Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность
Скачать 0.96 Mb.
|
В то же время для моновольтинных видов, дающих в природе только одно поколение в год или в несколько лет, использование такого подхода не представляется возможным, поскольку получение резистентных генотипов в лаборатории предполагает посемейный отбор в ряду как минимум 10-20 поколений, что, в свою очередь, требует многолетней работы. При этом исходные особи насекомых должны быть чувствительными к инсектициду. Кроме того, при доминантном характере наследования признака гетерозиготные самки (самцы) при скрещивании будут снова давать расщепление по данному признаку.В этой связи нами был использован новый подход к отбору резистентных к инсектицидам генотипов. Он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких генераций, процесса селекции и постоянного посемейного отбора особей, резистентных к инсектициду. Предлагаемый нами подход заключается в том, что выборку из природной популяции обрабатывают определенной концентрацией инсектицида и наблюдают динамику смертности насекомых, отбирая при этом особей погибших первыми (чувствительные) и погибших последними, или оставшихся в живых, в зависимости от используемой концентрации инсектицида (устойчивые). При этом количество отобранных особей должно быть не более 10% от объема выборки. Кроме того, исследуемая популяция насекомых должна находиться в постоянном взаимодействии с инсектицидами и иметь высокий показатель (уровень) резистентности, что априори предполагает наличие резистентных генотипов в исследуемой выборке. Данный подход позволил нам отобрать резистентные к инсектицидам генотипы из природной популяции моновольтинного вида - клопа вредная черепашка E. integriceps. С использованием имеющегося у нас набора RAPD-праймеров нами было получено 280 ДНК-маркеров, но только по восьми из них найдены отличия между двумя группами насекомых, а наиболее характерные – по двум ДНК-фрагментам (рисунок 5). Так устойчивые к инсектициду особи характеризовались более высокой частотой встречаемости ДНК-маркера OPA18/520, а также наличием маркеров OPA07/410 и OPA06/470 при отсутствии таковых у чувствительных особей. В свою очередь для чувствительных особей было характерно 100%-ное присутствие маркера OPA06/430 при практическом отсутствии его у устойчивых особей и более высокая частота встречаемости маркеров OPA18/400, OPA07/470, OPA07/450. Наиболее характерные различия между двумя выборками наблюдали по праймеру OPA06 (RAPD-маркеры 470 и 430 п. н.). Можно было заключить, что устойчивость/чувствительность к инсектициду Би-58 определялась в данном случае присутствием двух главных RAPD-локусов, по которым отличались конкретные генотипы. Присутствие одного из маркеров, как правило, сопровождается отсутствием другого, что, вероятно, указывает на существование определенной взаимосвязи между маркируемыми локусами. Более того, вполне вероятно, что исследуемый признак контролируется большим числом генов и маркируется соответственно большим числом ДНК- 1 2 3 4 5 6 7 8 М 9 10 11 12 13 14 15 16 17   470 п.н 430 п.н.  Рисунок 5 – RAPD-фенотипы клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду Би-58 (праймер ОРА06). Дорожки: 1-8 – чувствительные особи; 9-17–устойчивые особи. М – Маркеры молекулярных масс Pst1) фрагментов. В целом влияние инсектицида Би-58 Новый на молекулярно-генетическую структуру и гетерогенность краснодарской популяции клопа вредная черепашка было весьма существенным. Оценка по наиболее значимым RAPD-маркерам между двумя исследуемыми выборками насекомых (чувствительные/устойчивые)показала, что коэффициент генетического сходства между ними был незначителен и составил 0,61 (по Nei, 1978). Важно отметить также, что наблюдаемое генетическое разнообразие клопов в резистентной выборке было (так же, как и для резистентной популяции яблонной плодожорки) достоверно меньше, чем у чувствительных особей (таблица 9). Это вполне объяснимо, так как действие инсектицида ведет к элиминации чувствительных особей, а, следовательно, и к снижению гетерогенности популяции в целом, выявляемой в частности по отдельным ДНК-локусам. Таким образом, влияние инсектицида Би-58 Новый на клопов вредной черепашки сопровождается изменениями в молекулярно-генетической структуре и снижением генетического разнообразия популяции. Поиск ДНК-маркеров резистентности к инсектицидам у моновольтинных видов природных популяций вредителей, постоянно взаимодействующих с инсектицидами, рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода. RAPD-метод позволяет оценить различия по чувствительности к инсектицидам у клопа вредная черепашка и выявить резистентные к инсектицидам генотипы. В то же время из-за низкой воспроизводимости RAPD-маркеров к их использованию для целей мониторинга резистентности необходимо подходить с осторожностью. Чтобы избежать ошибки опыта эксперименты необходимо ставить в нескольких аналитических повторностях, а сравнительный анализ ДНК проводить с одним набором реактивов, на одном амплификаторе, в одной ПЦР. Кроме того, для большей репрезентативности необходимо последующее Таблица 9 – Генетическое разнообразие и частота встречаемости отдельных RAPD-локусов в выборках клопов вредной черепашки, различающихся чувствительностью к инсектициду Би-58
преобразование RAPD- в SCAR-маркеры (sequences-characterized amplified region). В этой связи полученные данные носят лишь предварительный характер, в то же время это не снижает значимости самого подхода. В конечном итоге результаты подобных экспериментов могут дать в руки исследователю дополнительный инструмент контроля за развитием резистентности насекомых к инсектицидам и помогут лучше понять механизмы формирования этого процесса. Глава 6. Изучение экологической безопасности трансгенных растений с использованием фенетических и ДНК-маркеров Создание трансгенных или генетически модифицированных растений (ГМР) в конце прошлого века и активное их использование в мировом сельскохозяйственном производстве ставит вопрос об их экологической безопасности. Это равным образом относится и к Bt-защищенным растениям, с признаком устойчивости к вредным насекомым и в частности к Bt-картофелю, устойчивому к колорадскому жуку.
Во многих работах подтверждена взаимосвязь адаптивности популяций колорадского жука к инсектицидам с рисунком центральной части переднеспинки имаго [Кохманюк, 1982; Фасулати, 1986; Король, Новосельская, 2001]. Вот почему нам казалось естественным исследовать возможность оценки резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю (растение-инсектицид) по фенетическим маркерам, что может являться основой для более простого метода мониторинга популяций этого вредителя. В задачу данного этапа исследований входило изучение изменчивости фенетической структуры популяций колорадского жука под действием Bt-картофеля и на этой основе поиск фенетических маркеров резистентности. Для изучения взаимосвязи чувствительности популяций колорадского жука к Bt-картофелю и их фенетической структуры мы оценивали частоту встречаемости феноформ под влиянием трансгенного картофеля и чувствительность к Bt-токсину у ряда популяций Краснодарского края. По полученным данным нами проведена формализация исследуемой зависимости, на основании которой можно оценить продолжительность жизни личинок колорадского жука (IV возраста) от частоты встречаемости феноформы «V»:  5, если Х ≤ 6,5;Y= 5 + 1,4 (Х-6,5), если Х ≥ 6,5, где Y - продолжительность жизни личинок колорадского жука IV возраста (сут); Х – частота встречаемости феноформы «V» (%). Предложенная математическая модель достаточно адекватно описывает исследуемые закономерности в данной группе популяций. Возможно для других популяций колорадского жука предложенная модель может быть модифицирована. В то же время это не снижает значимости самого подхода, но только конкретизирует необходимость проведения аналогичных мероприятий для тех популяций и в тех зонах возделывания, где планируется возделывать Bt-сорта. Таким образом, мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора Bt–чувствительности фенокомплекс «V» и прогноз развития резистентности по разработанной формуле расчета. В то же время мы понимаем, что морфологический анализ и построенная на нем система мониторинга не может являться абсолютно достоверной, тем более в виду наличия значительной модификационной изменчивости фенетических маркеров в меняющихся условиях внешней среды. Вот почему мониторинг по ДНК-маркерам, как нам кажется, будет более достоверным, хотя, несомненно, и более дорогостоящей процедурой. В то же время, данный подход также может иметь право на жизнь. Вероятно, совместное использование всех доступных методов позволит проводить эффективный мониторинг резистентности популяций колорадского жука к Bt-картофелю по морфо-генетическим критериям. 6.2 Влияние Bt-картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяций и жизнеспособность нецелевых видов насекомых Одним из экологических рисков является возможное негативное влияние ГМР на нецелевую биоту, что может негативно отразиться на биоразнообразии видов и в том числе нецелевых насекомых биоценоза. В настоящее время исследователей и общественность волнует главным образом вопрос не острой токсичности ГМР, но пролонгированного действия Bt-растений на нецелевые виды биоты [Соколов и др., 2005]. Действительно, долговременное влияние Bt-токсинов (в ряду нескольких генераций насекомых) может сказаться на внутрипопуляционной структуре и генетическом разнообразии популяций организмов, населяющих биоценоз Bt-картофеля и питающихся листьями, клубнями или пыльцой трансгенного растения. Это, в свою очередь, может отразиться на адаптивности популяций и в конечном итоге на виде в целом. Кроме того, влияние Bt-токсинов может привести не к элиминации, а наоборот, к увеличению жизнеспособности насекомых, относящихся к нецелевой группе. Применительно к вредителям данное явление крайне нежелательно, так как неизбежно скажется на росте их численности и соответственно на урожае картофеля. Эти аспекты биобезопасности ГМР до настоящего времени оставались вне поля зрения ученых и требовали своего рассмотрения. Целью данного этапа исследований являлось изучить влияние Bt-токсинов на некоторые нецелевые виды насекомых, населяющих биоценоз трансгенного картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, в ряду первых нескольких генераций. В этой связи ставилась задача провести сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия в частности популяции картофельной минирующей моли при питании исходным и трансгенным (Bt) картофелем. Кроме молекулярно-генетических исследований ставилась задача провести оценку исследуемых двух групп насекомых по некоторым показателям их роста и развития, при этом в анализ планировали включать каждые пять-семь поколений насекомых. Важно отметить, что картофельная минирующая моль Phthorimaea operculell, как нецелевой вид для Bt-картофеля, устойчивого к колорадскому жуку, является удобным объектом для такого рода исследований, так как способна размножаться на искусственных питательных средах и в лабораторных условиях может дать до 13 генераций насекомых в год. Проведенный анализ исходной популяции картофельной моли и первых двадцати пяти ее генераций на среде с Bt-токсином показал, что молекулярно-генетическая структура и генетическое разнообразие популяции в условиях питания Bt-картофелем остаются неизменными. Статистически значимых отличий по показателям роста и развития также отмечено не было [Киль и др. 2008, 2009,2010]. В этом разделе автореферата представлены результаты анализа двадцатой и двадцать пятой генерации насекомых, содержащихся на среде с токсином Сry3A. Опыт проводили в лабораторных условиях. Выборки из популяции насекомых, содержащихся на искусственной питательной среде с листьями исходного и Bt-картофеля, анализировали по RAPD- и ISSR-маркерам и некоторым показателям роста и развития. Молекулярно-генетическую структуру описывали по частотам встречаемости в популяциях ДНК-маркеров и проводили сравнительную оценку по критерию хи-квадрат и коэффициенту генетического разнообразия Шеннона (Н) [Chalmers et al, 1992]. После проведения предварительного скрининга 20 RAPD- и 10 ISSR-праймеров для целей исследования были отобраны наиболее информативные четыре: RAPD-праймеры ОРА07, ОРА20, ОРВ01 и ISSR-праймер UBC810. Оценка внутрипопуляционного генетического разнообразия по Шеннону не выявила существенных различий между исследуемыми выборками насекомых, питающихся традиционным и трансгенным (Bt) картофелем. Cравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп насекомых также показал отсутствие статистически значимых различий в исследуемых выборках (таблица 10). Таблица 10 – Изменчивость молекулярно-генетической структуры и генетического разнообразия в популяции P. operculella при питании исходным и трансгенным картофелем (двадцатая генерация насекомых)
Результаты анализа насекомых картофельной минирующей моли, содержащихся при разных условиях питания по некоторым показателям роста и развития насекомых приведены в таблице 11. Можно заметить, что различия между двумя исследуемыми выборками были несущественны: фактические значения критерия Стьюдента по всем показателям были меньше табличного. Таким образом, сравнительный анализ частот встречаемости ДНК-маркеров показал, что молекулярно-генетическая структура и генетическое разнообразие популяции картофельной моли в условиях питания Bt-картофелем (сорт Луговской плюс) остаются неизменными. Статистически значимых отличий по показателям роста и развития также отмечено не было. Для оценки пролонгированного действия трансгенного Bt-картофеля на нецелевых насекомых можно использовать в качестве модельного объекта картофельную минирующую моль по предлагаемой нами методике. Оценку пролонгированного влияния ГМР на нецелевых насекомых на этапе предрегистрационных испытаний рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода, в основе которого лежит содержание поливольтинных видов насекомых на искусственной питательной среде, содержащей Bt-токсины (опыт) и исходный сорт (контроль), и сравнительный анализ изменчивости молекулярно-генетической структуры, генетического разнообразия и показателей роста и развития исследуемых двух групп насекомых. Таблица 11 – Средние значения показателей роста и развития картофельной минирующей моли в условиях питания Bt-картофелем (двадцать пятая генерация)
| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Российская академия сельскохозяйственных наук Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил | | Строение клеток растений и грибов Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил |
| Отдел надзора внутреннего карантина растений, качества и безопасности... Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил |  | Грант нш-197. 2008. 4 Роль организации и экспрессии генетического... Работа была основана на использовании обширных генетических коллекций кафедры генетики и селекции спбгу с использованием генетических,... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... ... | | Урок по теме «Сожительство растений с грибами и бактериями. Бактериальные... Цель урока: организовать знакомство обучающихся с ролью грибов и бактерий в жизни растений |
| Тема программы Формирование устойчивых популяций микроорганизмов и вредителей культурных растений к воздействию ядохимикатов | | Урок-соревнование по природоведению. Тема. «О наземных защитниках урожая» Цели урока. В игровой форме повторить знания об отраслях растениеводства. Сформировать представления о биологической защите сельскохозяйственных... |
| Роль комнатных растений в жизни людей. Разновидности комнатных растений Цели: познакомить учащихся с ролью комнатных растений в жизни человека; разновидностями комнатных растений | | Урока в теме Дата Тема урока Тип урока Знать: многообразие жизненных форм растений, особенности органов растений, давать характеристику общих признаков растительных организмов,... |
| Отчет о научно-исследовательской работе, выполняемой по государственному... «Разработка алгоритмов для биоинформационного анализа комплексных метаболических и молекулярно-генетических сетей» | | Биологическими Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: Повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека. Познакомить с новой группой растений комнатными... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными... |
