартных индексов генетического разнообразия представлены в таблице (Таблица ). Данные для обоих использованных маркеров не противоречат друг другу.
Значительное преобладание одного (мажорного) гаплотипа во всех популяциях объясняет крайне низкое генное разнообразие (Hd) у O. felineus. Низкое нуклеотидное разнообразие (π) обусловлено преобладанием однонуклеотидных различий между выявленными гаплотипами.
Таблица . Индексы генетического разнообразия у O. felineus и C. sinensis.
Регион
|
N
|
S
|
H
|
Hd
|
π
|
cox1
|
ITS1
|
cox1
|
ITS1
|
cox1
|
ITS1
|
cox1
|
ITS1
|
cox1
|
ITS1
|
O. felineus
|
174
|
55
|
16
|
4
|
18
|
5
|
0.31±0.04
|
0.12±0.04
|
(14±2)х10-4
|
(3±0)х10-4
|
C. sinensis
|
97
|
181
|
20
|
22
|
22
|
22
|
0.83±0.02
|
0.80±0.03
|
(55±3)х10-4
|
(29±2)х10-4
|
N – число изученных изолятов, S – количество вариабельных позиций, H – количество гаплотипов, Hd – гаплотипическое разнообразие и π – нуклеотидное разнообразие.
В случае C. sinensis генетическое разнообразие (Hd, π) выше по обоим маркерам. При анализе разнообразия в популяциях различных речных бассейнах оказалось, что оно находится примерно на одном уровне, за исключением Амурской популяции, в которой генетическое разнообразие по ITS1 оказалось значительно ниже (Hd=0.24; π=0.0007).
4.2 Медианная сеть гаплотипов.
Для оценки генеалогических взаимоотношений между гаплотипами были сконструированы медианные сети (Рисунок ). В медианных сетях, построенных для O. felineus, отчетливо видно доминирование центрального гаплотипа для обоих маркеров. Также наблюдается большое количество редко представленных (минорных) гаплотипов, которые отстоят от мажорного на один, редко два мутационных шага. Преобладание центрального гаплотипа предполагает, что он, с высокой вероятностью, является общим предковым гаплотипом. Отчетливая «звездообразная» структура сети характерна для популяций, прошедших в недавнем прошлом через узкое «бутылочное горлышко» с быстрой последующей экспансией, о чем свидетельствует высокая степень фиксации редких вариантов (Depaulis 2003).
Как и в случае с O. felineus, у C. sinensis присутствует один мажорный гаплотип. Однако сети гаплотипов более структурированы, формируются отдельные гаплогруппы, и присутствуют гаплотипы, отстоящие на значительное расстояние от мажорного. Отдельные гаплогруппы образуют «звездообразную структуру», причем эта структура в большей степени характерна для популяций Сунгари, Ляохэ и Ю. Кореи, что предполагает их экспансивный рост. Таким образом, полученные данные свидетельствуют в пользу разной демографической истории у O. felineus и C. sinensis.
Рисунок . Медианные сети гаплотипов для O. felineus и C. sinensis. Размер узла пропорционален частоте встречаемости гаплотипа. Маленькие красные точки обозначают необнаруженные или вымершие гаплотипы.
4.3 Генетическая дифференциация популяций.
Для проведения анализа молекулярной дисперсии (AMOVA) все места сбора образцов O. felineus были объединены в две относительно изолированные друг от друга группы: Сибирскую (популяции из Иртышского бассейна, из Нижнего и Верхнего течения р. Обь, из р. Омь и р. Енисей) и Восточно-Европейскую (популяции из бассейнов р. Волга, р. Дон и р. Урал). Данное разделение было основано на выдвинутой ранее паразитологами предположении о существовании отдельных подвидов O. felineus на этих территориях (Беэр, Герман, 2000). Поскольку в некоторых популяциях по ITS1 было секвенировано недостаточно образцов, мы проводили AMOVA только по маркеру cox1.Рассчитанные значения индексов фиксации (Фst and Фsc) были ниже 0.05 (Таблица ). Согласно Wright, это указывает на низкие различия между исследованными популяциями (Wright, 1978).
Таблица . Анализ молекулярной дисперсии O. felineus.
Источник дисперсии
|
% общей дисперсии
|
Индексы фиксации
|
Между регионами
|
0.06
|
Фct=0.006 Фsc=0.015* Фst=0.021*
|
Между популяциями внутри групп
|
1.47
|
Внутри популяций
|
97.92
|
* - p<0.05. Фst – генетическое различие между популяциями, Фct – между группами, Фsc – между популяциями внутри групп.
Низкие значения индекса Fst (0,012 для cox1 и 0 для ITS1) также свидетельствуют об отсутствии различий между Сибирской и Восточно-Европейской группами популяций.
Таким образом все проведенные анализы указывают на крайне низкое генетическое разнообразие O. felineus и высокую гомогенность вида на исследованной территории. Популяционно-генетическая структура паразитов зависит от большего числа факторов, чем у свободноживущих видов. Существенную роль в формировании этой структуры может играть подвижность хозяев, поскольку именно хозяева обеспечивают поток генов между популяциями паразитов (Criscione, Blouin, 2004; Louhi [et al.], 2010). Таким образом, гомогенизация структуры паразитического вида может быть результатом перемешивания генов между популяциями вследствие активной миграции хозяев, наиболее подвижными из которых являются окончательные (Nadler, 1995). Такие особенности трематод как гермафродитизм и присутствие в жизненном цикле стадий с клональным размножением приводят к снижению генетического полиморфизма в популяциях (Charlesworth, Wright, 2001; Glémin, Galtier, 2012). Однако, как и у свободноживущих видов, причиной наблюдаемой нами картины может быть недавнее расселение вида на исследуемые территории из одной популяции с крайне бедным генофондом.
Для выявления фактора, сыгравшего ключевую роль в формировании популяционно-генетической структуры O. felineus, было целесообразно провести сравнительный анализ сибирского описторха с близкородственным видом C. sinensis, который характеризуется сходной биологией (круг хозяев, особенности размножения), однако обитает в других геоклиматических условиях.
Таким образом, было решено исследовать популяционную структуру восточноазиатского вида C. sinensis и дать оценку ее зависимости от географического положения отдельных популяций. Рассчитанные Fst индексы между популяциями C. sinensis из 8 речных бассейнов принимали значения от низких (0,024) до очень высоких (0,513) (Таблица ). Следовательно, между популяциями отдельных речных бассейнов существует изоляция, которая, однако, не зависит от расстояния между ними, что было подтверждено тестом Мантела (r = 0.23, p = 0.15). Значит, изоляция между популяциями обеспечивается не расстоянием, а какими-либо другими факторами. Кроме того, мобильность конечных хозяев паразита не достаточна для преодоления этой изоляции.
Таблица . Попарные индексы фиксации (Fst) между популяциями C. sinensis рассчитанные по фрагменту ITS1.
|
Янцзы
|
Хуайхэ
|
Чжуцзян
|
Ю. Корея
|
Ляохэ
|
Сунгари
|
Япония
|
Амур
|
Янцзы
|
0.065
|
|
|
|
|
|
|
|
Хуайхэ
|
0,060*
|
0.239
|
|
|
|
|
|
|
Чжуцзян
|
0,050*
|
0,232*
|
0.134
|
|
|
|
|
|
Ю. Корея
|
0,079*
|
0,253*
|
0,175*
|
0.169
|
|
|
|
|
Ляохэ
|
0,054
|
0,215*
|
0,122*
|
0,015
|
0.158
|
|
|
|
Сунгари
|
0,025*
|
0,124*
|
0,037*
|
0,035*
|
0,030
|
0.071
|
|
|
Япония
|
0,054*
|
0,277*
|
0,108*
|
0,061*
|
0,022
|
0,047*
|
0.109
|
|
Амур
|
0,124*
|
0,513*
|
0,215*
|
0,182*
|
0,138*
|
0,159*
|
0,027
|
0.222
|
* - p<0.05. Зеленый цвет – низкие различия между популяциями, желтый – умеренные, красный – сильные, голубой – очень сильные. Диагональ – средняя Fst для популяции.
Используя Байесовские алгоритмы, реализованные в программе Structure 2.3.3, мы показали, что все особи C. sinensis можно объединить в четыре генетически однородные группы. При анализе гистограммы вероятности принадлежности отдельных особей к одному из четырех кластеров, видно отчетливое объединение популяций в группы Южного и Юго-восточного Китая (Хуайхэ, Янцзы и Чжуцзян), Северо-восточного Китая (Ляохэ, Сунгари), Дальнего востока России (Амур) и Южной Кореи. Отдельно можно выделить популяцию из Японии, где все особи почти равновероятно принадлежат к любому из четырех кластеров (Рисунок ).
Рисунок . Анализ популяций C. sinensis по ITS1 и cox1, основанный на Байесовских алгоритмах. Гистограмма вероятности принадлежности особи (ось абсцисс) к одной из 4х генетических групп (обозначены цветами).
Ориентируясь на полученные данные о структуре вида, был проведен AMOVA с объединением всех популяций в 5 групп. Как и у O. felineus, подавляющая доля дисперсии пришлась на различия между особями (~90%). В отличие от O. felineus была обнаружена умеренная степень дифференциации (0,05-0,15) на всех уровнях популяционной структуры вида (Таблица ).
Таблица . Анализ молекулярной дисперсии, проведенный для последовательностей ITS1 C. sinensis.
Источник дисперсии
|
% общей дисперсии
|
Индексы фиксации
|
Групповой уровень
|
Между регионами
|
7.61
|
Фst=0.076*
|
Внутри регионов
|
92.39
|
Глобальная AMOVA
|
Между регионами
|
-0.54
|
Фct=-0.005 Фsc=0.109* Фst=0.104*
|
Между популяциями внутри групп
|
10.92
|
Внутри популяций
|
89.61
|
* - p<0.05. Фst – генетическое различие между популяциями, Фct – между группами, Фsc – между популяциями внутри групп.
На основе проведенного анализа можно сделать важное заключение: несмотря на то, что человек является высокомобильным видом и входит в круг конечных хозяев клонорха, его роль в формировании популяционно-генетической структуры паразита не является определяющей. Ареал исследованного вида приходится на одну из наиболее рано заселенных человеком территорий (примерно 40 тыс. лет назад), с очень высокой плотностью населения. Тем не менее, популяционно-генетическая структура паразита сохраняется отчетливо дифференцированной.
4. 4 Демографическая история видов и палеогеографическая история территорий их обитания.
Полученные данные предполагают, что не биологические, а какие-либо абиотические факторы играют основную роль в формировании популяционной структуры исследуемых трематод. Для определения этих факторов мы реконструировали демографическую историю обоих видов и палеогеографическую историю территорий, на которых они обитают.
Рассчитанные индексы нейтральности для O. felineus имеют отрицательные значения (Tajima’s D = -2.07 и -1.63, Fu’s Fs = -24.44 и -5.68 для cox1 и ITS1 соответственно). Индексы нейтральности принимают отрицательные значения в случае экспансивного роста популяции или в случае действия отрицательного отбора. Так как выбранные нами маркеры считаются селективно нейтральными, более вероятен первый вариант.
Чтобы проверить гипотезу о демографической экспансии O. felineus и оценить время ее начала был проведен тест на распределение попарных различий (mismatch distribution test). Было выявлено, что распределение имеет ярко выраженный унимодальный характер (Рисунок ). Это типично для популяций с недавно начавшимся экспансивным ростом, тогда как мультимодальность свойственна для старых популяций с постоянным размером (Harpending [et al.], 1998).
Попарные различия Попарные различия
Рисунок . Распределение попарных различий для O. felineus. Зеленым показаны ожидаемые значения для модели популяции с экспансивным ростом, красный пунктир показывает полученные данные.
Согласно графику параметр τ составил 0.256 для cox1 и 0.191 for ITS1. τ=2ut, где t – время экспансии популяции рассчитанное в поколениях, u – скорость мутаций в анализируемой последовательности за поколение). С учетом того, что время смены поколения составляет один год, а скорость накопления замен за миллион лет для ITS ~0,8% (Despres [et al.], 1992) и для cox1 ~2,5% (Attwood, Fatih, Upatham, 2008), было рассчитано, что экспансия вида началась 16-23 тысячи лет назад.
Известно, что в течение Четвертичного периода северная часть Евразии претерпевала непрерывные оледенения и морские трансгрессии. 15-22 тыс. лет назад на этих территориях был отмечен последний ледниковый максимум, после которого началось потепление (Hubberten, 2004; Архипов [et al.], 1997). Поскольку оценка времени начала экспансии является приблизительной, мы не можем точно сказать, когда популяция описторха начала свой экспансивный рост: в последнее межледниковье или по окончании последнего ледникового максимума. Тем не менее, потепление климата и активное таянье ледникового щита по завершении ледникового периода должны было создать благоприятные условия для расселения хозяев паразита и вслед за ними выжившей популяции O. felineus на всю исследованную нами территорию.
Было бы очень интересно точно указать место рефугиума O. felineus и пути его миграций. К сожалению, низкое генетическое разнообразие вида на всей исследованной территории предполагает наличие рефугиума где-либо за её пределами. Возможно, в реликтовых водоемах Средней Азии. Для точной локализации рефугиума, в котором предковая популяция могла выжить в плейстоцене, необходимо провести исследование вида на остальной части его ареала.
В отличие от ареала O. felineus, ареал C. sinensis простирается в широтном направлении и проходит через несколько климатических зон. Во время Плейстоцена разные территории Восточной Азии подвергались разным геоклиматическим воздействиям, что делает крайне интересным сопоставление северных (умеренный пояс) и южных (субтропический пояс) популяций клонорха. При оценке медианной сети гаплотипов было показано, что северные популяции клонорха, за исключением российской, характеризуются «звездообразной структурой». Индексы нейтральности для них принимают отрицательные значения (Fu’s Fs = -7.76 для ITS1). При проведении теста распределения попарных различий наблюдается унимодальное распределение для российской и остальных северных популяций. Однако, в последнем случае, видно начало формирования второго пика и смещение фронта волны вправо. Для южных популяций ярко выражена мультимодальность, что свидетельствует об отсутствии у них экспансивного роста (Рисунок ). При расчете времени начала экспансии мы получили 13 тысяч лет для российской (τ = 0.099) и ~60-100 тысяч лет для остальных северных популяций (τ = 0.742).
Попарные различия Попарные различия Попарные различия
Рисунок . Распределение попарных различий для C. sinensis. Зеленая линия показывает ожидаемые значения для модели популяции с экспансивным ростом, красным пунктиром – полученные данные. Вверху ITS1, внизу cox1.
На северных территориях Восточной Азии похолодание и аридизация климата в Плейстоцене привели к исчезновению многих видов. Последнее сильное оледенение, которое затронуло материковый Китай, произошло 70-130 тыс. лет назад (Zheng, Xu, Shen, 2002), после него восстановление видов происходило из рефугиумов на Юге Китая и на территории Маньчжурии (Li [et al.], 1979). Согласно полученным в ходе представленной работы данным северные популяции C. sinensis претерпели снижение эффективной численности в ходе плейстоцена, и экспансия вида на северной части ареала началась 60-100 тыс. лет назад. Этот результат хорошо согласуется с данными, полученными для других видов животных и растений Восточной Азии (Qu [et al.], 2005; Yang [et al.], 2006).
Наличие географических барьеров между отдельными регионами Восточной Азии могло внести свой вклад в формирование четырех генетически однородных групп, выделенных нами и расположенных на территории Ю.Кореи, Северного и Северо-Восточного Китая и Дальнего Востока России. Известно, что Малый Хинган и Маньчжуро-Корейские горы представляют значительный барьер для миграции животных (Driscoll [et al.], 2009). Кроме того, эти горы в последний ледниковый период долгое время были покрыты ледниками, что могло привести к формированию на Корейском полуострове обособленной генетической группы вследствие ее изоляции. Поскольку по нашим расчетам заселение территории Дальнего Востока России началось не ранее 13 тыс. лет назад, можно предположить, что проникновение паразита на эту территорию произошло только по завершении последнего ледникового периода. Так как Малый Хинган препятствовал проникновению на Дальний Восток диких животных с территорий Китая, можно предположить, что распространение клонорха в Приморье было следствием активной миграции человеческих племен, начавшейся 6.5 тысяч лет назад. Российская популяция клонорха характеризуется самым низким генетическим разнообразием и отсутствием звездообразной гаплотипической структуры что вполне может быть объяснено «эффектом основателя» имевшим место в недавнем историческом прошлом.
Особи из Японской популяции равновероятно принадлежат ко всем 4 генетическим группам, поэтому можно предположить, что появление на Японских островах паразитов из разных регионов также носит антропогенный характер.
В отличие от северных популяций, южные имеют самую сложную гаплотипическую структуру (Рисунок ). На графике распределения попарных замен только для популяций из этого региона характерна мультимодальность (Рисунок ). Подобная картина формируется в старых популяциях со стабильным размером. Это хорошо объяснимо, так как во время плейстоценовых изменений климата в южной части ареала клонорха сохранялись относительно стабильные мягкие условия.
Таким образом, палеоклиматические события Плейстоцена, по-видимому, были ключевым фактором, определившим особенности популяционно-генетической структуры у двух исследованных видов трематод.
|
