Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность
Скачать 0.96 Mb.
|
| Глава 1. Молекулярная биология и генная инженерия в практике защиты растений от вредных насекомых В главе рассматривается практическое применение технологии молекулярных маркеров для целей защиты растений от вредителей. Показано применение ДНК-маркеров для идентификации видов, изучения генетики популяций полезных и вредных видов насекомых, а также мониторинга резистентности вредителей к инсектицидам. Приводится описание техники трансформации членистоногих для создания трансгенных и паратрансгенных насекомых и их использование в программах биологической защиты растений. Описывается современное состояние исследований по выращиванию генетически модифицированных (трансгенных) растений. Рассматриваются выгоды и преимущества их возделывания, а также вопросы экологической безопасности генетически модифицированных растений, устойчивых к вредным насекомым. Глава 2. Материалы и методы Объект исследования. Объектом исследований явились выборки из популяций различных видов насекомых, представителей четырех отрядов: полужесткокрылые Hemiptera (клопы Nezara viridula, Graphosoma lineatum, Dolicorys baccarum, Eysarcoris incospicnus, Piesodorus lituratus, Palomena prasina, Pyrrhocoris apterus, Coreus marginatus, Eurygaster integriceps, Perillus bioculatus, Podisus maculiventris); жесткокрылые Coleoptera (колорадский жук Leptinotarsa decemlineata); двукрылые Diptera (муха Ceroxys hortulana); чешуекрылые Lepidoptera (яблонная плодожорка, Cydia pomonella; картофельная минирующая моль Phthorimaea operculella; хлопковая совка Helicoverpa armigera), а также растения картофеля (Bt-защищённые сорта картофеля Супериор Ньюлиф («Монсанто», США), Луговской-плюс (Центр «Биоинженерия» РАН), кукурузы (Раундап-устойчивая кукуруза NK 603 RR («Монсанто», США) и сои (Раундап-устойчивая соя сорт Stine 2254 RR («Монсанто», США). Молекулярно-генетический анализ. Основным методом молекулярно-генетических исследований являлась полимеразная цепная реакция (ПЦР). Выделение ДНК из насекомых, семян, проростков и листьев растений, амплификацию ДНК (RAPD-, ISSR-PCR) и электрофорез в агарозном геле проводили по протоколам описанным нами ранее [Киль, 2009]. ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» (ДНК-технология, Россия) и термоциклере «iCycler» (BioRad, США). Во избежание ошибки опыта RAPD- и ISSR-анализ проводили одновременно в одной ПЦР с одним стандартным набором реактивов (Диалат ЛТД, Москва). Сравнение выборок проводили по воспроизводимым и четко детектируемым ДНК-фрагментам. SCAR-PCR анализ проводили в 25 мкл реакционной смеси на термоциклере «Терцик» по одной из следующих программ: - режимы амплификации для 35S-промотора, NOS-терминатора, гена актина сои: 3 минуты 30 секунд при 94°С – предварительная денатурация, следующих 40 циклов: 20 секунд денатурация при 94°С, 40 секунд отжиг праймеров при - 54°С, 60 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 3 минуты при 72°С. - режимы амплификации для генов CP4 EPSPS, лектина сои, зеин-19: 3 минуты при 94°С – предварительная денатурация, следующих 50 циклов: 45 секунд денатурация при 94°С, 45 секунд отжиг праймеров при - 60°С, 25 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 10 минут при 72°С. - режимы амплификации для гена Cry3A: 10 минут при 94°С – предварительная денатурация, следующих 40 циклов: 30 секунд денатурация при 94°С, 30 секунд отжиг праймеров при - 60°С, 30 секунд синтез при 72°С; последний цикл синтеза 7 минут при 72°С. Электрофорез продуктов амплификации (SCAR-PCR) осуществляли в 2% агарозном геле (для детекции ГМ-сои и кукурузы) и в 3% агарозном геле (для идентификации Bt-картофеля) при напряженности электрического поля 5В/см. Визуализацию ампликонов после предварительного окрашивания бромистым этидием проводили в ультрафиолете на трансиллюминаторе ECX-20.M (Vilber Lourmat). Микросателлитный (SSR-PCR) анализ ДНК популяций насекомых яблонной плодожорки и хлопковой совки проводили в 12,5 мкл реакционной смеси, содержащей 10 mM Tris-HCl, pH 9.0, 50 mM KCl, 3,0 mM MgCl2, 50 µM каждого dNTP, 0,4µM каждого из праймеров, 0,5 U TaqДНК полимеразы и 10-50 ng ДНК. SSR-PCR проводили на термоциклере iCycler (BioRad) с предварительной денатурацией (940С 2 мин) в режиме: денатурация - 940С 30с, отжиг праймера – 580С 40с (для Сp2.39; Сp2.157; HaSSR1; HaSSR3) и 610С 40с (для Сp1.63), элонгация - 720С 40с (35 циклов), конечный синтез - 720С 3 мин. Продукты SSR-PCR разделяли в 8% полиакриламидном геле (ПААГ) длиной 20 см, толщиной 1 мм при напряжении 300-400 вольт в течение 4-5 часов. Статистический анализ данных. Молекулярно-генетическую структуру описывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку по критерию хи-квадрат и коэффициенту генетического разнообразия Шеннона. Генетическое разнообразие оценивали по Шеннону с использованием формулы: H= - Σ (pi × ln pi), где pi - частота i-го аллеля в выборке [Chalmers, 1992], а также другим методом - по Nei и Shennon, из пакета компьютерных программ POPGENE version 1.31 (Francis C.Yeh). Уровень ДНК-полиморфизма оценивали как отношение числа полиморфных ДНК-фрагментов к общему числу ДНК-маркеров. Сравнение средних по выборке проводили по критерию Стьюдента, канонический дискриминантный анализ – с использованием общепринятых методов и пакетов прикладных программ (Statistica 6.0 и SPSS 11.0). Кластерный анализ ПЦР-спектров ДНК проводили методом UPGMA (Unweighted Pair-Group Method with arithmetical Averages), определение генетических расстояний между генотипами - по Nei и Li [Nei, Li, 1979] из пакета компьютерных программ Treecon [Van de Peer, De Wachter, 1994]. Глава 3. Фенетические маркеры в изучении генетической структуры популяций вредных и полезных насекомых Рассматривая популяцию с генетической точки зрения, Н.В. Тимофеев-Ресовский и другие исследователи пришли к выводу о необходимости выделения фенетики как отдельного направления в популяционно-генетических исследованиях. Несомненно, использование фенетических маркеров, по сравнению с молекулярными, в популяционных исследованиях обладает рядом преимуществ и, прежде всего, простотой и доступностью для исследователя, но в тоже время имеет ряд существенных ограничений, о которых мы будем говорить ниже.
Целью данного этапа исследований явилось выявление закономерностей изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука в условиях взаимодействия с Bt-картофелем и химическими инсектицидами и разработка на этой основе метода прогноза развития резистентности к Bt-картофелю по фенетическим маркерам. В этой связи ставилась задача разработать новую систему описания феноформ рисунка переднеспинки колорадского жука. В настоящее время оценку фенетической структуры популяций колорадского жука Leptinotarsa decemlineata проводят, главным образом, по рисунку переднеспинки взрослых особей в соответствии с методикой, разработанной Фасулати (1986). Однако, по нашим данным, данный подход не учитывает всего многообразия феноформ в популяции и в частности слияние феноформ «A» внизу между собой и с фенокомплексами «P» и «M». Поэтому мы предложили использовать дополнительно к девяти феноформам (по Фасулати) еще фенокомплексы группы «А», описанные Кохманюк (1982) и новые феноформы, описанные нами впервые: VР; HР; VHР; HY (рисунок 1). Такой комплексный подход, включающий в себя 17 фенокомплексов, оказался оправданным при анализе ряда популяций колорадского жука Краснодарского края, где наиболее часто встречался именно описанный нами фенокомплекс НР (в среднем примерно 30%) (таблица 1). Оценка выживаемости под действием стрессового фактора наиболее часто встречаемых фенетических групп насекомых выявила тот факт, что они не являются наиболее устойчивыми к воздействию Bt-картофеля и инсектицидов (лептоцид и дурсбан). Выживаемость особей колорадского жука в условиях   Тип №1 Тип №2 Тип №3   Тип №4 Тип №5 Тип №6  Тип №7 Тип №8 Тип №9 Рисунок 1 - Основные типы (феноформы) рисунка центральной части переднеспинки имаго колорадского жука (феноформы 1-9 - по Фасулати, 1986; V, H, VH, Y - по Кохманюк, 1982; VР; HР; VHР; HY - по Киль и др., 2004) Таблица 1 - Средняя частота встречаемости феноформ в популяциях колорадского жука Краснодарского края, % (2001-2003 гг.)
пестицидного пресса не коррелировала с исходной частотой их встречаемости в популяциях. Так, например, редко встречаемые насекомые краснодарской популяции фенокомплекса VP являлись наиболее толерантными к инсектицидам (в среднем выживаемость =58,3%), а часто встречаемые феноформы 3 и НР характеризовались невысокой выживаемостью в условиях стресса (в среднем =12,9; 16,4% соответственно). Это указывало на то, что фенетическая структура популяций колорадского жука определяется не только пестицидным, но и другими стрессовыми факторами окружающей среды. По всей видимости, чувствительность различных феноформ к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука. В то же время обращала на себя внимание относительная стабильность отклика (примерно одинаковая выживаемость) жуков часто встречаемых феноформ на разные стрессовые воздействия. Несмотря на невысокие показатели устойчивости к инсектицидам, эти фенетические группы насекомых практически одинаково реагировали на различные по своему механизму действия стрессовые факторы. Это наблюдение, в свою очередь, позволило нам сделать следующий вывод о механизмах становления структуры популяций колорадского жука: фенетическая структура популяции колорадского жука определяется наличием и соотношением внутрипопуляционных групп особей, имеющих неспецифическую устойчивость к различным стрессам. Этот вывод подтверждался данными статистической обработки. Результаты анализа показывали, что фенокомплексы 3, 6, 9, НР характеризовались наименьшей дисперсией (σ²), которая на порядок, а в отдельных случаях и на два порядка, была ниже, чем у других феноформ. При этом данная закономерность прослеживалась для всех трех исследованных популяций и в течение двух лет испытаний. Вероятно, данные фенетические группы особей характеризуются неспецифической устойчивостью к различным стрессовым факторам внешней среды (засуха, холод, зной и др.), что в конечном итоге и обусловливает их наибольшую представленность в популяциях (специфическая устойчивость к инсектицидам этих феноформ в большинстве случаев ниже среднего). Становится понятным роль редких феноформ в структуре популяций колорадского жука. Скорее всего, именно эти фенетические группы насекомых являются своего рода резервом генов резистентности, отвечающих за специфическую устойчивость, например, к воздействию пестицидов. Благодаря селективному давлению неблагоприятного фактора эти особи могут выдержать значительный пестицидный пресс и получить дальнейшие преимущества по сравнению с другими особями, что позволяет популяции в целом выжить. В дальнейшем эти, первоначально редкие феноформы насекомых, ставшие впоследствии доминирующими в популяции, могут дать потомство, в котором произойдет расщепление по данному признаку, приводящее в конечном итоге к реверсии популяции к исходной структуре. Несомненно, интересным представлялась возможность проверить универсальность выявленных закономерностей формирования фенетической структуры популяций на других видах насекомых. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Российская академия сельскохозяйственных наук Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил | | Строение клеток растений и грибов Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил |
| Отдел надзора внутреннего карантина растений, качества и безопасности... Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил |  | Грант нш-197. 2008. 4 Роль организации и экспрессии генетического... Работа была основана на использовании обширных генетических коллекций кафедры генетики и селекции спбгу с использованием генетических,... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... ... | | Урок по теме «Сожительство растений с грибами и бактериями. Бактериальные... Цель урока: организовать знакомство обучающихся с ролью грибов и бактерий в жизни растений |
| Тема программы Формирование устойчивых популяций микроорганизмов и вредителей культурных растений к воздействию ядохимикатов | | Урок-соревнование по природоведению. Тема. «О наземных защитниках урожая» Цели урока. В игровой форме повторить знания об отраслях растениеводства. Сформировать представления о биологической защите сельскохозяйственных... |
| Роль комнатных растений в жизни людей. Разновидности комнатных растений Цели: познакомить учащихся с ролью комнатных растений в жизни человека; разновидностями комнатных растений | | Урока в теме Дата Тема урока Тип урока Знать: многообразие жизненных форм растений, особенности органов растений, давать характеристику общих признаков растительных организмов,... |
| Отчет о научно-исследовательской работе, выполняемой по государственному... «Разработка алгоритмов для биоинформационного анализа комплексных метаболических и молекулярно-генетических сетей» | | Биологическими Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: Повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека. Познакомить с новой группой растений комнатными... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными... |
