На правах рукописи
АДОНИНА
Ирина Григорьевна
ХАРАКТЕРИСТИКА САТЕЛЛИТНЫХ ПОВТОРОВ ВИДОВ
Aegilops L. СЕКЦИИ Sitopsis И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ В КАЧЕСТВЕ МОЛЕКУЛЯРНЫХ МАРКЕРОВ
Генетика - 03.00.15
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск
2007
Работа выполнена в лаборатории молекулярной генетики злаков Института цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: Доктор биологических наук Салина Елена Артемовна, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Доктор биологических наук, Дымшиц Григорий Моисеевич, Институт цитологии и генетики СО РАН, г. Новосибирск
Доктор биологических наук, Агафонов Александр Викторович, Центральный Сибирский ботанический сад СО РАН, г. Новосибирск
ВЕДУЩЕЕ УЧРЕЖДЕНИЕ: Институт молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта, РАН, г. Москва
Защита диссертации состоится "___"__октября__2007 г. на утреннем заседании диссертационного совета по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора биологических наук (Д-003.011.01) в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу: 630090, г. Новосибирск-90, проспект академика Лаврентьева, 10, факс: (3833) 333-12-78, e-mail: dissov@bionet.nsc.ru
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке
Института цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан "___"__________________2007 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор биологических наук А.Д. Груздев
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. Дикие виды пшениц и эгилопсов несут в себе гены устойчивости ко многим биотическим (болезни и вредители) и абиотическим (низкие и высокие температуры, избыток или недостаток влаги и др.) факторам; характеризуются значительным разнообразием морфологических признаков, белков и ферментов, влияющих на хлебопекарные качества зерна (Friebe et al., 1996; Лапочкина, 1999; Valkoun, 2001; Гончаров, 2002). Поскольку на сегодняшний день собственный генетический потенциал хлебной (мягкой) пшеницы, Triticum aestivum L., почти исчерпан, вовлечение в селекционный процесс видов-сородичей может способствовать созданию новых, высокоурожайных и наделенных ценными признаками сортов этой важнейшей сельскохозяйственной культуры. В связи с чем, изучение генофонда диких видов представляется особенно актуальной задачей.
T. aestivum является естественным аллогексаплоидом с геномной формулой BBAADD. Все пять видов Aegilops L. секции Sitopsis: Ae. speltoides Tausch; Ae. longissima Schweinf. and Muschl.; Ae. sharonensis Eig; Ae. bicornis (Forsk.) Jaub. and Spach. и Ae. searsii Feld. and Kis., рассматриваются разными исследователями в качестве возможных доноров генома B (Feldman, 2001; Гончаров, 2002), хотя в последнее время большинство данных указывают на Ae. speltoides, как на наиболее вероятного донора данного генома. Тот факт, что единого мнения в решении данной проблемы до сих пор не удалось достигнуть, свидетельствует о недостатке информации о геномах этих видов. У растений, в частности у злаков от 15% до 80% генома приходится на повторяющиеся последовательности (Lapitan, 1992; Shapiro and von Sternberg, 2005), которые могут иметь дисперсную локализацию в геноме, либо образовывать тандемные кластеры. Причины поддержания в геноме столь значительного количества разнообразных повторяющихся последовательностей остаются до конца невыясненными, что само по себе определяет интерес к изучению данной фракции ДНК. Пул некодирующих повторяющихся последовательностей ДНК в геноме подвергается постоянным изменениям. Дивергенция и становление видов часто сопровождаются образованием новых семейств видоспецифичных повторов (Flavell, 1982). В изменчивости тандемных повторов, к которым относятся как микросателлиты (simple sequence repeats – SSR) с длиной мономера не более 6 пар нуклеотидов, так и макросателлиты, длина мономера которых чаще всего колеблется в пределах от 100 до 400 пн (Zhao and Ganal, 1996; Sharma and Raina, 2005), важную роль играет варьирование числа мономеров в кластере. Гетерогенность повторяющихся последовательностей лежит в основе использования их в качестве высокополиморфных генетических маркеров, как для селекционной работы, так и в эволюционных исследованиях. Поиск новых молекулярных маркеров – вот вторая, не менее важная причина, вызывающая интерес к исследованию повторяющихся последовательностей ДНК.
Среди злаков, входящих в состав трибы Triticeae Dum., микросателлитные повторы достаточно хорошо изучены и широко используются в качестве молекулярных маркеров у представителей родов, имеющих важное сельскохозяйственное значение, таких, как пшеница (Triticum L.), рожь (Secale L.), ячмень (Hordeum L.). Молекулярно-генетическая карта T. aestivum содержит более 1500 SSR-маркеров (Bryan et al., 1997; Pestsova et al., 2000a; Röder et al., 2004). Что касается диких видов-сородичей, - были выделены и охарактеризованы динуклеотидные микросателлитные последовательности Ae. tauschii Coss., донора генома D мягкой пшеницы (Pestsova et al., 2000a). Работы по изучению микросателлитов видов Aegilops секции Sitopsis до недавнего времени не проводились. Недостаточно изучен также потенциал макросателлитных повторов этих видов в качестве молекулярных маркеров.
Таким образом, можно сделать вывод, что характеристика сателлитных повторов видов Aegilops секции Sitopsis и изучение возможности использования их в качестве молекулярных маркеров является актуальной проблемой генетики злаков и практического растениеводства.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы - изучение сателлитных повторов видов Aegilops секции Sitopsis и их использование в анализе гибридных форм злаков, а так же для уточнения филогенетических взаимоотношений между видами. В работе были поставлены следующие задачи:
Выявление микросателлитных локусов в геномах видов Aegilops секции Sitopsis с помощью праймеров к микросателлитам T. aestivum и их характеристика.
Оценка возможности использования SSR-маркеров для уточнения филогенетических взаимоотношений видов Aegilops и Triticum.
Анализ популяционного полиморфизма макросателлитных повторов Spelt1 и Spelt52 у видов Aegilops секции Sitopsis.
Изучение эффективности использования SSR и геном-специфичных субтеломерных повторов Spelt1 и Spelt52 в качестве маркеров генетического материала Aegilops при отдаленной гибридизации.
Научная новизна работы. Впервые проведена оценка амплификации 253 микросателлитных маркеров T. aestivum в геномах Aegilops секции Sitopsis. 103 маркера локализованы на хромосомах исследованных видов.
Продемонстрирована эффективность комплексного подхода при использовании геном-специфичных субтеломерных повторов Spelt1 и Spelt52 и SSR-маркеров T. aestivum для анализа гибридных форм мягкой пшеницы, полученных с участием Aegilops секции Sitopsis.
Практическая ценность работы. Установлена хромосомная локализация 103 микросателлитных маркеров T. aestivum в геномах Aegilops секции Sitopsis.
Разработаны подходы к использованию геном-специфичных субтеломерных повторов Spelt1 и Spelt52 в качестве маркеров генетического материала Aegilops при отдаленной гибридизации.
С помощью макро- и микросателлитных маркеров определены локализация и протяженность участков генетического материала Ae. speltoides в двух интрогрессивных линиях T. aestivum × Ae. speltoides.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Большинство микросателлитных локусов генома B мягкой пшеницы присутствуют в геномах видов Aegilops секции Sitopsis и расположены в гомеологических группах хромосом.
Уровень популяционного полиморфизма микросателлитов зависит от способа размножения видов Aegilops.
Субтеломерные макросателлитные повторы Spelt1 и Spelt52 характеризуются не только межвидовым, но и значительным популяционным полиморфизмом.
SSR-маркеры T. aestivum и геном-специфичные макросателлитные повторы Spelt1 и Spelt52 эффективны при комплексном использовании для анализа гибридных форм мягкой пшеницы, полученных с участием Aegilops секции Sitopsis.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 11ой конференции EWAC (Новосибирск, 2000); 6ой исследовательской конференции Гатерслебена (Германия, 2000); Международном симпозиуме "Молекулярные механизмы генетических процессов и биотехнология" (Москва-Минск, 2001); 3-й Конференции BGRS (Новосибирск, 2002); Международной конференции по полиплоидии (Лондон, Великобритания, 2003); III съезде ВОГиС (Москва, 2004) и обсуждались на отчетной сессии ИЦиГ СО РАН (2001, 2004).
Публикации. По результатам исследования опубликовано 15 работ, в том числе 7 статей в рецензируемых изданиях.
Объем и структура работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, изложения результатов, обсуждения, заключения, выводов, списка литературы и приложения. Материал диссертации изложен на 161 странице печатного текста, включая 8 таблиц и 21 рисунок. Список цитированной литературы содержит 199 работ.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Растительный материал. В работе были использованы 16 образцов видов Aegilops секции Sitopsis (табл. 1). Семена пятнадцати из них получены от профессора М. Фельдмана (Feldman M., Вейсмановский институт науки, Израиль).
Семена интрогрессивных линий, полученных от скрещивания T. aestivum сорта «Родина» (2n = 42) с Ae. speltoides К-389 (2n = 14, SS) (Лапочкина, 1999), а также семена родительских форм T. aestivum и Ae. speltoides любезно предоставлены И.Ф. Лапочкиной (Институт сельского хозяйства нечерноземных районов России, Немчиновка, Московская область) и Т.А. Пшеничниковой (ИЦиГ СО РАН).
Для определения хромосомной локализации микросателлитных маркеров в геноме Aegilops использовались дисомные дополненные линии T. aestivum–Ae. speltoides (Friebe et al., 2000), T. aestivum–Ae. longissima (Friebe et al., 1993), и T. aestivum–Ae. searsii (Friebe et al., 1995), любезно предоставленные профессором Б. Фрибе (Friebe B., Центр генетических ресурсов пшеницы, США). В качестве контроля использовали сорт T. aestivum “Chinese Spring”.
Суммарную ДНК растений выделяли по методике Дрейпера и Скотта с применением протеиназы К (Дрейпер и др., 1991).
Таблица 1. Образцы видов Aegilops секции Sitopsis, использованные в работе.
Вид
|
Геном
|
Образец
|
Географическое происхождение
|
Ae. speltoides
Tausch
|
S
|
TS47
TS42
TS41
TS05
TS01
К-389*
|
Израиль
Израиль
Израиль
Израиль
Израиль
|
Ae. longissima
Schweinf. and Muschl.
|
Sl
|
TL15
TL09
TL05
TL04
TL03
|
Израиль
Иордания
Израиль
Израиль
Израиль
|
Ae. sharonensis
Eig
|
Slsh
|
TH02
TH01
|
Израиль
Израиль
|
Ae. searsii Feld. and Kis.
|
Ss
|
TE12
TE16
|
Израиль
Сирия
|
Ae. bicornis
(Forsk.) Jaub. and Spach.
|
Sb
|
TB05
|
Египет
|
* - образец из коллекции ВИР, Санкт-Петербург
Микросателлитный анализ. Микросателлитный анализ проводили согласно методике Родер с соавторами (Röder et al., 1998). В работе использовано 253 пары праймеров SSR-маркеров мягкой пшеницы.
Математическая обработка данных. Результаты микросателлитного анализа использованы для уточнения филогенетических взаимоотношений видов Aegilops и Triticum. На основании полученных данных составлялась бинарная матрица, в которой присутствие или отсутствие каждого фрагмента амплификации обозначалось как 1 или 0. При помощи пакета программ PHYLIP (Version 3.57c) (Felsenstein, 1995) были определены генетические расстояния для каждой пары образцов по Нею (Nei and Li, 1979). Построение дендрограмм выполнено по методу UPGMA (Unweighted Pair Group Method with Arithmetic Mean) (Sokal and Rholf, 1995) с применением программы MEGA3 (Kumar, et al., 2004). Для оценки достоверности построенных деревьев, проводили бутстреп-анализ для 100 повторностей, с помощью программы SEQBOOT (Felsenstein, 1995).
Методы гибридизации. Макросателлитные повторы Spelt1 и Spelt52 были использованы в качестве зондов для дот-гибридизации с геномной ДНК, иммобилизованной на нейлоновом фильтре (Kafatos et al., 1979); «squash»-дот гибридизации с ДНК меристематической ткани корешков (Hutchinson et al., 1985) и флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) (Schubert et al., 1998).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Идентификация SSR-локусов в геномах видов Aegilops секции Sitopsis с помощью праймеров к микросателлитам T. aestivum.
Изоляция микросателлитов непосредственно из геномов изучаемых видов – процесс трудоемкий и дорогостоящий. В нашей работе для выявления SSR-локусов Aegilops были использованы праймеры к фланкирующим районам микросателлитов T. aestivum. Для проведения микросателлитного анализа с локализацией маркеров на хромосомах были выбраны виды: Ae. speltoides, Ae. longissima, Ae. searsii и полученные с их участием пшенично – эгилопсные дополненные линии. Учитывались все воспроизводимые продукты амплификации с длиной, типичной для микросателлитных маркеров пшеницы (70–300 пн). Использование 253 SSR-праймеров мягкой пшеницы показало, что с помощью 88% праймеров маркеров генома B, 72% праймеров маркеров А-генома и 74% праймеров к SSR-локусам генома D выявляются фрагменты амплификации с ДНК исследованных видов (Adonina et al., 2005). Таким образом, наибольший процент праймеров, обеспечивающих амплификацию фрагментов ДНК видов Aegilops секции Sitopsis приходится на праймеры маркеров B-генома T. aestivum. Это естественно, поскольку данные виды рассматриваются в качестве доноров именно этого генома мягкой пшеницы. То, что маркеры геномов A и D мягкой пшеницы амплифицируются у видов секции Sitopsis, может свидетельствовать о древнем происхождении этих районов ДНК, а также об их высоком уровне консервативности.
Больше всего маркеров T. aestivum, 70%, амплифицируется в геноме Ae. speltoides. Для этого же вида было выявлено наибольшее количество полиморфных маркеров, 161 из 177 амплифицирующихся (90%). Внутри вида Ae. longissima оказались полиморфными 75% амплифицирующихся маркеров. Более высокий уровень полиморфизма микросателлитных маркеров у Ae. speltoides, объясняется тем, что данный вид – единственный перекрестноопыляемый представитель секции Sitopsis.
Использование дополненных пшенично – эгилопсных линий позволило нам локализовать 103 маркера на хромосомах исследованных видов Aegilops. В качестве примера на рисунке 1 представлен амплификационный профиль маркера Xgwm382 у видов Aegilops и в дополненных линиях.
|
