Феофанова наталья Александровна Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии
Скачать 309.34 Kb.
|
На правах рукописи ФЕОФАНОВА Наталья Александровна Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии 14.03.09 – клиническая иммунология, аллергология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук Новосибирск – 2010 Работа выполнена в Учреждении РАМН Научно-исследовательском институте клинической иммунологии Сибирского отделения РАМН Научный руководитель: доктор медицинских наук Орловская Ирина Анатольевна Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Останин Александр Анатольевич доктор медицинских наук, профессор Шурлыгина Анна Вениаминовна Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (г. Москва) Защита состоится «_18_» ___марта___ 2010 года в _16___ часов на заседании диссертационного совета Д 001.001.01 в НИИ клинической иммунологии СО РАМН по адресу: 630099, г. Новосибирск, ул. Ядринцевская, 14 С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ клинической иммунологии СО РАМН Автореферат разослан «_17__» __февраля_________ 2010 г. Ученый секретарь диссертационного совета доктор биологических наук Кудаева Ольга Тимофеевна ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы Эффективность трансплантации гемопоэтических стволовых клеток (ГСК) при той или иной патологии зависит, прежде всего, от функционального состояния трансплантируемых клеток. Для ГСК основными функциональными характеристиками являются способность к миграции в костномозговую нишу (хоминг), дальнейшему самоподдержанию, пролиферации и дифференцировке в зрелые клетки гемопоэтической и лимфоидной систем. Актуальным является поиск методов воздействия на функциональную активность ГСК с целью повышения эффективности трансплантации и ускорения восстановления кроветворной системы. В процессе трансплантации в первую очередь должен произойти хоминг ГСК, этот этап является одним из определяющих факторов успеха трансплантации. Хоминг ГСК протекает с участием хемокинов, молекул адгезии (CXCR4/SDF1, VLA4/VCAM1, LFA-1/ICAM-1, CD44/HA, c-kit/KL) и заканчивается "заякориванием" клетки в своей нише. Взаимодействие адгезивного рецептора СD44 с лигандом – гиалуроновой кислотой (ГК) играет важную роль в процессах хоминга ГСК и репопуляции кроветворных органов [Legras et al., 1997; Peled et al., 2000; Avigdor et al., 2004]. ГК продуцируется клетками гемопоэтического микроокружения и является одним из важнейших компонентов экстрацеллюлярного матрикса («структурный организатор»). ГК поддерживает адгезию, рост, дифференцировку и регулирует миграцию клеток [Lee, Spicer, 2000]. В условиях тотального облучения организма в кроветворных органах происходит быстрое снижение уровня ГК, нарушение ее синтеза отмечается и под действием химиотерапевтических воздействий [Young et al., 1994; Rehakova et al., 1994]. Таким образом, воздействие на хоминг ГСК посредством модулирования свойств костномозговой ниши с помощью введения гиалуроновой кислоты актуально для совершенствования трансплантационных технологий. Следующим этапом в процессе трансплантации после закрепленя ГСК в костномозговой нише является пролиферация и дальнейшая дифференцировка в зрелые клеточные элементы. Важно, чтобы в процессе пролиферации не происходило истощения пула ГСК, т.е. сохранялась способность ГСК к самоподдержанию. Усиление пролиферативной активности под действием цитокиновых коктейлей in vitro, как правило, ассоциировано с потерей способности к самоподдержанию ГСК [Zandstra et al., 1997, Henschler et al., 1994]. В последние годы были открыты внутриклеточные сигнальные пути, отвечающие за регуляцию самоподдержания ГСК, такие как Notch, Wnt и Hedgehog [Stier et al., 2002; Reya et al., 2003; Bhardwaj et al., 2001], однако возможность управлять ими с помощью фармакологических воздействий на сегодня ограничивается достаточно малым числом известных препаратов. К таким веществам относятся ингибиторы гистондеацетилаз [Young, 2004], ингибиторы GSK3beta [De Felice et al., 2005], ретиноевая кислота [Purton et al., 1999], с помощью которых удается достигнуть существенной экспансии ГСК in vitro. Актуальным является изучение функциональной активности ГСК после стимуляции самоподдержания in vitro в условиях трансплантации, разработка подходов, сочетающих фармакологические воздействия на ГСК с подходами клеточной терапии. Трансплантацию ГСК в терапии тяжелых аутоиммунных заболеваний (АИЗ) начали применять в конце 1990 годов после ряда успешных преклинических исследований на экспериментальных моделях. Комбинация иммуносупрессивной терапии с трансплантацией аутологичных стволовых клеток позволяет достичь улучшения в течении АИЗ (системная красная волчанка, рассеянный склероз) [Burt et al., 2008; Jayne et al., 2004; Tyndall, Gratwohl, 2009]. Имеются основания полагать, что АИЗ, наряду с лимфопролиферативными, являются следствием дефекта функциональной активности ГСК. Некоторые авторы рассматривают системные и органоспецифические АИЗ как «болезнь стволовой клетки» (polyclonal hemopoietic stem cell proliferative syndrome) [Ikehara, 2003]. ГСК мышей MRL-lpr/lpr с аутоиммунной патологией (животная модель системной красной волчанки) отличаются повышенной радиорезистентностью, изменение их пролиферативно-дифференцировочных потенций проявляется уже на ранней стадии, до клинических проявлений заболевания [Ikehara, 2001; Топоркова и др., 2002]. Исследование количественных и функциональных характеристик ГСК при аутоиммунной патологии, помимо научного, имеет и клинический интерес, с целью их последующей коррекции, в том числе при оптимизации технологий трансплантации ГСК. Поскольку усиление пролиферативной активности ГСК может быть обусловлено дефектом апоптоза, можно полагать, что коррекция пролиферации и дифференцировки ГСК с помощью воздействий, регулирующих апоптоз, позволит создать условия для более эффективной трансплантации гемопоэтических клеток при аутоиммунной патологии. Цель работы – исследование эффективности трансплантации клеток костного мозга при модуляции функциональной активности ГСК в норме и при аутоиммунной патологии. Задачи
Научная новизна Впервые показана способность гиалуроновной кислоты повышать эффективность хоминга ГСК в кроветворные органы при внутривенном введении реципиентам в сочетании с сингенной трансплантацией клеток костного мозга. Впервые показано повышение эффективности трансплантации клеток костного мозга (усиление гемопоэза и повышение выживаемости) при внутривенном введении реципиентам гиалуроновой кислоты. Впервые показано отсутствие преимуществ трансплантации клеток костного мозга, инкубированных с вальпроевой кислотой, по сравнению с интактными клетками костного мозга. Показан негативный эффект преинкубации клеток костного мозга с вальпроевой кислотой перед трансплантацией на выживаемость реципиентов. Впервые показано, что в процессе развития аутоиммунного заболевания мышей MRL-lpr/lpr происходит изменение функциональных характеристик CD34+клеток костного мозга: снижается относительное количество CD34+ клеток в костном мозге, уменьшается процент CD34+ клеток, находящихся в состоянии апоптоза. Впервые показана способность фармакологических стимуляторов апоптоза модулировать функциональную активность ГСК аутоиммунных мышей MRL-lpr/lpr: усиление апоптоза CD34+ клеток под действием ингибитора протеинкиназы С (Н7) и ингибитора фосфодиэстеразы 4 (ролипрам), подавление дифференцировки ГСК в эритроидном направлении под действием ингибитора протеинкиназы С (Н7) и ингибитора фосфоинозитид-3-киназы (вортманнин). Впервые показано, что в условиях трансплантации клеток костного мозга сочетание усиления апоптоза и подавления эритроидной дифференцировки ГСК аутоиммунных мышей MRL-lpr/lpr под действием ингибитора протеинкиназы С (Н7) угнетает костномозговое кроветвоение реципиентов. Научно-практическая значимость Экспериментальные данные, полученные в работе, расширяют представления о механизмах регуляции функциональной активности гемопоэтической стволовой клетки, открывают возможность разработки нового подхода к повышению эффективности трансплантации ГСК, основанного на усилении процесса миграции ГСК в костномозговую нишу (хоминга) с помощью введения гиалуроновой кислоты реципиентам. Положения, выносимые на защиту 1. Введение гиалуроновой кислоты реципиентам при трансплантации клеток костного мозга усиливает процесс хоминга ГСК в костномозговую нишу, стимулирует гемопоэз и повышает выживаемость реципиентов. 2. Стимуляция сниженного апоптоза CD34+ клеток аутоиммунных мышей MRL-lpr/lpr спровождается снижением уровня эритроидной дифференцировки ГСК мышей MRL-lpr/lpr in vitro до контрольных показателей. 3. Усиление апоптоза CD34+ клеток аутоиммунных мышей MRL-lpr/lpr и снижение эритроидной дифференцировки не оказывает положительного влияния на репопуляцию кроветворных органов реципиентов при трансплантации клеток костного мозга. Апробация диссертации Результаты работы представлены на международных конференциях Progress in fundamental and applied sciences for human health. International Multidisciplinary Congress, Sudak, Ukraine, June 10-21, 2004; Международной конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий», Новосибирск, Россия, 1-2 декабря 2005г; 2009 World Stem Cell Summit, Baltimore, USA, September 21-23, 2009. Объем и структура диссертации Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных исследований, обсуждения полученных результатов и выводов. Материал изложен на 101 странице машинописного текста, вкючающего 5 таблиц и 29 рисунков. Прилагаемая библиография содержит ссылки на 194 литературных источника, в том числе, 187 иностранных. Публикации По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 3 статьи в журналах, определенных ВАК РФ для публикации научных результатов диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук. Автор выражает благодарность с.н.с. лаборатории иммунобиологии стволовой клетки Топорковой Л.Б., с.н.с. лаборатории молекулярной иммунологии Лопатниковой Ю.А., зав. лаборатории клеточной иммунотерапии д.м.н. Черных Е.Р. и с.н.с. лаборатории клеточной иммунотерапии Тихоновой М.А. за помощь и поддержку, оказанную при выполнении работы. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ Животные. В экспериментах использовали мышей (CBAxC57Bl/6)F1, С57Bl/6 в возрасте 2-6 мес., полученных из лаборатории экспериментальных животных (моделей) Института клинической иммунологии СО РАМН, мышей MRL-lpr/lpr, полученных из вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Животных содержали в условиях вивария в пластиковых клетках на сбалансированном питании и свободном доступе к воде. Всего в работе использовано около 1000 животных. Реактивы и среды. Среда RPMI-1640, L-глутамин сухой стерильный, фосфатный буфер, сыворотка крупного рогатого скота (КРС) получены из ГНЦ вирусологии и биотехнологии "Вектор", Новосибирская обл., п. Кольцово. Среда М 3434, содержащая КРС, эритропоэтин, IL3, IL6 – от Stem Cell Technologies, Canada. Антитела анти-CD34 мыши, конъюгированные c PE, получены от Ebioscience, PharMingen, San Diego, США. ДМСО, бычий сывороточный альбумин (БСА), пропидиум иодид, вальпроевая кислота, ретиноевая кислота, гиалуроновая кислота петушиного гребня и человеческой пуповины получены от Sigma-Aldrich. Вортманнин, Н7 и ролипрам получены от ICN. Carboxyfluorescein diacetate succinimidyl ester (CFSE) получен от Molecular Probes. Прижизненное мечение клеток костного мозга флуоресцентной меткой CFSE 1. Клетки в количестве 5-10х106 ресуспендировали в 1 мл фосфатного буфера, содержащего 5% сыворотки КРС в новой пробирке. 2. Помещали пробирку горизонтально, добавляли 110 мкл фосфатного буфера на несмоченную поверхность пластика верха пробирки и ресуспендировали в нем 1,1 мкл 5мМ стока CFSE . 3. Закрывали пробирку, быстро переворачивали несколько раз и перемешивали на вортексе. 4. После смешивания оставляли клетки для мечения на 5 минут при температуре 37С в темноте. 5. Дважды отмывали клетки 10 объемами фосфатного буфера, содержащего 5% сыворотки КРС, центрифугированием при 300g 5 минут с удалением супернатанта [Parish, Warren, 2001]. Мечение антителами, конъюгированными с флуоресцентной меткой Мечение осуществляли согласно рекомендациям фирмы-производителя антител. 1. К клеткам в количестве 200х103 в 50 мкл добавляли антитела в дозе 1мкл на пробу. 2. Инкубировали 20 минут при комнатной температуре в темноте. 3. Дважды отмывали клетки в 1 мл фосфатного буфера центрифугированием при 1500 об/мин. с удалением супернатанта. 5. Осадок ресуспендировали в 500 мкл фосфатного буфера. Анализ клеточного цикла производили методом проточной цитофлюориметрии (FACSCallibur, Becton Dickinson). Анализ клеточного цикла. Клеточный цикл определяли по содержанию ДНК в клетках, окрашенных пропидиум иодидом (4 мкг/мл): определяли относительное содержание клеток с диплоидным (клетки в G0/G1 фазах клеточного цикла) и гипердиплоидным (клетки в S/G2M фазах клеточного цикла) набором ДНК. Апоптотические клетки, ДНК которых подвергалась фрагментации, формировали характерный гиподиплоидный пик. Анализ клеточного цикла производили методом проточной цитофлюориметрии (FACSCallibur, Becton Dickinson). Определение количества белка в моче. Количество белка в моче определяли колориметрически с красителем Кумасси бриллиантовый синий по методу Брэдфорд [Bradford, 1976], концентрацию белка рассчитывали по калибровочной кривой, построенной по БСА (100-1000 мкг/мл), результаты выражали в мг/мл. Облучение животных. Облучение животных производили на аппарате РУМ-25 при мощности 0,5 Гр/мин, напряжении 130 кВ, силе тока 10мА. Летальная доза составляла 7.0 – 8.5 Гр в соответствии с индивидуальной радиочувствительностью используемых линий мышей. Сублетальная доза составляла 6,5 Гр для мышей (CBAxC57Bl/6)F1. Оценка колониеобразующей активности костного мозга методом полутвердых культур. Реципиентов облучали в летальной дозе, через 24 часа вводили исследуемую клеточную суспензию внутривенно в концентрации 1х106 клеток/мышь. Через 7 суток оценивали колониеобразующую активность костного мозга реципиентов. Осуществляли забой животных, костный мозг вымывали из бедренной кости с помощью шприца кондиционной средой RPMI1640, содержащей 10% КРС, и подсчитывали количество клеток в 1 мл. Для определения числа коммитированных предшественников клетки костного мозга в концентрации 50х103/мл инкубировались в 24-луночных планшетах в метилцеллюлозной среде М 3434. Гранулоцитарно-макрофагальные (КОЕ-ГМ), эритроидные (КОЕ-Э) и смешанные (КОЕ-ГЭММ) колонии подсчитывались под инвертированным микроскопом после 14-дневной инкубации при температуре 370С, 5% СО2 согласно рекомендациям Stem Cell Techologies, Canada. |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Фонд оценочных средств по учебной дисциплине эпидемиология Способен применять знания общих закономерностей происхождения и развития жизни, регуляции и саморегуляции в норме и патологии, с... |  | Темы рефератов по физколлоидной химии Осмос, осмотическое давление в осуществлении функций живого организме в норме и при патологии |
| Определение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови... Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования | | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального... Целью курса является изучение особенностей сексологического развития и информированности человека в норме и при патологии и его значение... |
| Рабочая учебная программа по дисциплине Изучить морфологические, цито-, биохимические и функциональные особенности клеток крови, особенности картины периферической крови... | | Патоморфологическая характеристика тимуса у детей по материалам аутопсий актуальность В последние годы появился ряд отдельных научных публикаций, характеризующих экспрессию некоторых иммуногистохимических маркеров в... |
| Учебно-методический комплекс по дисциплине Сравнительная политология ... | | Исследование влияния ацетилсалициловой кислоты на функциональную... Название учреждения образования: Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение «Средняя общеобразовательная школа №108» |
| Роль и значение вестибулярной системы в физиологической функции зрительной... Рф (с изменениями от 16 марта, 27 ноября 2000 г., 17 февраля 2004 г.), утвержденного приказом Минобразования РФ от 27 марта 1998... | | Курсовая работа по технологии лекарств тема: «Производство мазей... «Производство мазей Влияние фармацевтических факторов на биофармацевтические характеристики мазей» |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Елкина Наталья Николаевна, выпускница нашей школы 1987 года. Она же и была разработчиком программы непрерывного курса изучения информатики.... | | Проблемная комиссия 28. 01 «Гормональная регуляция процессов жизнедеятельности... В 2012 году Научным советом по эндокринологии и входящими в его состав тремя проблемными комиссиями проводились научные исследования... |
| «Деление клетки. Митоз» Цель: в результате овладения содержанием модуля вы должны получить знания о непрямом делении клетки – митозе, о подготовке клетки... | | Диссертация на тему: «Влияние кросс-культурных факторов на содержание... «Влияние кросс-культурных факторов на содержание стандартов и практик учр в гостинице Novotel MoscowCentre» |
| Антипролиферативное действие карнозина и его производных на опухолевые... Федеральное государственное бюджетное учреждение «научный центр неврологии» российской академии медицинских наук | | Диплом Влияние различных факторов окружающей среды на частотную восприимчивость... Влияние различных факторов окружающей среды на частотную восприимчивость человеческих органов слуха |
