Феофанова наталья Александровна Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии
Скачать 309.34 Kb.
|
Определение количества колониеобразующих единиц селезенки КОЕ-с8. Клетки костного мозга в количестве 0,5х105/мышь вводили внутривенно летально облученным реципиентам. На 8-е сутки производили забой реципиентов, после фиксации селезенок в реагенте Телесницкого (состав: уксусная кислота и этиловый спирт в объемном соотношении 1:4) подсчитывали число макроскопически видимых колоний в селезенках [по Till, McCuloch, 1964]. Определение количества форменных элементов крови. Количество форменных элементов (лейкоцитов и тромбоцитов) периферической крови определяли в образцах крови объемом 40 мкл, взятых из кончика хвоста животного, с помощью гематологического анализатора ERMA PCI90 (Япония). Забор крови производили у 5 животных из группы, выбранных случайным образом; размер каждой экспериментальной группы составлял 10 животных. Статистическая обработка данных. Статистическая обработка данных проводилась с помощью пакета статистических программ “STATISTICA 5.0”. Достоверность обнаруженных межгрупповых различий оценивали с использованием t-критерия Стьюдента. Данные представлены как среднее значение ± ошибка среднего значения. Обработку данных по выживаемости животных проводили с использованием критерия Каплан-Мейера. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Влияние внутривенного введения гиалуроновой кислоты на эффективность хоминга гемопоэтических предшественников при трансплантации клеток костного мозга Взаимодействие поверхностного рецептора адгезии СD44 со своим лигандом – гиалуроновой кислотой (ГК) играет одну из ведущих ролей в процессах хоминга ГСК и репопуляции костномозговой ниши [Avigdor et al., 2004]. В отличие от взаимодействий адгезивной молекулы VLA4 со своим рецептором VCAM, необходимых для закрепления ГСК только в костномозговых нишах, CD44/ГК взаимодействия необходимы для хоминга ГСК как в костном мозге, так и в селезенке [Vermeulen et al., 1998]. В условиях тотального облучения организма в костном мозге и селезенке происходит быстрое снижение уровня гликозаминогликанов, включая ГК [Rehakova et al., 1994]. При внутривенном введении ГК уже через 4 часа происходит ее специфическое накопление в печени, лимфатических узлах, селезенке и костном мозге, максимальная концентрация ГК в этих органах сохраняется и через 24 часа после введения [Fraser et al., 1983]. Таким образом, происходит длительное изменение концентрации ГК и модуляция микроокружения ГСК в кроветворных органах. Можно предположить, что введение в организм реципиентов ГК совместно с трансплантацией ГСК окажет воздействие на эффективность хоминга и закрепления ГСК в своей нише. Чтобы выяснить, оказывает ли внутривенное введение в организм гиалуроновой кислоты влияние на процессы хоминга ГСК и репопуляции органов кроветворения у мышей (CBAхС57Bl/6)F1, мы использовали следующую экспериментальную схему: реципиентам опытной группы вводили внутривенно гиалуроновую кислоту, растворенную в 200 мкл среды RPMI1640 в количестве 100мкг/мышь (доза единичного введения) в день облучения за час до и через час после облучения, а также на следующий день за два часа до трансплантации ККМ. Реципиентам контрольной группы вводили среду RPMI1640. Были протестированы препараты гиалуроновой кислоты, полученые из петушиного гребня и человеческой пуповины. Для оценки эффективности хоминга кроветворных предшественников летально облученным реципиентам контрольной и опытной групп трансплантировали меченые флуоресцентной меткой CFSE клетки костного мозга в количестве 107 клеток на мышь. Через 21 час после трансплантации определяли процент трансплантированных клеток (CFSE+) в лейкоцитарной фракции суспензии клеток костного мозга и селезенки методом проточной цитофлюориметрии. Отдельно определяли процент трансплантированных кроветворных предшественников CD34+ популяции (CFSE+CD34+) от всех клеток лейкоцитарной фракции кроветворного органа реципиента. Результаты суммированы в таблице 1. Таблица 1. Влияние внутривенного введения гиалуроновой кислоты на локализацию в кроветворных органах прижизненно меченых (CFSE+) клеток костного мозга и популяции СD34+ (CFSE+CD34+) через 21 час после трансплантации.
*- достоверные отличия по сравнению с контролем, р<0,05 Введение реципиентам ГК из человеческой пуповины (ГКп) достоверно повышало процент трансплантированных ККМ, мигрировавших в селезенку, однако при этом содержание ранних кроветворных предшественников CD34+ среди этих клеток не отличалось от такового в контроле. ГК из петушиного гребня (ГКг) достоверно увеличивала число трансплантированных CD34+ клеток как в костном мозге, так и в селезенке. В костном мозге оба препарата ГК повышали процент трансплантированных CD34+ клеток более чем в два раза по сравнению с контролем. Усиление хоминга гемопоэтических предшественников в костный мозг под воздействием ГК оказывало, очевидно, влияние на интенсивность кроветворения в костном мозге: на 7 сутки после трансплантации ККМ у животных опытных групп число КОЕ-ГМ было достоверно выше, чем у контрольных животных. Количество КОЕ-Э не изменялось по сравнению с контрольными значениями (рис. 1). Число КОЕс8 у животных, получавших ГКг, было достоверно выше, чем у животных контрольной группы, в то время как ГКп не оказывала эффекта на колониеобразование в селезенке (рис. 2). По-видимому, эффективность хоминга ГСК в кроветворные органы в течение первых суток после трансплантации определяет интенсивность дальнейшей репопуляции кроветворных органов.   а. б. Р * ис. 1. Влияние внутривенного введения ГКг (а) и ГКп (б) реципиентам на колониеобразующую способность костномозговых гемопоэтических предшественников на 7 сутки после трансплантации ККМ. Контроль n=8, ГКг n=8, ГКп n=8. * – достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05.   а. б. Рис. 2. Колониеобразование в селезенке мышей, облученных и восстановленных ККМ, при введении ГКг (а) и ГКп (б) реципиентам. Контроль n=10, ГКг n=10, ГКп n=10. * – достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05. Интересно, что существенная стимуляция колониеобразования в костном мозге и селезенке, индуцированная ГКг, не влияла на динамику восстановления числа лейкоцитов и тромбоцитов в крови реципиентов в посттрансплантационном периоде (рис. 3). ГКп также не оказывала воздействия на скорость восстановления числа лейкоцитов в периферической крови реципиентов, однако существенно влияла на динамику тромбоцитопоэза: восстановление количества тромбоцитов до исходного уровня у животных опытной группы происходило на 17 сутки и в дальнейшем оставалось повышенным по сравнению с показателями животных контрольной группы. У животных контрольной группы количество тромбоцитов восстанавливалось до исходного уровня лишь на 23 сутки (рис. 4).   а. б. Рис. 3. Динамика восстановления количества лейкоцитов (а) и тромбоцитов (б) в периферической крови облученных и восстановленных ККМ реципиентов, при введении ГКг.   а. б. Рис. 4. Динамика восстановления количества лейкоцитов (а) и тромбоцитов (б) в периферической крови облученных и восстановленных ККМ реципиентов, при введении ГКп. *– достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05 Для того, чтобы выяснить, является ли данный эффект следствием влияния ГК на хоминг ГСК, или он обусловлен иными причинами, был проведен эксперимент, в котором животные получали сублетальную дозу облучения, при этом трансплантацию ККМ им не производили. В таких условиях восстановление кроветворения происходит за счет эндогенных ГСК, некоторый процент которых сохраняется в костном мозге после облучения в сублетальной дозе, т.е. отсутствует этап миграции ГСК в кроветворные органы. Режим введения ГК животным опытной группы оставался прежним: вводили 100мкг/мышь (доза единичного введения) в день облучения за час до и через час после облучения, а также один раз на следующий день после облучения. В этом эксперименте разница в динамике восстановления числа тромбоцитов у животных контрольной и опытной групп была сходна с таковой в условиях трансплантации ГСК, хотя отличия в этом случае не были статистически достоверны (рис. 5). Известна способность ГК стимулировать мегакариоцитопоэз in vitro [Han et al., 1996]. В то же время, имеются сведения о взаимосвязи эффективности хоминга ГСК и динамики восстановления количества тромбоцитов после трансплантации.  Показано, что у старых C57BL/6 мышей-реципиентов снижена как способность ГСК к хомингу, так и скорость восстановления числа тромбоцитов, по сравнению с клетками периферической крови других типов [Liang et al., 2005]. По-видимому, ускорение восстановления количества тромбоцитов при введении животным ГКп обусловлено как усилением хоминга трансплантированных предшественников в костный мозг, так и непосредственной стимуляцией тромбоцитопоэза за счет повышенного содержания ГК в костном мозге реципиентов Рис. 5. Динамика восстановления количества тромбоцитов в периферической крови мышей, облученных в сублетальной дозе, при введении ГКг. Выживаемость реципиентов оценивалась в условиях трансплантации летально облученным реципиентам количества клеток, обеспечивающего примерно 50% выживаемость в контрольной группе (0,5х105 клеток/мышь). При введении ГКп не наблюдалось достоверных отличий в выживаемости между контрольной (66%) и опытной группами (48%), в то время как ГКг достоверно повышала этот показатель. Процент выживших животных в группе мышей, получавших ГКг, составлял 82%, в контрольной группе он составлял 29% (рис. 6).   а. б. Рис. 6. Выживаемость облученных и восстановленных ККМ реципиентов при введении ГКг (а), ГКп (б). Контроль n=30, ГКг n=30, ГКп n=30. Основными причинами гибели животных в период с 7 по 20 сутки являются инфекционные осложнения и недостаточность системы гемостаза, обусловливающая развитие геморрагического синдрома. Известно, что трансфузия тромбоцтарной массы облученным животным в этот период обладает высокой терапевтической эффективностью, даже в отсутствие трансплантации ГСК [Бутомо, 1970]. Положительное влияние ГКп на выживаемость реципиентов может быть связано с тем, что ГК модулирует процессы свертывания крови: показана ее способность ингибировать антитромбин, усиливая свертываемость [Chang X, 2005]. Возможно, это свойство ГК оказывается существенным в условиях недостаточности системы гемостаза. Разница в эффектах, которые оказывает на процессы кроветворения и выживаемость реципиентов ГК из разных источников, вероятно, связана с различиями в молекулярной массе полимеров гиалуроновой кислоты – масса ГК петушиного гребня составляет в среднем 80-750 кДа, а ГК человеческой пуповины 1-4 МДа. Влияние вальпроевой кислоты на функциональную активность ГСК при трансплантации ККМ летально облученным реципиентам. Вальпроевая кислота является одновременно ингибитором GSK3beta и гистондеацетилаз, показана ее способность стимулировать пролиферацию ГСК без потери самоподдержания [De Felice et al., 2005]. Мы предположили, что стимуляция самоподдержания ГСК с помощью вальпроевой кислоты (VPA) позолит повысить репопулирующий потенциал ГСК, что положительно повлияет на процесс восстановления кроветворения. Реципиентам опытной группы вводили ККМ, инкубированные с VPA в концентрации 150 мкг/мл в течение 24 часов. Время инкубации было выбрано таким образом, чтобы стимулировать самоподдержание ГСК, но не увеличение количества ГСК в трансплантате. Реципиентам контрольной группы вводили равное количество ККМ, инкубированных в тех же условиях в отсутствии VPA. Параметры восстановления кроветворения оценивали по числу колониеобразующих единиц различных ростков кроветворения в костном мозге реципиентов (КОЕ-ГМ, КОЕ-Э, КОЕ-ГЭММ) на 7 сутки после трансплантации ККМ и числу колониеобразующих единиц селезенки КОЕс8. Также осуществляли мониторинг количества лейкоцитов, эритроцитов и тромбоцитов в периферической крови в течение месяца после трансплантации ККМ, оценивали выживаемость реципиентов. Чтобы убедиться, что в наших экспериментальных условиях VPA индуцирует пролиферацию ГСК, была проведена оценка числа ГСК, находящихся в S-фазе клеточного цикла. Митотическую активность КОЕс-8 оценивали по включению цитозин-арабинозида – аналога цитидина (araC), обладающего селективным цитотоксическим действием в отношении пролиферирующих клеток. Разница между числом КОЕс-8, полученных после трансплантации летально облученным реципиентам ККМ, инкубированных без araC и в присутствии araC (1mM), составляет процент КОЕс-8, находящихся в S-фазе клеточного цикла. В соответствии с литературными данными, отмечалось значительное усиление пролиферативной активности ГСК под действием VPA (таблица 2). Таблица 2. Процентное содержание КОЕс-8 в S фазе клеточного цикла после преинкубации ККМ с вальпроевой кислотой (VPA).
Число КОЕс8 у животных, которым трансплантировали ККМ, обработанные VPA, было достоверно выше, чем у животных контрольной группы (рис. 7). В костном мозге реципиентов, которым трансплантировали ККМ, обработанные VPA на 7 сутки отмечалось повышение числа как КОЕ-ГМ, так и КОЕ-Э (рис. 8).   | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Фонд оценочных средств по учебной дисциплине эпидемиология Способен применять знания общих закономерностей происхождения и развития жизни, регуляции и саморегуляции в норме и патологии, с... |  | Темы рефератов по физколлоидной химии Осмос, осмотическое давление в осуществлении функций живого организме в норме и при патологии |
| Определение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови... Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования | | Государственное образовательное учреждение высшего профессионального... Целью курса является изучение особенностей сексологического развития и информированности человека в норме и при патологии и его значение... |
| Рабочая учебная программа по дисциплине Изучить морфологические, цито-, биохимические и функциональные особенности клеток крови, особенности картины периферической крови... | | Патоморфологическая характеристика тимуса у детей по материалам аутопсий актуальность В последние годы появился ряд отдельных научных публикаций, характеризующих экспрессию некоторых иммуногистохимических маркеров в... |
| Учебно-методический комплекс по дисциплине Сравнительная политология ... | | Исследование влияния ацетилсалициловой кислоты на функциональную... Название учреждения образования: Муниципальное бюджетное общеобразовательное учреждение «Средняя общеобразовательная школа №108» |
| Роль и значение вестибулярной системы в физиологической функции зрительной... Рф (с изменениями от 16 марта, 27 ноября 2000 г., 17 февраля 2004 г.), утвержденного приказом Минобразования РФ от 27 марта 1998... | | Курсовая работа по технологии лекарств тема: «Производство мазей... «Производство мазей Влияние фармацевтических факторов на биофармацевтические характеристики мазей» |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Елкина Наталья Николаевна, выпускница нашей школы 1987 года. Она же и была разработчиком программы непрерывного курса изучения информатики.... | | Проблемная комиссия 28. 01 «Гормональная регуляция процессов жизнедеятельности... В 2012 году Научным советом по эндокринологии и входящими в его состав тремя проблемными комиссиями проводились научные исследования... |
| «Деление клетки. Митоз» Цель: в результате овладения содержанием модуля вы должны получить знания о непрямом делении клетки – митозе, о подготовке клетки... | | Диссертация на тему: «Влияние кросс-культурных факторов на содержание... «Влияние кросс-культурных факторов на содержание стандартов и практик учр в гостинице Novotel MoscowCentre» |
| Антипролиферативное действие карнозина и его производных на опухолевые... Федеральное государственное бюджетное учреждение «научный центр неврологии» российской академии медицинских наук | | Диплом Влияние различных факторов окружающей среды на частотную восприимчивость... Влияние различных факторов окружающей среды на частотную восприимчивость человеческих органов слуха |
