Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность

Глава 4. Молекулярно-генетический анализ популяций вредных насекомых по ДНК-маркерам Тестирование генетического разнообразия в популяциях по ДНК-маркерам позволяет проводить мониторинг их состояния вне зависимости от средовых эффектов и видовых особенностей насекомых. Современные методы молекулярно-генетического анализа позволяют оценить уровень ДНК-полиморфизма популяций, внутрипопуляционное генетическое разнообразие, установить степень генетического сходства между видами, популяциями и отдельными индивидуумами непосредственно на генетическом уровне, в отдельных случаях оценить гетерозиготность популяции, изучить генетическую изменчивость по отдельным локусам и аллелям генов. В данной главе диссертации приводятся результаты анализа ДНК-полиморфизма и молекулярно-генетической структуры различных популяций некоторых наиболее сельскохозяйственно значимых вредных видов насекомых: колорадского жука, клопа вредная черепашка, картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки. При этом проводили ПЦР анализ как природных, так и лабораторных популяций, а также насекомых из энтомологических коллекций, с использованием различных типов ДНК-маркеров (RAPD-, ISSR- и SSR-PCR). Так с использованием метода RAPD-PCR нами был исследован ДНК-полиморфизм различных популяций клопа вредная черепашка и других представителей отряда полужесткокрылых (Hemiptera). ДНК-полиморфизм различных видов клопов (Hemiptera) Всего было проанализировано 127 особей из различных таксонов. В целом по всем изученным видам насекомых с помощью праймера ОРА06 было выявлено от 16 до 35 RAPD-маркеров; с помощью праймера GT09 – от 12 до 27. Среднее число ампликонов на особь по праймерам ОРА06 и GT09 колебалось в зависимости от вида в пределах 5,6  11,7; и 4,2  13,5 соответственно. Средний уровень полиморфизма составил 92,4 % (ОРА06) и 86,2 % (GT09). Размеры продуктов амплификации варьировали от 100 до 2300 (ОРА06) и от 170 до 2700 пар нуклеотидов (GT09). По наиболее часто встречаемым и воспроизводимым ДНК фрагментам для обоих праймеров вместе (по 58 RAPD-маркерам) был проведен кластерный анализ (метод UPGMA) и канонический дискриминантный анализ (КДА). Все особи четко распределились в отдельные кластеры в соответствии с их видовой принадлежностью. При этом в самостоятельный кластер выделились особи клопов Pyrrhocoris apterus и Coreus marginatus, принадлежащих к семействам, отлич­ным от клопов-щитников (Pentatomidae). КДА подтвердил результаты кластерного анализа и позволил выявить генетическое сходство клопов вредной черепашки с клопами щитниками более отчетливо (рисунок 2). Рисунок 2 - Дискриминация девяти видов клопов в пространстве первой и второй дискриминантных функций Генетические расстояния шести исследуемых видов клопов-щитников до центроида составляли 9,4 12,7 (у клопа вредная черепашка – 12,0), тогда как представители других семейств отстояли от центроида щитников на расстоянии 13,9 (Coreus marginatus, Coreidae) и 17,6 (Pyrrhocoris apterus, Pyrrhocoridae). Таким образом, на основании проведенных исследований нам представляется необходимость в более детальном изучении таксономической принадлежности клопа вредная черепашка Eurygaster integriceps Put. и других представителей семейства Scutelleridae. Этот вид, по всей вероятности, скорее можно отнести к семейству Pentatomidae, о чем ранее высказывались и другие исследователи [Бей-Биенко и др., 1955]. ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие различных видов чешуекрылых (Lepidoptera) В данном разделе диссертации приводятся данные по молекулярно-генетической структуре различных видов чешуекрылых: картофельной минирующей моли, хлопковой совки и яблонной плодожорки. SSR-анализ различных географических популяций яблонной плодожорки Проведение молекулярно-генетического анализа популяций яблонной плодожорки C. pomonella с использованием кодоминантных маркеров, таких как микросателлиты (SSR, simple sequence repeat), стало возможным благодаря исследованиям последних лет [Zhou et al, 2005; Franck et al, 2005]. Так сконструированные французскими учеными для яблонной плодожорки SSR-праймеры [Franck et al, 2005] позволили проанализировать молекулярно-генетическую структуру популяций C. pomonella по микросателлитным локусам во Франции [Franck et al, 2007] и Чили [Fuentes-Contreras et al, 2008]. Целью данного этапа работы явилось изучение ДНК-полиморфизма и генетического разнообразия различных географических популяций яблонной плодожорки из России и Украины по трем микросателлитным локусам Ср1.63; Ср2.39 и Ср2.157 [Franck et al, 2005]. Объектом исследований явились выборки из популяций различных географических популяций яблонной плодожорки из Украины (две выборки: гг.Киев и Мелитополь) и России (четыре выборки: гг. Краснодар (Учхоз «Кубань»), Ейск («Колледж Ейский»), Ставрополь (НПК «Незлобнинский») и Санкт-Петербург). В ПЦР использовали три пары микросателлитных праймеров Ср1.63 (мотив повтора (GA)19), Ср2.39 (мотив повтора (ТС)4АС(ТС)11) и Ср2.157 (мотив повтора (GA)10). Всего было исследовано 120 насекомых (по 20 особей из каждой выборки). Наиболее высокое соотношение нулевых аллелей (более 50%) было отмечено для локуса Ср2.157, поэтому он был исключен из дальнейшего анализа. Результаты ПЦР анализа ДНК яблонной плодожорки по двум микросателлитным локусам приведены на рисунке 3. Можно заметить, что основная часть ДНК-фрагментов для локуса Ср2.39, по сравнению с Ср1.63, смещена несколько в более высокомолекулярную часть спектра. Размеры детектируемых ДНК-фрагментов варьировали от 100 до 370 пар нуклеотидов (п.н.) для Ср1.63 и от 100 до 480 п.н. - для Ср2.39. По всем M M 395 П.н. Ср1.63 M 164 195 216 318 100 Ср2.39 164 195 216 318 395 100 Рисунок 3 – SSR-фенотипы яблонной плодожорки. Электрофореграмма ампликонов C. pomonella в 8% ПААГ (ПЦР анализ по двум микросателлитным локусам Ср1.63 и Ср2.39).М-маркеры молекулярных масс, пар нуклеотидов (п.н.). популяциям в целом оба локуса были высоко полиморфны (уровень полиморфизма 100%). Среднее количество аллелей на локус по всем популяциям составило 2,3 и 3,2 для Ср1.63 и Ср2.39, соответственно. Доля гетерозигот в среднем для обоих локусов была равна 0,57 (таблица 7). ПЦР анализ насекомых из Украины и России выявил значительные отличия в молекулярно-генетической структуре исследуемых популяций C.pomonella. Среди выборок из разных стран наиболее гетерогенны были выборки из Мелитополя, Киева и Краснодара. Наиболее высокий генетический полиморфизм и генетическое разнообразие наблюдали в выборке из Мелитополя (Украина). Эта популяция характеризовалась наибольшим числом аллелей на особь (Аr = 3,2 – для локуса Ср1.63 и Аr = 7,3 для - Ср2.39), наибольшей долей гетерозигот, отсутствием нулевых гомозигот и наиболее высоким генетическим разнообразием (по двум локусам h=0,18 и I=0,29). В свою очередь, наименьшим генетическим разнообразием характеризовались выборки из Ейска и Ставрополя (h=0,04 и 0,03; I=0,08 и 0,07 по двум локусам, соответственно). Эти же выборки характеризовались наименьшим количеством выявляемых аллелей в среднем на локус и на одну особь.Полученные нами данные по генетическому полиморфизму популяций C.pomonella из России и Украины в целом сопоставимы с полученными ранее для популяций Франции, Италии, Армении и Чили (Franck et al., 2007). В работе французских исследователей наблюдали также относительно Таблица 7 – ДНК-полиморфизм и генетическое разнообразие в различных выборках из географических популяций C.pomonella по двум микросателлитным локусам Локус Показатель Выборка По всем популяциям Краснодар Ейск Ставрополь С.Петербург Киев Мелитополь Ср.1.63 Sr 110-320 110-310 110-160 100-260 100-370 100-350 100-370 A 20 11 7 15 30 24 43 Ar 2,9 1,7 1,0 1,8 3,0 3,2 2,3 N 0,10 0 0,20 0,15 0,10 0 0,09 Ht 0,80 0,45 0,10 0,60 0,65 0,80 0,57 h 0,13±0,14 0,07±0,1 0,06±0,07 0,1±0,1 0,11±0,07 0,14±0,12* 0,11±0,07 I 0,21±0,21 0,13±0,17 0,11±0,14 0,19±0,16 0,21±0,13 0,24±0,18* 0,21±0,11 Ср.2.39 Sr 100-460 190-240 200-250 100-460 100-480 100-480 100-480 A 29 7 16 16 24 25 45 Ar 4,1 0,9 1,1 1,3 4,3 7,3 3,2 N 0,05 0,40 0,70 0,25 0,05 0 0,24 Ht 0,75 0,20 0,20 0,45 0,80 1,00 0,57 h 0,12±0,10* 0,02±0,05 0,02±0,03 0,05±0,08 0,11±0,12* 0,20±0,15* 0,10±0,07 I 0,22±0,17* 0,05±0,10 0,04±0,07 0,10±0,14* 0,19±0,19* 0,31±0,23* 0,19±0,10 По всем локусам h 0,12±0,12* 0,04±0,08 0,03±0,08 0,07±0,09* 0,11±0,10* 0,18±0,14* 0,10±0,07 I 0,22±0,18* 0,08±0,14 0,07±0,11 0,13±0,15* 0,20±0,17* 0,29±0,21* 0,20±0,11 Sr – размеры ДНК-фрагментов, п.н. (пар нуклеотидов) A – число аллелей Ar – обогащенность аллелями (allelic richness) – средняя частота аллелей на особь N – доля нулевых гомозигот Ht – доля гетерозигот h – генетическое разнообразие по Nei (± стандартное отклонение) I – индекс Шеннона (± стандартное отклонение) *-достоверно отличается от ставропольской выборки (tфакт ≥ t05) более высокое число аллелей и «обогащенность» аллелями для локуса Ср2.39 по сравнению с Ср1.63 для всех исследуемых популяций (в 1,5-2 раза у популяций из европейских стран). Кроме того, анализ данных по всем исследуемым 27 выборкам так же, как и в нашей работе, выявил значительную (более 20%) долю нулевых аллелей по локусу Ср2.157.Снижение генетического полиморфизма и гетерогенности популяций C.pomonella из России (выборки из Ейска, Ставрополя и Санкт-Петербурга), вероятно, было связано с большей пестицидной нагрузкой на фруктовые сады. Так в частности нам известно, что популяции из Киева и Мелитополя, практически не подвергались инсектицидным обработкам. За последние годы в этих садах проводили от 1 до 5 обработок, тогда как, например, в Ейском районе (фруктовый сад хозяйства «Колледж Ейский») и в Ставрополе (НПК «Незлобнинский») количество обработок против вредителей ежегодно достигало 10-12. В то же время полученные данные можно рассматривать лишь как предварительные и требующие более детальной проверки на генетически однородном биоматериале (выборки из одной популяции, но с разными показателями резистентности к инсектицидам). На основании полученных данных по частотам встречаемости аллелей нами проведена оценка генетического сходства исследуемых популяций. Генетическая идентичность и генетические расстояния между исследуемыми географическими выборками из популяций яблонной плодожорки приведены в таблице 8. Таблица 8 - Генетическая идентичность и генетические расстояния [по Nei (1978) Genetics 89:583-590] Выборка Киев Мелитополь Ставрополь С.Петер-бург Краснодар Ейск Киев ***** 0.9874 0.9965 0.9971 0.9941 0.9966 Мелитополь 0.0126 ****** 0.9829 0.9857 0.9892 0.9815 Ставрополь 0.0035 0.0173 ****** 0.9987 0.9951 1.0000 С.Петер- бург 0.0029 0.0144 0.0013 ****** 0.9943 0.9991 Краснодар 0.0059 0.0109 0.0049 0.0057 ****** 0.9949 Ейск 0.0034 0.0186 0.0000 0.0009 0.0052 ****** генетическая идентичность (над диагональю) и генетические расстояния (под диагональю) Можно заметить, что наиболее близки в генетическом отношении оказались выборки из Ейска и Ставрополя (генетическая идентичность по Nei = 1,0), что, вероятно, указывает на принадлежность этих выборок к одной популяции. Это также наглядно демонстрируют данные кластерного анализа (рисунок 4), где обе эти выборки входили в один кластер. Наиболее близкой к ним с генетических позиций, несмотря на географическую удаленность, была выборка C.pomonella из Санкт-Петербурга, а наиболее удаленной от них в генетическом отношении была выборка насекомых из Мелитополя. Таким образом, описана молекулярно-генетическая структура ряда популяций яблонной плодожорки из России и Украины по микросателлитным локусам. Обнаружены значительные отличия в молекулярно-генетической структуре между популяциями как по числу аллелей на локус, степени гетерозиготности, так и по внутрипопуляционному генетическому разнообразию. Данные различия, вероятно, связаны не только с географическим положением, но и с пестицидным прессом, которому подвергались популяции насекомых. Определены Киев 0.16509 Ставрополь 0.00016 3 0.10519 1 0.05479 4 Ейск 2 0.00016 0.46805 0.05496 0.11014 С.Петербург 5 Краснодар 0.27028 Мелитополь 0.73833 Рисунок 4 - Дендрограмма по Nei's (1978). Генетические расстояния: метод UPGMA коэффициенты генетического сходства и генетические расстояния между исследуемыми выборками насекомых. Снижение гетерогенности отдельных популяций, по-нашему мнению, может быть связано с большим количеством пестицидных обработок в этих садах. Глава 5. ДНК-маркеры резистентности популяций вредителей к инсектицидам Исследование насекомых-вредителей молекулярно-генетическими методами позволяет изучать механизмы изменчивости структуры популяций под влиянием стрессовых факторов внешней среды, в том числе инсектицидов, а также приблизить нас к пониманию механизмов развития резистентности к инсектицидам непосредственно на генетическом уровне. В данной главе диссертации представлены результаты оценки влияния инсектицидов и условий года на молекулярно-генетическую структуру и генетическое разнообразие популяции яблонной плодожорки и клопа вредная черепашка. Проблема поиска ДНК-маркеров резистентности к инсектицидам по сути связана с проблемой идентификации генотипов (в нашем случае резистентных насекомых) по фенотипу (RAPD-фенотипу). Попытки идентификации резистентных к инсектицидам генотипов методом RAPD-PCR были предприняты для разных видов насекомых [Cидоренко и др., 2000; Баринов и др., 2005; Guerrero et al, 1997]. Для молекулярно-генетического анализа исследуемой популяции насекомых прежде всего необходимо иметь две группы особей, близких в генетическом отношении, но различающихся по признаку «резистентность к инсектициду». При этом выбор исходного материала для поиска молекулярных (ДНК) маркеров резистентности к инсектицидам базируется на отборе резистентных генотипов в ходе лабораторной селекции в ряду нескольких поколений поливольтинных видов насекомых при постоянном воздействии селектирующего фактора (инсектицида).

Похожие:

	Российская академия сельскохозяйственных наук Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил		Строение клеток растений и грибов Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил
	Отдел надзора внутреннего карантина растений, качества и безопасности... Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил		Грант нш-197. 2008. 4 Роль организации и экспрессии генетического... Работа была основана на использовании обширных генетических коллекций кафедры генетики и селекции спбгу с использованием генетических,...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... ...		Урок по теме «Сожительство растений с грибами и бактериями. Бактериальные... Цель урока: организовать знакомство обучающихся с ролью грибов и бактерий в жизни растений
	Тема программы Формирование устойчивых популяций микроорганизмов и вредителей культурных растений к воздействию ядохимикатов		Урок-соревнование по природоведению. Тема. «О наземных защитниках урожая» Цели урока. В игровой форме повторить знания об отраслях растениеводства. Сформировать представления о биологической защите сельскохозяйственных...
	Роль комнатных растений в жизни людей. Разновидности комнатных растений Цели: познакомить учащихся с ролью комнатных растений в жизни человека; разновидностями комнатных растений		Урока в теме Дата Тема урока Тип урока Знать: многообразие жизненных форм растений, особенности органов растений, давать характеристику общих признаков растительных организмов,...
	Отчет о научно-исследовательской работе, выполняемой по государственному... «Разработка алгоритмов для биоинформационного анализа комплексных метаболических и молекулярно-генетических сетей»		Биологическими Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: Повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека. Познакомить с новой группой растений комнатными...		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными...		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными...