Биологический факультет кафедра биоинженерии «Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп: устройство и методы измерений»

МОСКОВСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ им. М.В.ЛОМОНОСОВА БИОЛОГИЧЕСКИЙ ФАКУЛЬТЕТ КАФЕДРА БИОИНЖЕНЕРИИ «Лазерный сканирующий конфокальный микроскоп: устройство и методы измерений» Методическая разработка к задаче Большого практикума Содержание 1. Введение -3- 2. Основные компоненты конфокального микроскопа Leica TCS SPE -5- 2.1 Общий вид -5- 2.2 Инвертированный микроскоп -6- 2.3 Устройство лазерного и сканирующего модулей -8- 2.4 Программное обеспечение – LAS AF -9- 3. Измерения с использованием конфокального микроскопа -12- 3.1 Включение прибора, начало работы -12- 3.2 Сканирование образца -12- 3.2.1 Настройка спектральных каналов -12- 3.2.2 Параметры сканирования - вкладка Acquisition -13- 3.2.3 Оптимизация изображения -13- 3.2.4 Сканирование изображения образца в проходящем свете -14- 3.2.5 Сканирование по оси Z -14- 3.2.6 Спектральный режим, λ-сканирование -15- 3.3 Сохранение результатов эксперимента -15- 3.4 Выключение прибора -16- Список литературы -17- 1 Введение Впервые концепция конфокальной микроскопии была разработана в середине 1950-х гг. аспирантом Гарвардского университета Марвином Мински (Marvin Minsky). Но широкий интерес к этой области проявился лишь в 1980-х гг., благодаря бурному развитию компьютерной и лазерной технологий. Сегодня лазерная сканирующая конфокальная микроскопия является незаменимым инструментом для широкого спектра исследований в биологии и медицине. Термин “конфокальная” означает “софокусная” – в плоскости, оптически сопряженной с фокальной плоскостью объектива, находится конфокальная диафрагма. Это позволяет регистрировать сигнал лишь от тонкого слоя. Оптический принцип конфокальной микроскопии схематично представлен на рис. 1. Наиболее часто встречающейся задачей для конфокальной микроскопии, благодаря ее высокому разрешению и контрасту, является изучение структуры клеток и их органелл, например, цитоскелета, ЭПР, лизосом, митохондрий, ядра, хромосом и даже генов. Исследуется также cо-локализация в клетке двух и более веществ. Еще одна задача – исследование динамических процессов, происходящих в живых клетках. Например, клеточного транспорта биологически-активных соединений, изменений концентрации и распределения ионов кальция. Записав в памяти компьютера серию оптических срезов, можно провести объемную реконструкцию объекта и получить его трехмерное изображение, не используя трудоемкую методику изготовления и фотографирования серийных гистологических срезов. Новыми перспективными направлениями являются методики FRAP – Fluorescence Recovery After Photobleaching (восстановление флуоресценции после фотоотбеливания) и FRET – Fluorescence Resonance Energy Transfer (флуоресцентный резонансный перенос энергии). FRAP применяется для исследования подвижности биологических молекул, FRET – для определения расстояния между молекулами разных типов, их окружения и взаимодействия. Но это, конечно, далеко не все применения конфокального микроскопа в биологических исследованиях. а б в Рис. 1. Принцип конфокальной фильтрации сигнала. Луч лазера (непрерывная линия) с помощью селективного зеркала (СЗ) направляется в объектив микроскопа и фокусируется в точку Т0 в глубине исследуемого объекта. Флуоресценция, излучаемая из этой точки (прерывистая линия), собирается объективом и фокусируется линзой Л в сопряженной фокальной плоскости объектива, проходя через отверстие в конфокальной диафрагме (КД) к фотоэлектронному умножителю (ФЭУ) (а). Флуоресценция, излучаемая из точек Т+ (б) и Т_ (в), дефокусирована на КД и к ФЭУ не проникает. Тем самым обеспечивается подавление флуоресценции, испускаемой из точек образца, расположенных выше и ниже фокуса объектива, и улучшается разрешение вдоль оптической оси объектива. 2 Основные компоненты конфокального микроскопа Leica TCS SPE 2.1 Общий вид Система для конфокальной лазерной сканирующей микроскопии Leica TCS SPE включает в себя инвертированный микроскоп для биомедицинских исследований (1), сканирующий модуль (сканирующая головка) (2), системный блок персонального компьютера со встроенным лазерным модулем и блоком питания для всей системы (3), управляемый гальванометром столик для фокусировки (4), электронный блок, контролирующий автоматизированные компоненты микроскопа (5), источник света для возбуждения флуоресценции (6), компьютерный стол (7), стол для микроскопа с защитой от вибрации (8), мышку (9), клавиатуру (10), монитор (11). Рис. 2. Система для лазерной сканирующей конфокальной микроскопии Leica TCS SPE. 2.2 Инвертированный микроскоп Преимуществом инвертированного микроскопа перед прямым является то, что толщина исследуемого образца не ограничена рабочим расстоянием объектива. Благодаря этому можно использовать специальную посуду, например, чашки Петри, планшеты или специальные кюветы. Это очень удобно при исследовании живых клеток, находящихся в питательной среде. А Б В I3 N2.1 Pol BF A 1.5 Рис. 3. Инвертированный микроскоп Leica DMI 4000B. А – общий вид микроскопа: 1 – окуляр, 2 – передняя панель, 3 – экран, 4 – грубая и тонкая настройка фокуса, 5 – револьверная головка для объективов, 6 – конденсор, 7 – основание конденсора, 8 – полевая диафрагма. Б – панель управления освещением: INT –интенсивность освещения проходящим светом, AP – апертурная диафрагма, FD – полевая диафрагма, TL/IL – переключение из режима проходящего света в режим флуоресценции. В – передняя панель: ) – 100% света в окуляры, I3, N2.1, A – флуоресцентные кубики (см. табл.1), Shutter – затвор. В зависимости от характера объекта используют различные способы микроскопии: обычная световая микроскопия используется для изучения окрашенных препаратов (амплитудные объекты); для изучения неокрашенных (фазовых) препаратов, (живых клеток и бактерий) применяют фазово-контрастную и интерференционную (ДИК) микроскопию, темнопольную микроскопию применяют для наблюдения сильно рассеивающих свет живых микробов (спирохеты), для наблюдения флуоресцирующих объектов (иммунофлюоресценция, флюорохромирование) – люминесцентную (флуоресцентную) микроскопию. Гораздо реже для изучения биологических объектов используют поляризационную и другие специальные способы микроскопии. Рассмотрим подробнее метод флуоресцентной микроскопии. При этом методе в оптическую схему микроскопа вводятся два светофильтра (объединены в специальный блок – кубик) (рис. 4). Первый светофильтр пропускает от источника-осветителя излучение только тех длин волн, которые возбуждают люминесценцию либо самого объекта, либо специальных красителей, введённых в препарат и поглощённых его частицами. Второй светофильтр пропускает к глазу наблюдателя (или на фоточувствительный слой) только свет флуоресценции. В инвертированном микроскопе препарат освещается через объектив, который в этом случае служит и конденсором. Наблюдение при освещении через объектив иногда называют «флуоресцентной микроскопией в отражённом свете»; этот термин условен – возбуждение свечения препарата не является простым отражением света. Рис. 4. Схематичное изображение фильтр – кубика для флуоресценции. Таблица 1. Фильтр-кубики для флуоресценции. Фильтр-кубик Диапазон возбуждения Фильтр для возбуждения флуоресценции Дихроичное зеркало Фильтр для испускаемого света A УФ BP 340-380 400 LP 425 I3 синий BP 450-490 510 LP 515 N2.1 зеленый BP 515-560 580 LP 590 BP – band pass filter – фильтр с указанной полосой пропускания LP – long pass filter – фильтр, пропускающий весь свет после указанной в маркировке длины волны 2.3 Устройство лазерного и сканирующего модулей В системе Leica TCS SPE лазерный модуль встроен в системный блок компьютера. Световые пучки от разных (405, 488, 532 и 635 нм) лазеров (1) с помощью системы зеркал (2) сводятся в один соосный пучок и через акустооптический перестраиваемый фильтр АОПФ (3) заводятся в оптическую систему микроскопа (рис. 5А). Акустооптический фильтр за счет быстро-изменяемой пропускающей способности на заданных длинах волн пропускает в микроскоп только то лазерное излучение, которое используется в данный момент для возбуждения флуоресценции, блокируя свет на остальных лазерных длинах волн. Также АОПФ позволяет быстро и точно изменять интенсивность возбуждающего света. А Б Рис. 5. А – сканирующая головка и системный блок со встроенным лазерным модулем: 1 – лазеры, 2 – система зеркал, 3 – АОПФ, 4 –светоделительное устройство, 5 – система зеркал-сканеров, 6 – объектив, 7 – детектор проходящего света, 8 – конфокальная диафрагма, 9 – призма, 10 – щель (шторки), 11 – коллиматор, 12 – ФЭУ. Б – спектральный принцип выделения измеряемого сигнала. Светоделительное устройство (4) эффективно подавляет свет на длине волны генерации лазера и пропускает через себя остальной свет. Это позволяет завести лазерный луч в объектив (6), а также с минимальными потерями пропустить собранный объективом флуоресцентный сигнал к системе детекции. Луч лазера проходит через объектив и фокусируется в заданную точку образца. С помощью системы из двух зеркал-сканеров (5) лазерный луч перемещается от точки к точке в плоскости препарата XY. Испускаемый образцом флуоресцентный сигнал собирается тем же объективом, а затем через конфокальную диафрагму (8) и спектральную оптическую схему направляется на детектор - фотоэлектронный умножитель ФЭУ (12). Конфокальная диафрагма (8) помещается в сопряженной фокальной плоскости объектива, точнее, в той плоскости, где микроскоп фокусирует сигнал, собранный из фокуса объектива. В этом случае через диафрагму пройдет только та флуоресценция, которая испускается из небольшого объема вблизи фокуса лазерного луча под объективом. Сигналы, идущие от слоев выше и ниже фокуса, оказываются дефокусированными на конфокальной диафрагме и через нее к ФЭУ не проникают. Диаметр конфокальной диафрагмы можно варьировать, тем самым, изменяя толщину оптического слоя вблизи фокуса объектива, от которого измеряется сигнал. Фирма Leica в лазерных сканирующих конфокальных микроскопах серии TCS SP полностью отказалась от использования оптических фильтров для селекции сигнала, построив оптическую схему на спектральном принципе (Рис. 5Б). Флуоресцентный сигнал, прошедший через конфокальную диафрагму разлагается призмой (9) в спектр. Часть спектра направляется на ФЭУ (12) через щель (10). Ширина щели регулируется, что выполняет функцию фильтров, перестраиваемых по ширине и диапазону длин волн пропускания. Предельное спектральное разрешение этого прибора составляет 5 нм. 2.4 Программное обеспечение - LAS AF Окно программы LAS AF состоит из четырех основных областей (рис. 6). Это (1) – меню с традиционными кнопками File и Help; (2) – ряд панелей Configuration, Acquire, Process, Quantify; (3) – вкладки, соответствующие панелям; (4) – окно просмотра, в котором отображаются изображения во время сканирования; (4а) – панель инструментов для просмотра изображения и выбора области интереса. Рис. 6. Окно программы LAS AF. Рассмотрим подробнее назначение панелей Configuration, Acquire и Process. Configuration - конфигурация микроскопа - во вкладке Objective (Объектив) приведены некоторые важные параметры для установленных на микроскопе объективов (увеличение, числовая апертура, иммерсия, толщина покровного стекла, расчетное разрешение в плоскости ху и по z); - во вкладке Dyes (Красители) находится база данных спектров поглощения и флуоресценции некоторых флуорохромов. Рис. 6. Панель Configuration. Acquire – необходимые настройки для сканирования изображения. - Experiments – директория временного хранения файлов – сюда записываются все изображения, сделанные в данном эксперименте. - Acquisition (рис. 7) – настройки параметров записи изображения. Во вкладке Acquisition Mode выбираем режим сканирования: 2D: xy, xz, xt; 3D: xyz, xyt, xyλ; 4D: xyzt. Во вкладке XY установки формата изображения, скорости сканирования, электронного увеличения zoom, диаметра конфокальной диафрагмы pinhole. Вкладка Z-Stack содержит настройки сканирования по оси Z. Рис. 7. Панель Acquire вкладка Acquisition. - Beam Path (Путь луча) – настройки спектральных каналов (рис. 8). Здесь выбираем лазер для возбуждения флуоресценции, светоделительное устройство beam splitter, устанавливаем границы диапазона детекции. Рис. 8. Панель Acquire вкладка Beam Path. Рис. 9. Панель Process. Process – обработка полученных изображений (рис. 9). После того как изображение получено, можно его отредактировать (вкладка Edit), например, обрезать, изменить размеры или даже соединить несколько изображений (каналов) в один файл. Можно “улучшить” изображение (вкладка Adjust) – сделать его более резким, менее шумным, поменять цвет, есть также возможности для 3D деконволюции. Из стопки изображений z-stack можно сделать 3D-проекцию (вкладка Visualisation), которую потом можно повернуть и посмотреть на объект как бы сбоку. Вкладка Dye Separation содержит возможности для более точного разделения сигналов нескольких флуорохромов на основе их спектров флуоресценции. 3 Измерения с использованием конфокального микроскопа 3.1 Включение прибора, начало работы Перед включением необходимо убедиться, что на предметном столике отсутствует препарат и объектив отведен от столика! Система Leica TCS SPE включается переключателем ON/OFF на системном блоке. При этом подается питание все компоненты системы, компьютер выполняет начальную загрузку. Микроскоп включается кнопкой на электронном блоке, начинается инициализация микроскопа. Прежде чем запускать программное обеспечение LAS AF, необходимо убедиться, что инициализация микроскопа закончилась. Начало работы происходит как на обычном флуоресцентном микроскопе: - на покровное стекло подготовленного образца нанести капельку иммерсионной жидкости, поместить образец на предметный столик (убедитесь, что образец размещен надежно и правильно); - в режиме проходящего света TL/BF (Transmitted Light / Bright Field – Проходящий свет/Яркое поле) настроить фокусировку, выбрать область образца для исследования; - включить ртутную лампу, прогреть в течение 15 мин, установить регулятор мощности (яркости свечения) лампы в минимальное положение; - перейти из режима проходящего света в режим флуоресценции IL (Incident Light – “Отраженный Свет”); - выбрать кубик, соответствующий присутствующему в образце красителю (см. табл. 1); - открыть затворы Shutter (затвор есть как в лампе, так и в микроскопе); - увеличить мощность лампы, наблюдать в окуляры флуоресценцию образца. Чтобы избежать обесцвечивания биологического образца, время облучения и мощность лампы должны быть минимальными. Включение лазеров В системе использованы твердотельные диодные лазеры, их не нужно долго прогревать перед началом работы. Лазеры включают поворотом ключа на системном блоке (при этом загорается лампочка) за 5-10 мин до предположительного начала сканирования. 3.2 Сканирование образца Прежде чем приступить к сканированию изображения необходимо установить некоторые параметры. 3.2.1 Настройка спектральных каналов - во вкладке Acquire выбрать панель Beam Path; - активировать лазеры кнопкой Visible; - выбрать линию возбуждения (для удобства выбора линии возбуждения и диапазона детекции в программе записаны спектры некоторых флуоресцентных красителей), установить мощность (для начала разумно выбрать 15-20%); - установить соответствующий выбранному лазеру beam splitter (405/532 или 488/635); - установить диапазон детекции (доступный диапазон 430 – 750 нм); (необходимо, чтобы расстояние от линии возбуждения до левой границы области детекции было не менее 5 нм! – чтобы избежать интерференции от отраженного света); - установить Gain (усиление детектора) примерно 500. 3.2.2 Параметры сканирования - вкладка Acquisition - выбрать режим сканирования Acquisition Mode – xyz; - установить формат изображения Format 512×512, скорость сканирования Scan speed 400 Гц; - нажать кнопку Live – начнется предварительное непрерывное сканирование, при этом на образце будет виден лазерный лучик; - для окончания предварительного сканирования нажать кнопку Stop. Система Leica TCS SPE позволяет записывать последовательно до 8-ми каналов. Для этого необходимо активировать во вкладке Acquisition кнопку Seq (sequence) (она должна стать оранжевой). Теперь во вкладке Beam Path можно добавлять необходимое число каналов и настраивать каждый канал по отдельности. 3.2.3 Оптимизация изображения В процессе предварительного сканирования изображение можно оптимизировать в отношении яркости, контрастности и конфокальности. Для этого удобно перевести изображение в псевдоцвета (панель инструментов с левой стороны окна). При этом пикселы, интенсивность которых выходит за верхний предел динамического диапазона детектора будут окрашены синим (зашкал), а пикселы, имеющие значение 0 – зеленым. Нужно, чтобы интенсивность всех пикселов была в пределах динамического диапазона детектора, т.е. на изображении были лишь единичные синие и зеленые пикселы. Gain отвечает за интенсивность, яркость изображения. Рекомендуется использовать настолько низкую интенсивность лазерного излучения, насколько это возможно, чтобы предотвратить обесцвечивание образца. Для этого придется увеличить усиление детектора (Gain). Эта установка управляет пропускной способностью АОПФ. Следует учитывать, что при увеличении Gain уменьшается соотношение сигнал/шум. Offset позволяет установить контрастность, уровень интенсивности, ниже которого пикселам присваивается значение 0. Pinhole – конфокальная диафрагма, роль которой – улучшить разрешение микроскопа вдоль оптической оси объектива (оси Z). Уменьшение диаметра конфокальной диафрагмы уменьшает Z, но при этом снижается и интенсивность сигнала, который диафрагма пропускает к ФЭУ, а, следовательно, увеличивается соотношение сигнал/шум. Как правило, оптимальным является Pinhole, соответствующий диску Эйри. Format – размер изображения в пикселах. Доступны следующие форматы сканирования: 128×128, 256×256, 512×512, 1024×1024, 2048×2048. Zoom – электронное увеличение (1× ÷ 16× с шагом 0,1). Чем больше format и zoom, тем меньше размеры пикселов и расстояние между ними, т.е. с большей точностью отслеживаются детали изображения. При увеличении размеров пикселов происходит потеря в разрешении конфокального микроскопа; при уменьшении их размеров разрешение с определенного момента не увеличивается, но могут появиться структуры на изображении, которых на самом деле нет. Кроме того, в этом случае возрастает плотность энергии лазерного излучения на препарате, что может привести к его выгоранию. Для дальнейшего улучшения качества изображения можно замедлить скорость сканирования Scan speed (доступны значения 400, 600 и 800 Гц), давая возможность большему количеству фотонов попадать на детектор (при 400 Гц система будет сканировать 400 линий за 1с) и применять метод усредненного изображения Frame Average для устранения случайного шума. После того, как все необходимые параметры сканирования установлены нажать кнопку Start для записи окончательного изображения. 3.2.4 Сканирование изображения образца в проходящем свете Помимо флуоресцентного конфокального изображения можно получить соответствующее ему изображение образца в проходящем свете. Для этого во вкладке Beam Path нужно включить канал Transmission Channel в одном из имеющихся спектральных каналов, или добавить отдельный канал для проходящего света. Активировать детектор для проходящего света, поставив галочку В меню настроек канала проходящего света доступны следующие методы контрастирования: светлое поле (BF), темное поле (DF), фазовый контраст (PH), дифференциально-интерференционный контраст (DIC), наблюдение в поляризованном свете (Pol). При выборе того или иного метода микроскоп автоматически конфигурирует всю необходимую оптику. Аналогично флуоресцентным каналам, яркость и контрастность видимого канала настраивают при помощи Gain и Offset. 3.2.5 Сканирование по оси Z Для настройки параметров сканирования по z во вкладке Acquisition выбираем панель Z-Stack. Для начала нужно установить положение начальной и конечной плоскости, передвигая колесиком мышки плоскость внутри кубика (см. рис. 7), при этом удобно использовать режим предварительного сканирования. Затем, если в настройках Z-Stack выбрать функцию system optimized программа сама рассчитает толщину оптического среза, при которой можно получить максимальное разрешение при выбранном объективе. Однако это теоретически полученное значение заведомо превышает разрешающую способность, а время сканирования значительно увеличивается. Оптимальный размер оптического среза при использовании объективов с числовой апертурой 1,15 и 1,3 составляет примерно 0,5 и 0,3 мкм соответственно. 3.2.6 Спектральный режим, λ-сканирование Полный спектральный массив данных регистрируется путем проведения серии повторных сканирований выбранного оптического сечения образца с последовательным сдвигом щели вдоль спектра. Ширина щели регулируется, и она выполняет функцию фильтров, перестраиваемых по ширине и диапазону длин волн пропускания. Предельное спектральное разрешение этого прибора составляет 5 нм. Чтобы перейти в режим λ-сканирования, во вкладке Acquisition выбираем режим сканирования Acquisition Mode – xyλ. В панели Beam Path настраиваем спектральный канал: - проверить, что лазеры активны (кнопка Visible); - выбрать линию возбуждения, установить мощность; - установить нейтральный фильтр, ND-splitter for TLD [%] 30/70, уменьшающий интенсивность излучения (на 70%) без изменения относительного спектрального распределения; - установить диапазон детекции; (необходимо, чтобы расстояние от линии возбуждения до левой границы области детекции было не менее 5 нм! – чтобы избежать интерференции от отраженного света); - в режиме предварительного сканирования передвигая курсор вдоль диапазона детекции найти предполагаемый максимум спектра испускания; - установить Gain и Offset; - нажать кнопку Start. 3.3 Сохранение результатов эксперимента - на диске С в папке Users создать свою директорию, назвать директорию своей фамилией; - во вкладке Acquire выбрать Experiments; - каждую стопку изображений (z-stack) необходимо сохранить как отдельный эксперимент, для этого в меню File выбрать New experiment; - щелкая правой кнопкой мыши на каждом эксперименте, выбрать Export as…; - изображения рекомендуется сохранять в формате Tiff; - примерный размер файлов: 512 × 512 × 1 канал = 350 KB, 1024 × 1024 × 2 канала = 2,1 MB, 1024 × 1024 × 3 канала × 50 срезов = 160 MB. 3.4 Выключение прибора - отвести объектив от образца, убрать образец с предметного столика, мягкой салфеткой удалить с объектива остатки иммерсионной жидкости; - выключить лазеры поворотом ключа после выключения лазеров должно пройти 5-10 мин до выключения питания, чтобы система могла охладиться; - выключить микроскоп; - выключить ртутную лампу; - выйти из программы LAS AF; - записать полученные изображения на CD-диск или другой носитель; - завершить работу компьютера; - отключить питание выключателем ON/OFF. Список литературы 1. Феофанов А.В., Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия с возможностью спектрального анализа в биологических исследованиях. 2. Lakowicz J.R., Principles of Fluorescence Spectroscopy (2-nd edition), Kluwer Academic/Plenum Publishers, New York, NY, 1999. 3. Описание к инвертированному микроскопу для биомедицинских исследований Leica DMI400 B 4. Руководство по эксплуатации системы Leica TCS SPE 5. http://www.leica-microsystems.com/Confocal_Microscopes 6. http://www.olympusconfocal.com/theory/index.html 7. http://www.microscopyu.com/articles/confocal/

Похожие:

	Структура и динамика дальневосточных морей россии и Лазерный деформограф, лазерный нанобарограф, лазерный измеритель вариаций давления гидросферы, лазерный гидрофон, собственные колебания...		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Факультет русской филологии и журналистики. Факультет истории и юриспруденции. Факультет татарской и сопоставительной филологии....
	Российской федерации Эконометрика дает методы экономических измерений, методы оценки параметров моделей микро- и макроэкономики. Важно, что эконометрические...		Годовая рабочая программа календарный план практических занятий по... Современные методы цитологических исследований. Оптические приборы, используемые в цитологии. Световой микроскоп, его устройство,...
	Организация ученического самоуправления Факультетское образование: филологический факультет с изучением 2-х иностранных языков, физико-математический факультет с элементами...		Факультет биологический Кафедра ботаники утвержден Учебно-методический комплекс по дисциплине опд. Ф. 02. 1 “Физиология растений” составлен в соответствии с требованиями Государственного...
	Факультет биологический Кафедра ботаники утвержден Учебно-методический комплекс по дисциплине опд. Ф. 02. 1 “Физиология растений” составлен в соответствии с требованиями Государственного...		Конспект урока профессия: «Закройщик», срок обучения 4 года, 3 курс... Тип урока: Совершенствование знаний по теме «Снятие измерений, анализ измерений»
	Тематическое планирование. Биология 6 класс Знать устройство увеличительных при-боров и правила работы с ними, уметь подготовить микроскоп к работе		Стоматологический микроскоп: незаменимый инструмент в эндодонтической практике Сегодня ведущие практикующие стоматологи и исследователи сходятся во мнении, что стоматологический микроскоп в эндодонтии расширил...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Оборудование – микроскоп, чашки Петри, предметное стекло, покровное стекло, пипетки, пластилин, цветные карандаши, микроскоп с видеокамерой...		Факультет экономики, менеджмента и международного туризма Рабочая программа дисциплины «Интернет-технологии в туризме». Учебное издание для студентов, обучающихся по направлению 100400. «Туризм»....
	Рабочая программа По дисциплине Методы и средства измерений, испытаний и		Программа «Фонд образовательных инноваций» ниу вшэ соболева Ирина... Факультет прикладной политологии, кафедра теории политики и политического анализа
	Обществознание (факультет политических и социальных наук) Федеральным государственным научным учреждением «федеральный институт педагогических измерений»		Материалы для самостоятельной работы по дисциплине Введение Правовые основы обеспечения единства измерений. Основные положения закона РФ об обеспечении единства измерений. Государственная...