Теоретическое обоснование и практическое использование молекулярно-генетических методов в защите сельскохозяйственных растений от вредителей и оценке трансгенных растений на биобезопасность

Оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-культур к их диким сородичам и традиционно возделываемым сортам Одним из аспектов экологической безопасности ГМ-культур является оценка риска вертикального переноса генов от ГМ-растений к культурным сортам и диким сородичам. Под вертикальным переносом генов понимают передачу генетического материала в поколениях половым путем. Потенциальная опасность здесь заключается в том, что новые привнесенные признаки устойчивости дадут дополнительные преимущества диким видам растений, и будут способствовать их быстрому распространению. В результате это приведет к появлению так называемых «суперсорняков» и увеличению засоренности полей, что может создать экологическую проблему. Вопросы риска вертикального переноса генов от ГМ-картофеля и ГМ-кукурузы к их диким сородичам и другим возделываемым сортам также исследованы нами с применением метода ПЦР. При этом анализ генетической вставки проводили с использованием SCAR-праймеров, направленных на регуляторные области генома, 35S-промотор (детектируемый фрагмент размером 195 п.н.), Nos-терминатор (180 п.н.) и целевые гены, в частности ген Cry3A Bt-картофеля (117 п.н.). Результаты экспериментов по вертикальному переносу генов от Bt-картофеля выявили отсутствие переноса генетической конструкции к диким видам и культурным сортам картофеля. Необходимо отметить, что, несмотря на то, что картофель является самоопылителем, перекрестное опыление может составлять у него от 0 до 20 % [Plaisted, 1980]. Если учесть, что в качестве посадочного материала в нашей стране служат клубни картофеля, а не семена, можно заключить, что риск вертикального переноса генов от трансгенного картофеля минимален. К тому же дикие родственники картофеля на территории Российской Федерации не произрастают, а если бы и произрастали, гибридные семена не образовывались бы, что подтверждалось результатами наших опытов. На закрытых сертифицированных участках опытных полей ВНИИБЗР был проведен также многолетний опыт по изучению возможности вертикальной передачи генов от раундап-устойчивой кукурузы к традиционно возделываемым сортам. В задачу исследований входило изучение возможности переноса пыльцы, дистанция рассеивания пыльцы, определение зоны безопасности и пространственной изоляции при выращивании трансгенной кукурузы. ПЦР анализ выявил наличие трансгенной вставки у образцов, взятых по различным направлениям переносимой ветром пыльцы (рисунок 6). Перенос генов от ГМ-кукурузы к традиционно возделываемым сортам наблюдали главным образом на дистанции 5-10 м, однако в отдельных случаях – до 200 м (юго-западное направление). Рисунок 6 - ПЦР-анализ семян кукурузы на наличие трансгенной вставки. Таким образом, на основании проведенных исследований можно заключить, что риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Степень перекрестного опыления между трансгенной кукурузой и культурными сортами, находящимися поблизости, будет зависеть от ряда факторов, таких как расстояние между ними, локальных барьеров на пути движения пыльцы, местного климата и топографии. Вследствие этого поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. В России дикие сородичи кукурузы не встречаются, поэтому, риск интрогрессии трансгенов от ГМ-кукурузы к ее диким видам в Российской Федерации отсутствует [Крутенко, 2006]. Вопросы ПЦР-детекции и идентификации трансгенов при мониторинге вертикального переноса генов от ГМ-культур тесно связаны с методами контроля за ГМ-семенами, зерном, растениями и продукцией на их основе. При этом встает вопрос не только детекции и идентификации трансгенов, но и их количественной оценки в образцах. Полуколичественная оценка ГМИ в семенах сои Существующие сегодня методы количественной оценки генетически модифицированных источников (ГМИ) в пище, зерне и кормах основаны главным образом на применении техники «Real Time RCR». Такая техника исследований требует использования флуоресцентной метки и дорогостоящего оборудования. Вот почему нами была предпринята попытка количественной оценки ГМИ с использованием стандартного метода ПЦР, на основе подбора оптимальных условий для высокоспецифичной амплификации ДНК [Киль, Крутенко, 2003]. Объектом исследования являлась раундап-устойчивая соя, сорт Stine 2254 RR (Монсанто, США). На рисунке 7 представлена электрофореграмма продуктов амплификации образцов ДНК сои, выделенных из навесок соевой муки с массовым содержанием ГМ-компонента 10,0 %; 5,0 %; 3,0 %; 1,0 %; 0,5 %; 0,01 %. М М М М 10% 3% 5% 1% 0,1% 0,5% Рисунок 7 - Полуколичественная оценка содержания ГМ-компонента (RR-сои) в соевой муке по целевому гену EPSPS (праймеры RR01 и RR04, размер фрагмента 356 п.н.). М-маркеры молекулярных масс (М100 bp). Можно заметить хорошо различимое изменение интенсивности полос при соответствующем изменении концентрации ГМИ в зерне, что позволяет проводить полуколичественную оценку ГМИ в образцах на основе простой визуальной оценки. Эти данные, в свою очередь, позволяют построить калибровочный график зависимости от концентрации ГМИ в образце и интенсивности ДНК-фрагмента, используя соответствующие статистические методы и программы, и на этой основе количественно оценить содержание ГМИ в исследуемом образце. Таким образом, подобрана оптимальная система полуколичественной оценки ГМИ в семенах сои (в диапазоне концентраций 0,1-10 %), что позволяет проводить быстрый и эффективный мониторинг ГМ-сои как в агроценозах, так и в сельскохозяйственной продукции на ее основе. Выводы В результате проведенных исследований можно сделать следующие основные выводы: Созданы новые более информативные системы описания фенетической структуры популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка. Чувствительность различных фенетических групп насекомых к инсектицидам не является решающим фактором, определяющим фенооблик популяций колорадского жука. Фенетическая структура популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка в первую очередь определяется соотношением внутрипопуляционных групп насекомых, имеющих различную неспецифическую устойчивость к различным стрессам, что указывает также на универсальный характер выявленных закономерностей. Выявлена сцепленность генов окраски и рисунка имаго клопов вредной черепашки с полом. Изучение популяционных процессов клопа вредная черепашка по фенетическим маркерам необходимо проводить с учетом половых различий. Выявлена высокая модификационная изменчивость фенетической структуры популяции клопа вредная черепашка, что ставит под вопрос использование фенетических маркеров при мониторинге резистентности клопов к инсектицидам. Предложен новый подход к отбору резистентных к инсектицидам насекомых для поиска ДНК-маркеров резистентности у моновольтинных видов насекомых. Новизна предлагаемого подхода заключается в том, что он не требует проведения многоступенчатого, в ряду нескольких поколений, процесса селекции и отбора особей, резистентных к инсектициду. Выявлены ДНК-маркеры резистентности к инсектицидам Би-58 Новый: RAPD-маркеры ОРА06/470 и 430 п. н. Показано генетическое сходство клопов-черепашек с другими представителям семейства щитников (Pentatomidae), что, по-видимому, указывает на принадлежность этого вида клопов скорее к семейству Pentatomidae, чем к Scutelleridae. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю можно проводить по феноформам рисунка переднеспинки имаго, используя в качестве индикатора Bt–чувствительности фенокомплекс «V» и прогноз развития резистентности - по разработанной формуле расчета. Молекулярно-генетический анализ и оценка показателей роста и развития картофельной минирующей моли свидетельствует об отсутствии позитивного / негативного влияния Bt-картофеля (сорт Луговской плюс) на генетическое разнообразие, структуру популяции, жизнеспособность и репродуктивные функции этого нецелевого вида насекомых как минимум в первых двадцати пяти поколениях. Риск вертикального переноса генов от Bt-картофеля к его диким сородичам и культурным сортам минимален, тогда как риск вертикального переноса генов от ГМ-кукурузы к культурным сортам существует. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, при этом необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. Разработан метод полуколичественной оценки содержания ГМИ, основанный на амплификации участка целевого гена CP4 EPSPS с использованием пары праймеров: RR01 и RR04, фланкирующих участок целевого гена размером 356 п.н., который позволяет проводить не только ПЦР-детекцию и идентификацию трансгенов в зерне и зернопродуктах сои, но и определять их количественное содержание. Практические рекомендации Для целей фенетического анализа популяций колорадского жука и клопа вредная черепашка предлагается использовать новые системы описания феноформ рисунка и окраски имаго насекомых. Для молекулярно-генетического анализа популяций насекомых предлагается использовать разработанную нами методику: «Методика оценки ДНК-полиморфизма популяций насекомых с помощью ПЦР (RAPD- и ISSR-PCR)». Поиск резистентных к инсектицидам генотипов в популяциях моновольтинных видов насекомых рекомендуется проводить с использованием предлагаемого нами подхода, основанного на обработке инсектицидом выборки из природной резистентной популяции. В целях быстрого и эффективного мониторинга ГМ-растений на полях и получаемых на их основе продуктов и кормов использовать предлагаемые нами методы детекции и полуколичественной оценки трансгенной вставки в биоматериале. Поля с трансгенными сортами кукурузы должны быть удалены не менее чем на 200 м от полей с культурными сортами, а также необходимо создание барьеров на пути движения пыльцы. Изоляции полей с трансгенным картофелем не требуется. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю проводить с использованием предлагаемого нами метода: «Метод оценки чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному (Bt) картофелю по феноформам рисунка переднеспинки имаго». На этапе предрегистрационных испытаний оценку пролонгированного влияния трансгенных растений на нецелевых насекомых проводить с использованием предлагаемого нами подхода и в частности оценку Bt-картофеля - по предлагаемой нами методике: «Методика оценки пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых», основанной на использовании сравнительной оценки генетического разнообразия и изменчивости молекулярно-генетической структуры внутрипопуляционных групп особей по ДНК-маркерам. Список работ, опубликованных по теме диссертации Монография Киль, В.И. ДНК технологии в защите сельскохозяйственных растений от вредных насекомых [Текст] / В.И. Киль, Россельхозакадемия, ВНИИ биологической защиты растений.- Краснодар: ООО «Просвещение-Юг», 2009.- 160 с.: ил.; – Библиогр.: с.128-159.-300 экз. – ISBN- 978-5-9900297-4-3. Статьи в изданиях, рекомендуемых ВАК для публикации основных результатов диссертации на соискание ученой степени доктора наук Киль, В.И. Генетически модифицированный картофель, устойчивый к колорадскому жуку [Текст] / Киль В.И., Надыкта В.Д. // Агро ХХI.- 2002. - № 1.– С.12-15. Киль, В.И. Оценка риска вертикального переноса генов у Bt-картофеля и других трансгенных культур [Текст] / Киль В.И. // Агрохимия.-2003.-№ 4.- С.81-89. Киль, В.И. Управление развитием резистентности колорадского жука к Bt-защищенному картофелю [Текст] / Киль В.И. // Агро XX1.- 2003/2004.- №7-12.- С.22-24. Киль, В.И.. Выгоды и преимущества возделывания трансгенных растений [Текст] / Киль В.И., Исмаилов В.Я., Надыкта В.Д // Достижения науки и техники АПК.-2003.-№.10.-С.26-30. Киль, В.И. Резистентность вредителей к трансгенному картофелю и другим Bt-защищенным культурам [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А., Крутенко Д.В.// Агрохимия.-2004.-№7.-С.77-91. Киль, В.И. Мониторинг резистентности колорадского жука к трансгенному картофелю по фенетическим маркерам [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А. // Агрохимия.-2006.-№2.-С.58-64. Киль, В.И. О полиморфизме RAPD-маркеров у различных таксонов полужесткокрылых (Hemiptera) [Текст] / В.И. Киль, В.В. Гронин, Д.В. Крутенко, В.Я. Исмаилов // Сельскохозяйственная биология.- 2008.-№1.-С.70-76. Киль, В.И. Идентификация резистентных к инсектицидам генотипов в популяции клопа вредная черепашка по фенам рисунка и RAPD-маркерам [Текст] / В.И. Киль, В.Я. Исмаилов // Агрохимия.- 2009.-№1.-С.38-49. Киль, В.И. Изучение пролонгированного действия трансгенного (Bt) картофеля на нецелевых насекомых [Текст] / В.И. Киль, Е.Н.Беседина, М.В.Пушня, В.Я.Исмаилов // Труды Кубанского государственного аграрного университета.-2010.-Выпуск 1(22).-С.96-100. Статьи в реферируемых журналах Киль, В.И. Морфологические маркеры чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному картофелю [Текст] / Киль В.И., Головатенко Н.А. // Наука Кубани.-2004.-№ 3, ч.1.-С.116-119. Киль, В.И. Генетичесие маркеры чувствительности популяций колорадского жука к трансгенному картофелю [Текст] / Киль В.И., Гронин В.В. // Наука Кубани.-2005.-№4-С.126-130. Киль В.И. Молекулярно-генетическая структура популяции картофельной минирующей моли Phthorimaea operculella Z. (Lepidoptera:Gelechiidae) [Текст] / Киль В.И., Крутенко Д.В., Гронин В.В. // Наука Кубани-2007-№4.-С.25-29. Киль, В.И. Использование метода RAPD-PCR для выявления резистентных к инсектициду Би-58 генотипов клопов вредной черепашки [Текст] / В.И. Киль, М.В. Пушня, Ж.А. Ширинян // Наука Кубани.-Приложение.-2008.-С.87-92. Киль, В.И. RAPD-анализ популяции хлопковой совки Helicoverpa armigera Hbn. (Lepidoptera:Noctuidae) [Текст] / В.И. Киль, Ж.А. Ширинян // Наука Кубани.- Приложение.- 2008.-С.176-179. Киль, В.И. Влияние трансгенного картофеля на молекулярно-генетическую структуру популяции и жизнеспособность картофельной минирующей моли в ряду генераций [Текст] / Киль В.И., Беседина Е.Н., Пушня М.В., Исмаилов В.Я // Наука Кубани.-2009.-№3.- С.69-73. Киль В.И. ДНК полиморфизм клопов вредной черепашки Eurygaster integriceps Put (Hemiptera: Scutelleridae) по межмикросателлитным локусам [Текст] / Киль В.И // Наука Кубани.-2009.-№4.-С.42-45.

Похожие:

	Российская академия сельскохозяйственных наук Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил		Строение клеток растений и грибов Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил
	Отдел надзора внутреннего карантина растений, качества и безопасности... Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил		Грант нш-197. 2008. 4 Роль организации и экспрессии генетического... Работа была основана на использовании обширных генетических коллекций кафедры генетики и селекции спбгу с использованием генетических,...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... ...		Урок по теме «Сожительство растений с грибами и бактериями. Бактериальные... Цель урока: организовать знакомство обучающихся с ролью грибов и бактерий в жизни растений
	Тема программы Формирование устойчивых популяций микроорганизмов и вредителей культурных растений к воздействию ядохимикатов		Урок-соревнование по природоведению. Тема. «О наземных защитниках урожая» Цели урока. В игровой форме повторить знания об отраслях растениеводства. Сформировать представления о биологической защите сельскохозяйственных...
	Роль комнатных растений в жизни людей. Разновидности комнатных растений Цели: познакомить учащихся с ролью комнатных растений в жизни человека; разновидностями комнатных растений		Урока в теме Дата Тема урока Тип урока Знать: многообразие жизненных форм растений, особенности органов растений, давать характеристику общих признаков растительных организмов,...
	Отчет о научно-исследовательской работе, выполняемой по государственному... «Разработка алгоритмов для биоинформационного анализа комплексных метаболических и молекулярно-генетических сетей»		Биологическими Защита растений от вредителей: Учебник для вузов / под ред. В. В. Исаичева. М.: Колос, 2002. 472с с ил
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: Повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека. Познакомить с новой группой растений комнатными...		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными...		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: повторить классификацию растений, значение растений в жизни человека, познакомить с новой группой растений комнатными...