Эпигенетические изменения в опухолях шейки матки: гипер- и гипометилирование повторяющихся элементов ДНК (14.

На правах рукописи Катаргин Алексей Николаевич Эпигенетические изменения в опухолях шейки матки: гипер- и гипометилирование повторяющихся элементов ДНК (14.01.12 – онкология) АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Москва 2010 Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Российском онкологическом научном центре имени Н.Н. Блохина РАМН (директор — академик РАН и РАМН М.И. Давыдов) Научный руководитель: член-корреспондент РАМН, доктор биологических наук, профессор Ф.Л. Киселев Официальные оппоненты: доктор биологических наук Н.Н. Вейко; доктор медицинских наук М.Г. Якубовская Ведущая организация: Институт физико-химической биологии им. А.Н. Белозерского, МГУ им. М.В.Ломоносова. Защита диссертации состоится “ ” 2010 г. в часов на заседании Диссертационного совета (Д.001.017.01) при РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН (Москва, 115478, Каширское шоссе 24) С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. Автореферат разослан “ ” 2010 г. Ученый секретарь Диссертационного совета РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. доктор медицинских наук, профессор Ю.В. Шишкин ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы. Рак шейки матки занимает второе место, после рака молочной железы, по частоте заболеваемости и смертности среди всех форм опухолей у женщин. Этиологическим агентом рака шейки матки признаны вирусы папиллом человека (HPV) из так называемой группы «высокого риска заболевания» (HPV 16, 18 и родственные им). Прогрессия опухоли, возникающей из инфицированной HPV клетки, проходит через несколько стадий. В этот период возникают и накапливаются нарушения в функционировании многих клеточных генов. Нарушение функций клеточных генов может происходить как вследствие генетических мутаций, так и эпигенетических изменений – эпимутаций. К эпимутациям относится, в частности, нарушение паттерна метилирования ДНК. У млекопитающих энзиматическому метилированию в ДНК подвергается главным образом цитозин в составе динуклеотидов 5′ CpG. Метилирование ДНК является одним из механизмов, определяющих тканеспецифическую и аллель-специфичную экспрессию генов (импринтинг), подавление экспрессии генов на инактивированной хромосоме Х. Оно участвует также в обеспечении генетической стабильности клетки, ограничивая гомологические рекомбинации с участием повторяющихся элементов генома (повторов), их распространение по геному, их транскрипцию. Опухолевые клетки отличаются глобальным изменением паттерна метилирования ДНК, которое носит сложный характер: в одних и тех же опухолях происходят, как глобальное деметилирование генома и активация транскрипции соответствующих генов и повторяющихся элементов, так и гиперметилирование локальных участков генома и подавление транскрипции ассоциированных с ними генов. Исследования последних лет показали, что опухоли разных локализаций могут отличаться по набору генов, подвергающихся аберрантному метилированию. Механизмы, активирующие в опухолевых клетках такие разнонаправленные процессы, как гипер- и гипометилирование ДНК, а также механизмы, определяющие специфичность маркеров метилирования для разных типов опухолей, до сих пор неизвестны. Понимание соотношения процессов гипер- и гипометилирования в опухолевой клетке особенно важно в связи с попытками использовать для противоопухолевой терапии агенты, деметилирующие ДНК (децитабин, 5-аза-цитидин, RG108 и др.). Ранее в лаборатории молекулярной биологии вирусов НИИ Канцерогенеза при поиске GC–богатых участков ДНК, метилирование которых может быть изменено в опухолях шейки матки по сравнению с морфологически нормальными тканями, был выявлен макросателлитный 3,3-kb повтор. Успехи в расшифровке генома человека и животных способствовали изменению взгляда на повторяющиеся элементы как на нейтральные или вредные элементы генома. Появились данные о том, что повторы участвуют в структурной организации, эволюции генома, в регуляции экспрессии генов, и эти функции некоторых повторов нарушаются при канцерогенезе. Сведения о статусе метилирования каких-либо повтряющихся элементов ДНК в опухолях шейки матки отсутствуют в литературе. В связи с выше сказанным, исследование нарушения паттерна метилирования повторяющихся элементов как мишеней аберрантного метилирования ДНК в опухолях шейки матки представляется актуальным. Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в определении статуса метилирования 3,3-kb повторов в нормальных клетках и его изменений в опухолях шейки матки. Исходя из цели работы, были поставлены следующие экспериментальные задачи: Определить, изменяется ли статус метилирования 3,3-kb повтора в опухолях и клеточных линиях шейки матки по сравнению с морфологически нормальными тканями шейки матки; определить частоту изменения статуса метилирования 3,3-kb повтора в опухолях шейки матки; Сравнить частоту изменения статуса 3,3-kb повтора в опухолях шейки матки с частотой изменения статуса метилирования классического сателлитного повтора Sat2, известного маркера деметилирования для опухолей других локализациий; Исследовать уровень транскрипции генов семейства DUX, локализованных внутри мономера 3,3-kb повтора, в опухолевых и нормальных тканях шейки матки; Научная новизна, теоретическая и практическая значимость работы. Впервые обнаружено, что в HPV-позитивных опухолях шейки матки и HPV-позитивных клеточных линиях в отличие от гипометилирования классических сателлитных повторов Sat2 происходит гиперметилирование макросателлитных 3,3-kb повторов по сравнению с нормальными тканями шейки матки. Впервые в клетках рака шейки матки обнаружено изменение статуса метилирования специфического участка ДНК S/MAR, расположенного вблизи кластеров 3,3-kb повторов на хромосомах 4 и 10. S/MAR участвует в прикреплении ДНК к ядерному матриксу. Впервые обнаружена транскрипция генов семейства DUX, локализованных в 3,3-kb повторах, в нормальных тканях шейки матки и подавление их транскрипции в опухолях шейки матки. Теоретическое значение работы заключается в получении новых данных об организации эпигенома в нормальных клетках и её изменениях в опухолях. Данные о гипометилировании одних повторов и гиперметилировании других повторов в опухолях могут быть использованы при разработке и тестировании ДНК-деметилирующих агентов. Данные об изменении в опухолевых клетках статуса метилирования специфического участка ДНК S/MAR могут служить основанием для исследования роли S/MAR в доменной организации хроматина в опухолевых клетках. Апробация результатов работы. Основные результаты работы были представлены на международных научных конференциях и симпозиумах: Second Weissenburg Simposium – Biriciana, May 2004, Bayern, Germany; 6 international multidisciplinary congress “Eurogin”, 2006, Paris, France; 23th international papillomavirus conference, 2006, Prague; 24th international papillomavirus conference, 2007, Beijing; IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов, 2008, Новосибирск. Структура и объём работы. Диссертация состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, описание использованных в работе материалов и методов, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, список цитируемой литературы. Материалы диссертации изложены на 116 страницах машинописного текста, включают 11 таблиц и 10 рисунков. В списке цитируемой литературы приведено 190 ссылок на работы отечественных и зарубежных авторов. СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ Обзор литературы Обзор литературы посвящен роли повторяющихся элементов генома в норме и в канцерогенезе. Рассмотрены структура, функциональные особенности и характер метилирования LTR-содержащих и LTR-несодержащих ретротранспозонов и сателлитных повторов в нормальных и опухолевых клетках. Подробно описана структура, локализация, характер экспрессии и патогенетическое значение макросателлитных 3,3-kb повторов. Материалы и методы Образцы опухолей и нормальных тканей шейки матки были собраны в НИИКО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН согласно правилам этического комитета РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Подтверждение клинического диагноза и определение гистологического типа опухоли было выполнено в Отделении патоморфологии РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН. Всего в работе было использовано 50 образцов опухолей шейки матки I, II и III стадий по классификации международного союза гинекологов и акушеров FIGO (плоскоклеточный рак и аденокарциномы). Опухоли были позитивны по HPV 16 или 18 типа по данным ПЦР. В работе использовали клеточные линии, полученные из опухолей шейки матки: HeLa, SiHa, CaSki, C-33A, C4-1 (American Type Culture Collection, Rockville, MD). Клетки HeLa и C4-1 содержат геном HPV18, клетки SiHa и CaSki - геном HPV16, C-33A - безвирусная клеточная линия с мутацией в гене р53. В работе были использованы следующие методы исследования: выделение ДНК и РНК из образцов тканей и клеточных культур гуанидинизотиоцианатным методом; электрофоретическое разделение фрагментов геномной ДНК в агарозном геле; блот-гибридизация по Саузерну; получение радиоактивно-меченых зондов; метод обратной транскрипции в сочетании с полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР); клонирование продуктов ПЦР; бисульфитная конверсия ДНК с последующим определением нуклеотидной последовательности конвертированной ДНК. Результаты и обсуждение Анализ статуса метилирования 3,3-kb повторов в нормальных тканях, клеточных линиях и опухолях шейки матки методом блот-гибридизации по Саузерну. Статус метилирования 3,3-kb повторов в нормальном цервикальном эпителии не был известен. Для его определения мы использовали ДНК, полученную из здоровых тканей шейки матки от больных с нецервикальной патологией. ДНК обрабатывали метил-чувствительными эндонуклеазами рестрикции с последующей блот-гибридизацией по Саузерну с радиоактивно-меченными зондами (рис. 1 и 2). Для оценки уровня метилирования в каждом образце определяли долю гибридизационного сигнала для высокомолекулярных полос в процентах по отношению к сигналу на всей дорожке автографа. Высокомолекулярными мы считали фрагменты, расположенные выше маркера размером 4,4 т.п.н., т.е. превышающие размер мономера повтора (3,3 т.п.н.). A Б Рисунок 1. A: Схема мономера 3,3 kb повтора. Изломанной стрелкой обозначена открытая рамка считывания DUX4, короткими стрелками – праймеры к транскриптам DUX4, квадратами - гомеобоксы. sq-1, sq-2 и sq-3 – районы, в которых исследовали статус метилирования 3,3 kb повтора методом бисульфитного сиквенирования; зонд-1 и зонд-2 ­– зонды для блот-гибридизации по Саузерну. Б: Сайты узнавания метил-чувствительных эндонуклеаз (обозначены вертикальными линиями). В нормальных тканях высокомолекулярные фрагменты присутствуют во всех дорожках (рис 2А). Это говорит о том, что3,3-kb повторы существенно, хотя и не полностью, метилированы по сайтам узнавания всех использованных эндонуклеаз (например, 35-66% по эндонуклеазе Nae I), что согласуется с полученными ранее данными для других нормальных тканей (Tsien et al., 2001). Обращает на себя внимание тот факт, что доля сигнала высокомолекулярных фрагментов в нормальных тканях шейки матки от разных индивидуумов существенно варьирует (35%, до 66% ) Это свидетельствуют о том, что паттерн метилирования 3,3-kb повторов в нормальных тканях индивидуум-специфичен. В HPV-позитивных линиях, HeLa, SiHa, C-4I и CaSki не было выявлено никаких низкомолекулярных фрагментов (< 3.3 т.п.н.) по всем эндонуклеазам. (рис. 1Б). Это указывает на высокий уровень метилирования 3,3-kb повторов по исследованным CpG-сайтам. В то же время, в HPV-негативной клеточной линии С-33А в отличие от нормальных тканей и других клеточных линий полностью отсутствует гибридизационный сигнал в высокомолекулярной зоне (в районе маркера 23 т.п.н.) для всех эндонуклеаз, что указывает на сильное деметилирование CpG-сайтов. Рисунок 2. Блот-гибридизация по Саузерну рестрикционных фрагментов после обработки геномной ДНК метил-чувствительными эндонуклеазами. A, Б, В – гибридизация с зондом-1 к 5’-концевой области 3,3 kb повторов; A: Nc -нормальные ткани шейки матки от больных с нецервикальными патологиями; цифрами указана доля сигнала в области > 4,1 т.п.н. от общего сигнала дорожки в процентах для Nae I; Б: клеточные линии карцином шейки матки; В: парные образцы (N – прилегающий к опухоли цервикальный эпителий, T – РШМ); М – ДНК фага лямбда / Hind III. Таким образом, в HPV-позитивных клеточных линиях наблюдалось гиперметилирование 3,3-kb повторов в отличие от HPV-негативной клеточной линии С-33А, в которой было выявлено сильное гипометилирование 3,3-kb повторов по сравнению с нормальными цервикальными тканями. При исследовании HPV-позитивных опухолей шейки матки было обнаружено, что ни в одном из 34 образцов уровень метилирования 3,3-kb повторов не снижался до уровня, характерного для HPV-негативной клеточной линии С-33А. В 18 из 34 (53%) опухолей было выявлено повышение уровня метилирования 3,3-kb повторов (гиперметилирование) по сравнению с прилегающими к опухоли нормальными тканями (рис.2В и рис. 3, первые 18 образцов). Учитывая индивидуальную специфичность паттерна метилирования 3,3-kb повторов, каждый образец опухоли сравнивали с нормальными цервикальными тканями, полученными от того же больного. Таким образом, в HPV-позитивных карциномах шейки матки преобладающим событием является гиперметилирование 3,3-kb повторов, а не их гипометилирование. Сопоставление частоты гиперметилирования 3,3-kb повторов с размером опухолей и наличием метастазов в регионарные лимфоузлы у больных не выявило корреляций, что говорит в пользу предположения о раннем нарушении статуса метилирования 3,3-kb повторов в ходе опухолевой прогрессии. T/N Рисунок 3. Частота гиперметилирования 3,3-kb повторов в карциномах шейки матки. T/N – отношение доли авторадиографического сигнала в высокомолекулярной области (> 4,3 т.п.н.) в опухоли к аналогичной величине в прилегающем нормальном эпителии (для парных образцов), или к среднему значению для образцов нормального эпителия ШМ от больных с нецервикальной патологией (для клеточных линий). Приведены значения T/N для гибридизации 3,3-kb повторов с зондом-1 (рестрикция по Nae I); P – уровень значимости различий в степени метилирования между нормальными и опухолевыми тканями (парный критерий Вилкоксона).

Похожие:

	Как предупредить рак шейки матки Но чаще всего про гинеколога вспоминают тогда, когда женщина забеременела, или когда появились резкие боли, выделения и другие болезненные...		Обоснование лапароскопической подвздошной и парааортальной лимфаденэктомии,... Обоснование лапароскопической подвздошной и парааортальной лимфаденэктомии, транспозиции яичников у больных раком шейки матки ib...
	Вопросы для сертификационного экзамена по акушерству и гинекологии Предраковые заболевания шейки матки. Клиника. Диагностика. Лечение. Диспансеризация больных		Список Сц акушерство и гинекология 2012, ту кольпоскопия и патология шейки матки 2013, ту лазерные технологии в акушерстве 2013
	Генитальные микоплазмы в структуре бактериальных инфекций влагалища... Работа выполнена в гоу впо первый Московский Государственный Медицинский Университет им. И. М. Сеченова		Заболевания шейки матки при беременности (современные аспекты диагностики и тактика ведения) ...
	Отчет о научно-исследовательской работе «Разработка методов оценки... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Отчет о научно-исследовательской работе «Разработка методов оценки... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
	Особенности течения беременности и родоразрешения женщин, перенесших заболевания шейки матки Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования “Московская медицинская академия...		Риск развития миомы матки снижается при увеличении числа родов и... Сведения о миоме матки встречается в древних источниках, даже при исследовании останков египетских мумий были выявлены случаи кальцифицированных...
	Интраэпителиальные неоплазии и микроинвазивный рак шейки матки. Клинические... Работа выполнена в Федеральном Государственном Учреждении «Центральная клиническая больница с поликлиникой» Управления делами Президента...		Беременность и заболевания шейки матки: частота, осложнения гестации,... Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Орловский государственный...
	Доклад Докладчик: Кипчакова Наталья Приветствие. Введение -вашему... Данную тему мы хотим показать с точки зрения подростков, потому что в этом возрасте вы вступаете во взрослую жизнь. Здесь вас подстерегает...		Миома матки Миома матки (Методическое пособие для студентов, интернов, клинических ординаторов и врачей)
	Методические рекомендации для студентов к практическим занятиям по... Эндометриоз. Предопухолевые заболевания и опухоли шейки и тела матки. Болезни яичников, маточных труб и молочных желез. Эндометриоз...		Протокол №4 от 28. 04. 09 /Рожков А. А./ руководитель мо /Тюпина Г. А Периодический закон и периодическая система химических элементов Д. И. Менделеева. Закономерности изменения свойств элементов малых...