Определение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при патологии методом вольтамперометрии

На правах рукописи Плотников Евгений Владимирович ОПРЕДЕЛЕНИЕ СУММАРНОЙ АКТИВНОСТИ АНТИОКСИДАНТОВ В СЫВОРОТКЕ КРОВИ ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ И ПРИ ПАТОЛОГИИ МЕТОДОМ ВОЛЬТАМПЕРОМЕТРИИ 02.00.02 –– аналитическая химия Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата химических наук Томск –– 2012 Работа выполнена на кафедре физической и аналитической химии Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Национальный исследовательский Томский политехнический университет» НАУЧНЫЙ РУКОВОДИТЕЛЬ: доктор химических наук, доцент Короткова Елена Ивановна ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ: Будников Герман Константинович доктор химических наук, профессор, член-корр. РАЕН, Казанский государственный университет, профессор кафедры аналитической химии Мамонтова Инесса Петровна, кандидат химических наук, доцент, Сибирский государственный медицинский университет (г. Томск), доцент кафедры биохимии и молекулярной биологии ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ: ФГБОУ ВПО Кубанский государственный университет, (г. Краснодар) Защита диссертации состоится «26» сентября 2012 г. в 16.30 на заседании диссертационного совета Д  212.269.04 при Национальном исследовательском Томском политехническом университете по адресу: 634050, г. Томск, пр. Ленина, 30. С диссертацией можно ознакомиться в научно-технической библиотеке Национального исследовательского Томского политехнического университета по адресу:г.Томск, ул.Белинского, 53 Автореферат разослан: « » августа 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, канд. хим. наук, доцент Гиндуллина Т.М. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Исследование состава и свойств биообъектов является приоритетной задачей аналитической химии. Одним из важных показателей гомеостаза живого организма является антиоксидантная активность биообъектов, препятствующая развитию свободно-радикальных процессов в организме. В свою очередь, избыточное содержание активных форм кислорода вызывает радикально-цепные процессы окисления в клетках организма, вызывая значительные нарушения в их нормальном метаболизме. Дисфункции в регуляции свободно-радикальных процессов являются важным звеном развития многих патологий. В частности, при психических заболеваниях активируются патологические механизмы свободно-радикального окисления и формирование синдрома эндогенной интоксикации. Поэтому очень важной становится проблема контроля состояния антиоксидантной системы организма человека при патологиях различного типа, с целью дальнейшей терапевтической коррекции. Трудности в создании новых эффективных методов диагностики антиоксидантного статуса организма связаны с недостаточным пониманием механизмов кислородного метаболизма в организме человека.В настоящее время методы определения антиоксидантной активности биологических объектов основаны на различных принципах и модельных реакциях, часто используются искусственные радикалы и антиоксиданты не существующие в живых организмах, нет единой размерности показателя антиоксидантной активности биообъектов, результаты измерений часто несопоставимы друг с другом, что затрудняет их интерпретацию. Поэтому поиск новых подходов к определению активности антиоксидантов в биологических объектах является весьма актуальной задачей. Цель работы: Разработка вольтамперометрического способа определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека на основе модельной системы электровосстановления кислорода для изучения антиоксидантного статуса организма и препаратов для его коррекции. Для достижения поставленной цели предстояло решить следующие задачи: Исследовать влияние антиоксидантов сыворотки крови человека на процесс электровосстановления кислорода. Оптимизировать способ пробоподготовки сыворотки крови с учетом особенностей вольтамперометрического метода в анализе биообъектов. Провести оценку суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека вольтамперометрическим методом в норме и при психических патологиях. Провести определение гидроксильных радикалов в сыворотке крови человека в норме и при психических патологиях методом флуориметрии. Исследовать влияние солей лития на процесс электровосстановления кислорода, для выявления соединений, имеющих большой потенциал практического применения в психиатрии. Разработать вольтамперометрическую методику определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека. Провести сравнительные исследования суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови с другими аналитическими методами определения активности антиоксидантов. Научная новизна. Впервые исследованы закономерности суммарного влияния антиоксидантов сыворотки крови человека на процесс электровосстановления кислорода. Выявлено, что взаимодействие антиоксидантов сыворотки крови с продуктами восстановления кислорода проходит преимущественно по ЕС механизму. Впервые предложен вольтамперометрический подход для оценки суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в пересчете на глутатион. Оптимизированы этапы пробоподготовки сыворотки крови человека Выявлена низкая суммарная активность антиоксидантов в сыворотке крови при патологии и ее положительная динамика в ходе медикаментозной терапии. Разработан новый подход к оценке количества гидроксильных радикалов в сыворотке крови методом флуориметрии, используя терефталиевую кислоту в качестве «ловушки» радикалов. Установлена обратная зависимость между концентрацией гидроксильных радикалов и суммарной активностью антиоксидантов в сыворотке крови. Впервые определена антиоксидантная активность психотропных соединений лития методом вольтамперометрии по отношению к процессу электровосстановления кислорода. Показана взаимосвязь результатов определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека между вольтамперометрическим, спектрофотометрическим и иммуноферментным методами анализа. Практическая значимость. Разработана методика определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека методом вольтамперометрии на основе процесса электровосстановления кислорода в пересчете на глутатион для оценки и мониторинга антиоксидантного статуса организма в норме и при патологии. На основе полученных экспериментальных данных предложено использовать показатель суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови как критерий эффективности лечения психических заболеваний. Выявлены наиболее активные соединения на основе солей лития, а так же композиции на их основе для корректировки антиоксидантного статуса организма. Установлено, что наибольшую антиоксидантную активность проявляет аскорбат лития. При оценке совместимости компонентов в смесях антиоксидантов предложена наиболее эффективная композиция из аскорбата лития и дигидрокверцетина в соотношении 5:1. Даны рекомендации для их дальнейшего использования в психиатрии в качестве психостабилизаторов с антиоксидантными свойствами. На основе аскорбата лития разработан и зарегистрирован лечебно-профилактический комплекс «Нормотим» для коррекции аддиктивных состояний. На основе разработанной методики создан модифицированный прибор «Антиоксидант» со встроенным программным обеспечением для анализа антиоксидантной активности. На защиту выносятся: Результаты определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека по отношению к процессу электровосстановления кислорода в норме и при психических патологиях. Результаты определения гидроксильных радикалов в сыворотке крови человека в норме и при психических патологиях методом флуориметрии. Результаты определения антиоксидантной активности соединений лития и композиций на их основе, имеющие фармацевтическое значение, по отношению к процессу электровосстановления кислорода. Методика определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека по отношению к процессу электровосстановления кислорода. Результаты сравнительных определений суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека с использованием метода вольтамперометрии и независимых аналитических методов анализа (спектроскопический и имунноферментный). Апробация работы. Основные результаты работы представлены в докладах на Второй Всероссийской конференции с международным участием «Современные проблемы биологической психиатрии и наркологии» (Томск, 2008); Научно-практической конференции с международным участием «Охрана психического здоровья в демографической политике страны» (Томск, 2008); XI всероссийской конференции студентов и аспирантов «Химия и химическая технология в XXI веке» (Томск, 2010); симпозиуме «Теория и практика электроаналитической химии» (Томск, 2010); Научно-практической конференции, посвященной 70-летию со дня рождения профессора Ю.А. Карбаинова «Электрохимические методы анализа. Теория и практика» (Томск, 2010); 7th Aegean Analytical Chemistry Days (Lesvos, Greece, 2010); Второй международной научно-практической конференции «Высокие технологии, фундаментальные и прикладные исследования в физиологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2011); VIII всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА 2012» (Уфа-Абзаково, 2012). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 5 статей в журналах ВАК и 13 тезисов в сборниках конференций, получено 5 патентов РФ на изобретение. Диссертация выполнена при поддержке гранта РФФИ № 10-08-00306-а «Исследование антиоксидантной активности сыворотки крови человека в норме и патологии методом вольтамперометрии» и программы ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы ГК № 14.740.11.1440 «Разработка психотропных соединений, обладающих антиоксидантной и иммуностимулирующей активностью». Объем и структура диссертации.  Диссертационная работа состоит из введения, пяти глав, выводов, списка литературы из 142 наименований и приложения. Содержит 140 страниц, 29 таблиц, 27 рисунков. Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы. В первой главе приведен литературный обзор. Рассмотрены общие вопросы процесса восстановления кислорода в биологических мембранах. Дано обоснование разработки новых психотропных соединений с антиоксидантной активностью для лечения аддиктивных состояний. Во второй главе описаны условия эксперимента, представлены данные об используемом оборудовании и объектах исследования. В третьей главе рассмотрены особенности процесса электровосстановления кислорода в присутствии сыворотки крови человека. Представлены результаты определения концентрации гидроксильных радикалов в сыворотке крови человека в норме и при психических заболеваниях методом флуориметрии. В четвертой главе представлены результаты определения антиоксидантных свойств по отношению к процессу электровосстановления кислорода некоторых соединений лития. В пятой главе описаны метрологические аспекты методики определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека. Показаны результаты сравнительных испытаний вольтамперометрического, спектрофотометрического и иммуноферментного методов определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯЧАСТЬ Исследования проводили на вольтамперометрическом анализаторе ТА-2 (ООО «НПП Томьаналит», г. Томск) и вольтамперометрическом анализаторе антиоксидантной активности «Анализатор АОА» (ООО «НПП Полиант» г. Томск, Россия) в комплекте с ПК. В работе использовали метод катодной вольтамперометриии, в частности процесс электровосстановления кислорода (ЭВ О2), который повторяет четырехэлектронный механизм восстановления молекулы О2 до воды в клетках живого организма, и таким образом является оптимальной модельной системой для анализа биобъектов. Для оценки влияния исследуемых объектов рассматривали зависимости предельного тока ЭВ О2 от концентрации их в объеме раствора и от времени протекания процесса ЭВ О2 в их присутствии. Вольтамперограммы исследуемых растворов регистрировали на стационарных электродах с линейной разверткой потенциала. Для измерений использовали индикаторные электроды ртутно-пленочный (РПЭ) и стеклоуглеродный (СУЭ). В качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода использовали хлорид-серебряные электроды (ХСЭ). Оптические измерения проводили на спектрофотометре СФ-46 в кювете с длиной 1 см. Флуориметрические измерения проводили на флуориметре Spectrofluorpphotometer RF-5301pc. В качестве объектов исследований использовали индивидуальные вещества: аскорбиновая кислота, соли лития (аскорбат, сукцинат, аспартат, никотинат, бензоат), дигидрокверцетин разной степени очистки 90%, 92% и 94% («Флавит», Пущино), а так же образцы сыворотки крови человека в норме и при психических патологиях. Для оценки активности антиоксидантов (АО) исследованных объектов использовали кинетический критерий, отражающий количество активных кислородных радикалов, прореагировавших с антиоксидантом (или суммарным содержанием антиоксидантов) за минуту времени: где I0 ток ЭВ О2 в отсутствии АО в растворе, мкА; I  ток ЭВ О2 в присутствии АО в растворе, мкА; С0  исходная концентрация О2 в растворе, мкмоль/л; t  время протекания реакции взаимодействия АО с активными кислородными радикалами, мин. ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Определение оптимальных условий пробоподготовки сыворотки крови человека для оценки суммарной активности антиоксидантов в сыворотке Известно, что при изменении скорости и времени центрифугирования меняется состав сыворотки крови. При уменьшении скорости и времени центрифугирования раствор становился неоднородным, что может оказывать влияние на воспроизводимость результатов. При увеличении скорости и времени центрифугирования крови можно потерять ценные компоненты антиоксидантной природы, оказывающие влияние на общий антиоксидантный статус организма. Поэтому первоначально использовали методы планирования эксперимента для оптимизации этапов пробоподготовки сыворотки крови человека путем выбора режимов центрифугирования. Для получения математической модели процесса использовался полный факторный эксперимент. Варьируемыми факторами служили скорость и время центрифугирования крови. В качестве функции отклика использовали критерий суммарной активности антиоксидантов сыворотки крови. Получено, что модель адекватно описывает процесс, эффект взаимодействия факторов не значим, все коэффициенты линейной модели значимы и имеют знак плюс, что означает увеличение критериев оптимизации с увеличением значений обоих факторов. Следует отметить, что наибольшее влияние оказывает фактор - время центрифугирования сыворотки крови. Для нахождения точки оптимума реализован метод крутого восхождения и получена двухфакторная поверхность отклика. На основании полученных результатов определены оптимальные условия пробоподготовки для определения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови: ω=2000 об/мин, t=10 мин. Полученные оптимальные условия эксперимента согласуются с общепринятой методикой приготовления сыворотки крови. Особенности процесса электровосстановления кислорода в присутствии сыворотки крови человека Известно, что ЭВ О2 является квазиобратимым процессом и протекает в условиях смешанной кинетики, когда скорость диффузии кислорода в растворе сопоставима со скоростью протекания электрохимической стадии его восстановления. Сыворотка крови является сложным многокомпонентным объектом, с высоким содержанием антиоксидантов различной природы и в разных концентрациях. Поэтому проведено исследование суммарного влияния антиоксидантов сыворотки крови человека на процесс ЭВ О2. При добавлении исследуемых образцов в фоновый раствор при скорости развертки потенциала 20 мВ/с на вольтамперограммах наблюдалось уменьшение величины тока ЭВ О2 и смещение потенциала (предельного тока) волны в положительную область (рис. 1). Рис. 1 Вольтамперограмма тока ЭВ О2 на СУЭ в фосфатном буфере с рН=6.86 (0.025М KH2PO4, 0.025М Na2HPO4), W = 20 мВ/с в отсутствие (1) и в присутствии 0.1 мл сыворотки крови человека без видимых патологий при t: 5 мин (2) и 10 мин (3). (4) – остаточный ток фонового электролита в отсутствии О2 и вещества в растворе. Такие изменения связаны с влиянием антиоксидантов сыворотки крови на процесс ЭВ О2. Общая схема электродного процесса с последующими химическими реакциями взаимодействия антиоксидантов сыворотки крови с активными кислородными радикалами может быть представлена следующим образом: Показано что для процесса ЭВ О2 в присутствии сыворотки крови соблюдаются следующие условия: -  зависимость потенциала полуволны тока ЭВ О2 в присутствии сыворотки крови от lg (w1/2) носит линейный характер (рис. 2), в то время как в отсутствии АО для данного процесса зависимость не линейна. -  при изменении скорости развертки потенциала в 10 раз, потенциал пика смещается на 2.3RT/2nF и составляет 30 мВ при n=1 (количество электронов, участвующих в лимитирующей стадии электродного процесса). Рис. 2 Зависимость потенциала полуволны ЭВ О2 от скорости развертки потенциала на СУЭ в фосфатном буфере с рН=6.86 (0.025М KH2PO4, 0.025М Na2HPO4) в присутствии сыворотки крови человека (0.1 мл). Таким образом, сопоставление полученных и литературных данных позволяет говорить о том, что процесс ЭВ О2 в присутствии антиоксидантов сыворотки крови осложняется последующими химическими реакциями. Определение суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при психических заболеваниях В качестве объекта исследования использовали сыворотку крови пациентов с диагнозом синдрома алкогольной зависимости 2 степени и пациентов с диагнозом параноидная шизофрения, проходивших стационарное лечение в Томской областной психиатрической больнице. Для оценки суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме и при психических патологиях сняты вольтамперограммы тока ЭВ О2 в отсутствии и в присутствии исследуемых объектов. На основании полученных данных строились зависимости относительного уменьшения тока ЭВ О2 от времени протекания процесса в присутствии исследуемых образцов сыворотки (рис. 3) и рассчитывались значения суммарной активности антиоксидантов в сыворотке крови по кинетическому критерию. В таблице 1 представлены результаты определения суммарной активности антиоксидантов сыворотки крови человека в норме и у пациентов с диагнозом алкоголизм 2 стадии (выборка по 10-ти пациентам, n=50). Как видно из таблицы 1, показатель активности антиоксидантов в сыворотке крови человека в норме составляет около 1.00 мкмоль/л*мин. Рис. 3. Зависимость относительного изменения тока ЭВ О2 от времени протекания процесса в фоновом электролите в присутствии 0.1 мл сыворотки крови: здорового донора (4) и пациента с диагнозом алкоголизм до (1) и после лечения (3), пациента с диагнозом шизофрения (2).

Похожие:

	Рабочая учебная программа по дисциплине Изучить морфологические, цито-, биохимические и функциональные особенности клеток крови, особенности картины периферической крови...		Государственное образовательное учреждение высшего профессионального... Целью курса является изучение особенностей сексологического развития и информированности человека в норме и при патологии и его значение...
	Темы рефератов по физколлоидной химии Осмос, осмотическое давление в осуществлении функций живого организме в норме и при патологии		Феофанова наталья Александровна Влияние факторов экзогенного и эндогенного... Опубликовал более 140 научных работ (в том числе 4 монографии, 2 учебных пособия)
	Патоморфологическая характеристика тимуса у детей по материалам аутопсий актуальность В последние годы появился ряд отдельных научных публикаций, характеризующих экспрессию некоторых иммуногистохимических маркеров в...		Влияние статинов на активность матриксных металлопротеаз, хитотриозидазы... Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Научно-исследовательском институте физиологии Сибирского отделения...
	Основные сведения об обмене железа Железодефицитная анемия – анемия, обусловленная дефицитом железа в сыворотке крови и костном мозге, что сопровождается нарушением...		Методические указания для студентов по дисциплине гематология Тема занятия: Основы кроветворения, гематологические показатели в норме, патология объема крови
	Конспект урока "Группы крови. Переливание крови. Донорство" (Тема... ...		Роль и значение вестибулярной системы в физиологической функции зрительной... Рф (с изменениями от 16 марта, 27 ноября 2000 г., 17 февраля 2004 г.), утвержденного приказом Минобразования РФ от 27 марта 1998...
	«Установление наличия крови человека и простатоспецифического антигена... Игра викторина "Самый умный" проводилась среди учащихся 8 классов в рамках декады естественных наук		Определение оптической глубины проникновения низкоинтенсивного лазерного... Нии лазерного излучения биологическими тканями. Одновременно с поглощением излучения происходит ряд других физических процессов:...
	Фонд оценочных средств по учебной дисциплине эпидемиология Способен применять знания общих закономерностей происхождения и развития жизни, регуляции и саморегуляции в норме и патологии, с...		Патологическое распространение образования тромбина Двс-синдром – это результат частичного или полного контроля за местным или распространенным свертыванием крови. В норме есть 4 условия,...
	Исследование глазодвигательной активности при прохождении матричного теста интеллекта Равена Цель работы: исследование окуломоторной активности человека при прохождении матричного теста интеллекта Равена		Методические указания по выполнению лабораторной работы определение... Методические указания по выполнению лабораторной работы «Определение состава природного газа методом газовой хроматографии»