Феофанова наталья Александровна Влияние факторов экзогенного и эндогенного происхождения на функциональную активность гемопоэтической стволовой клетки в норме и при аутоиммунной патологии

*– достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05
Повышение интенсивности кроветворных процессов оказывало воздействие и на динамику восстановления числа лейкоцитов в периферической крови реципиентов. Восстановление этого параметра происходило у животных контрольной и опытной групп практически одновременно – на 24 и 22 сутки соответственно. Однако после этого момента, когда у животных контрольной группы число лейкоцитов стабилизировалось на уровне 10 млн/мл, у животных опытной группы до 29 суток продолжалось прогрессивное увеличение количества лейкоцитов до 15 млн/мл, затем оно стабилизировалось на этом уровне до конца периода наблюдения (рис. 9). Неожиданными оказались результаты, полученные в экспериментах по оценке выживаемости реципиентов. У животных, которым трансплантировали ККМ, обработанные VPA, выживаемость оказалась достоверно ниже (52%), чем у реципиентов контрольной группы (80%) (рис. 10). По-видимому, усиленная пролиферация ГСК в условиях трансплантации ККМ препятствовала своевременной дифференцировке ранних кроветворных предшественников в зрелые клеточные элементы, что послужило причиной гибели реципиентов. Запуск процесса дифференцировки не отменялся, но был отложен во времени, как следует из прогрессивного повышения числа лейкоцитов в периферической крови реципиентов опытной группы после 24 суток.

Таким образом, вальпроевая кислота, стимулируя пролиферацию ГСК с сохранением самоподдержания, приводит к усилению кроветвориения в костном мозге и селезенке, однако не вызывает ускорения восстановления лейкоцитов в периферической крови и негативно сказывается на выживаемости реципиентов.

* – достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05
Коррекция апоптоза и дифференцировки ГСК мышей MRL-lpr/lpr через воздействия на внутриклеточные сигнальные пути

В последние годы накапливаются данные об изменениях функциональной активности ГСК при аутоиммунных заболеваниях (АИЗ); делаются предположения о патогенетической роли этих изменений [Wang et al., 2007, Andryushkova et al., 2007], что дает основания рассматривать ГСК и раниие гемопоэтические предшественники как возможную мишень для терапевтических воздействий.

В качестве модели АИЗ были использованы мышы линии MRL-lpr/lpr, несущие мутацию в гене lpr, кодирующем рецептор Fas. Следствием этого является нарушение Fas-зависимого пути апоптоза иммунокомпетентных клеток, приводяшее спонтанному развитию системного аутоиммунного заболевания, характерезующегося тяжелой лимфоаденопатией, продукцией разнообразных аутоантител, иммунных комплексов, а также гломерулонефритом [Nagata et al., 1995, Watanabe-Fukunaga et al., 1992]. Fas/FasL взаимодействия играют существенную роль и в регуляции кроветворения. ГСК мышей MRL-lpr/lpr отличаются повышенной радиорезистентностью, изменение их пролиферативно-дифференцировочных потенций проявляется еще до клинических проявлений заболевания [Ikehara, 2001]. Увеличение количества эритроидных колоний в костном мозге мышей MRL-lpr/lpr происходит уже на ранних стадиях развития АИЗ, до появления протеинурии [Топоркова и др., 2002].

Поскольку усиление пролиферативной активности ГСК у мышей MRL-lpr/lpr может быть связано с дефектом апоптоза, мы провели исследование таких характеристик как прогрессия по клеточному циклу и процент клеток в состоянии апоптоза в популяции CD34⁺ кроветворных предшественников в процессе развития АИЗ у мышей MRL-lpr/lpr. Были сформированы три группы мышей, характеризующие разные стадии формирования АИЗ: 1) молодые мыши (4-5 недельные) без протеинурии (n=14); 2) 24-недельные мыши без протеинурии, находящиеся на стадии предболезни (n=10); 3) 24-недельные мыши с выраженными признаками АИЗ (протеинурия более 3 мг/мл) – группа «АИЗ» (n=20). Контрольными служили показатели, полученные при исследовании характеристик CD34⁺ клеток у мышей (CBAxC57Bl/6)F1 (n=10).

Было показано, что развитие заболевания сопровождается снижением относительного количества CD34⁺ клеток в лейкоцитарной фракции клеток костного мозга мышей MRL-lpr/lpr (рис. 11): в группе АИЗ процент CD34⁺ клеток оказался достоверно ниже, чем во всех других группах. Уровень апоптоза CD34⁺ клеток, достоверно повышенный у молодых здоровых мышей MRL-lpr/lpr по сравнению с контролем, снижается по мере развития заболевания, достигая достоверных различий в группе АИЗ по сравнению с уровнем апоптоза CD34⁺ клеток в других группах (рис. 12).



контроль молодые предболезнь АИЗ контроль молодые предболезнь АИЗ

* – достоверные отличия по сравнению с контролем, р <0,05
У мышей MRL-lpr/lpr всех групп было обнаружено повышение пролиферативной активности (S/G₂M фазы клеточного цикла) популяции CD34⁺ клеток по сравнению с контролем. Относительное количество CD34⁺ клеток, пребывающих в фазах G₀/G₁ клеточного цикла, было достоверно снижено по сравнению с контролем в группах молодых мышей и АИЗ (рис. 13).

Мы предположили, что отклонения в пролиферации и преимущественной дифференцировке ГСК мышей MRL-lpr/lpr в эритроидном направлении могут быть скорректированы с помощью воздействий, регулирующих апоптоз. Для коррекции функциональной активности кроветворных предшественников Fas-дефектных мышей MRL-lpr/lpr были выбраны воздействия, направленные на повышение апоптоза CD34+ клеток, замедление их прогрессии по клеточному циклу и подавление эритроидной дифференцировки: ингибитор PI3K вортманнин, ингибитор PKC H7 и ингибитор PDE4 ролипрам.



Рис. 13. Процент CD34+ клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла, среди CD34+ клеток костного мозга. *p<0,05 по сравнению с контролем.
контроль молодые предболезнь АИЗ
Влияние препаратов на прогрессию клеточного цикла и апоптоз определяли в популяции CD34⁺ клеток 24-недельных мышей MRL-lpr/lpr с протеинурией после инкубации ККМ с каждым из препаратов в течение 24 часов в следующих концентрациях: 20 мкМ Н7, 500 нМ вортманнин, 10 мкМ ролипрам. Затем методом проточной цитофлюориметрии определяли процент клеток, находящихся в различных фазах клеточного цикла и процент клеток в состоянии апоптоза. Результаты представлены в таблице 3.
Таблица 3. Модуляция параметров клеточного цикла и апоптоза CD34⁺ клеток костного мозга старых больных мышей MRL-lpr/lpr в условиях ингибирования PI3K (вортманнин), PKС (Н-7) и PDE4 (ролипрам)

показатель	контроль (n=16)	вортманнин (n=14)	H7 (n=16)	ролипрам (n=16)
CD34 (%)	3,2±0,6	2,3±0,2	2,8±0,4	2,4±0,3
апоптоз (%)	7,8±1,5	13±4,2	18±2,6*	16±3,2*
G0/G1 (%)	76±5,4	69±6,2	70±5,1	71±5
S/G2M (%)	16±4,6	17±3,9	12±3,5	13±3,7

*p<0,05 по сравнению с контролем
Все анализируемые препараты усиливали апоптоз костномозговых CD34⁺ клеток: вортманнин – в виде тенденции, H7 и ролипрам – достоверно. При этом усиление апоптоза в присутствии H7 и ролипрама ассоциировалось с тенденцией к снижению количества клеток, находящихся в S/G2M фазах клеточного цикла. При анализе корреляционных связей были выявлены различия модулирующей активности анализируемых веществ. Так, в контрольной группе (без воздействий) и в присутствии вортманнина уровень апоптоза обратно коррелирует с долей G0/G1 клеток. В присутствии H7 уровень апоптоза обратно коррелирует не только с количеством клеток в G0/G1, но и с индексом соотношения клеток в G0/G1 и S/G2M. Т.е. усиление апоптоза данным модулятором было ассоциировано с изменением клеточного цикла. И хотя ролипрам также достоверно усиливал апоптоз, это не отражалось на соотношении клеток в G0/G1 и S/G2M). Таким образом, из трех препаратов, усиливающих апоптоз, только H7 при этом оказывал воздействие на клеточный цикл.

Помимо влияния на клеточный цикл, была протестирована активность ингибиторов в отношении регуляции дифференцировки ГСК 24-недельных мышей MRL-lpr/lpr с протеинурией, в костном мозге которых отмечается значительное повышение числа эритроидных колоний. Все препараты снижали число КОЕ-Э, при этом воздействие вортманнина и H7 приводило к достоверному снижению их количества (рис. 14).

Рис. 14. Влияние ингибиторов PI3K (вортманнин), PKС (Н-7) и PDE4 (ролипрам) на формирование гемо-поэтических колоний ККМ 24-недельных мышей MRL-lpr/lpr с протеинурией. 1 – контроль (n=12), 2 – вортманнин (n=12), 3 – Н7 (n=12), 4 – ролипрам (n=12).

* – достоверные различия по сравнению с контролем (p<0,05)

Полученные нами данные о коррекции функциональных параметров ГСК при аутоиммунной патологии (мыши MRL-lpr/lpr) позволяют предполагать возможность исследования роли стимуляторов апоптоза в терапии АИЗ, в том числе при трансплантациях клеток костного мозга.

Для того чтобы проверить, каким образом изменения функциональной активности ГСК мышей MRL-lpr/lpr влияют на поведение ГСК в условиях трансплантации, было проведено восстановление летально облученных реципиентов клетками костного мозга мышей MRL-lpr/lpr, находящихся в стадии манифестации АИЗ. Реципиентам опытных групп трансплантировали равное количество ККМ, инкубированных с каждым из препаратов в течение 3,5 часов. Реципиентам контрольной группы вводили ККМ, инкубированных в тех же условиях в отсутствии препаратов. Поскольку количество доступных для эксперимента животных не позволяло провести сингенную трансплантацию, в качестве реципиентов были выбраны мыши линии С57Bl/6. Линия С57Bl/6 присутствует в составе генетической основы линии MRL-lpr/lpr, но трансплантация ККМ в таких условиях является аллогенной и связана с риском развития «реакции трансплантат против хозяина», которая может стать причиной гибели животных в эксперименте на 7-20 сутки после трансплантации. В связи с этим мы оценивали, прежде всего, те параметры восстановления кроветворения, которые возможно определить на ранних сроках: количество колониеобразующих единиц селезенки КОЕс8 и колическтво колониеобразующих единиц различных ростков кроветворения в костном мозге реципиентов на 7 сутки после трансплантации ККМ.

Ни один из исследуемых препаратов не оказывал влияния на количество КОЕс-8 (рис. 15). Н7 угнетал колониеобразование всех ростков кроветворения в костном мозге реципиентов. Остальные препараты не оказывали влияния на процесс костномозгового кроветворения (рис. 16). Таким образом, повышение сниженного апоптоза CD34+ клеток мышей MRL-lpr/lpr с помощью вортманнина и ролипрама не влияет на эффективность репопуляции кроветворных органов при трансплантации ККМ, а сочетание подавления апоптоза и эритроидной дифференцировки с помощью Н7 проявляет в этом отношении негативный эффект.

1 – контроль (n=10), 2 – вортманнин (n=10), 3 – Н7 (n=10), 4 – ролипрам (n=10)
Поскольку к 15 суткам после трансплантации все животные в контрольной и опытных группах погибли, не удалось провести оценку динамики восстановления количества клеток периферической крови.
ВЫВОДЫ

1. Низкомолекулярная гиалуроновная кислота из петушиного гребня при внутривенном введении реципиентам в сочетании с сингенной трансплантацией ККМ повышает эффективность хоминга ГСК в костный мозг и селезенку, усиливает гемопоэз и повышает выживаемость реципиентов.

2. Высокомолекулярная гиалуроновная кислота из человеческой пуповины при внутривенном введении реципиентам в сочетании с сингенной трансплантацией ККМ повышает эффективность хоминга ГСК в костный мозг, усиливает костномозговое колониеобразование и ускоряет восстановление числа тромбоцитов в периферической крови в посттрансплантационном периоде.

3. Повышение самоподдержания ГСК, индуцированное вальпроевой кислотой in vitro, вызывает усиление пролиферации гемопоэтических предшественников в кроветворных органах после трансплантации ККМ, но не приводит к ускорению восстановления количества зрелых клеток крови и негативно сказывается на выживаемости реципиентов.

4. Развитию аутоиммунного заболевания у мышей MRL-lpr/lpr предшествует усиление пролиферации CD34⁺ клеток, процесс развития заболевания сопровождается снижением относительного количества CD34+ клеток в костном мозге и уменьшением процента CD34+ клеток, находящихся в состоянии апоптоза.

5. Н7 и ролипрам стимулируют апоптоз СD34+ клеток мышей MRL-lpr/lpr, при этом Н7 подавляет эритроидную дифференцировку ГСК мышей MRL-lpr/lpr in vitro. Вортманнин подавляет эритроидную дифференцировку, не влияя на апоптоз СD34+ клеток. В условиях трансплантации ККМ, инкубированных с препаратами, Н7 подавляет кроветворение в костном мозге реципиентов, вортманнин и ролипрам не оказывают влияния на этот процесс.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Toporkova LB, Orlovskaya IA, Feofanova NA, Nevinsky GA., 2004, Signal transduction pathways in regulation of hematopoietic stem cell functional activity in autoimmune mice. Progress in fundamental and applied sciences for human health. International Multidisciplinary Congress, Crimea, Ukraine, p. 151.
2. Орловская И.А., Топоркова Л.Б., Феофанова Н.А., Невинский Г.А., Козлов В.А., 2005, Внутриклеточные сигнальные пути как мишень для направленной дифференцировки стволовой кроветворной клетки. Тезисы докладов международной конференции «Клинические и фундаментальные проблемы клеточных биотехнологий», Новосибирск, стр. 42.
3. Феофанова Н.А., Топоркова Л.Б., Тихонова М.А., Невинский Г.А., Козлов В.А., Орловская И.А., 2006, Клеточный цикл костномозговых CD34+ клеток в процессе развития аутоиммунного заболевания у мышей MRLMpJ/lpr. Клеточные технологии в биологии и медицине, № 3, стр. 154-156.
4. Феофанова Н.А., Топоркова Л.Б., Тихонова М.А., Черных Е.Р., Невинский Г.А., Козлов В.А., Орловская И.А., 2008, Подходы к коррекции функциональных параметров гемопоэтической стволовой клетки у аутоиммунных мышей MRL lpr/lpr. Бюллетень СО РАМН, № 4 (132), стр. 85-88.
5. Феофанова Н. А., Топоркова Л. Б., Орловская И. А., 2009, PI-киназы в иммунопатологии. Иммунология, №30 (2), стр. 136-139.
6. Феофанова Н.А., Орловская И.А., Козлов В.А., 2009, Гемопоэтические стволовые клетки: характеристика, функциональные свойства, использование в клинической практике. Клеточные технологии: теоретические и прикладные аспекты. Под ред. В.А. Козлова, С.В. Сенникова, Е.Р. Черных, А.А. Останина. Новосибирск, «Наука», стр. 13-25.
7. Feofanova NA, Toporkova LB, Orlovskaya IA., 2009, Pre-treatment of mouse hematopoietic stem cells with valproic acid impairs recovery of hematopoietic system after syngeneic transplantation. World Stem Cell Summit Poster Forum, Baltimore, Maryland, USA, p. 107.

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АИЗ – аутоиммунные заболевания

ГК – гиалуроновая кислота

ГКг – гиалуроновая кислота из петушиного гребня

ГКп – гиалуроновая кислота из человеческой пуповины

ГСК – гемопоэтическая стволовая клетка

ККМ – клетки костного мозга

КОЕ-ГМ – колониеобразующая единица гранулоцитов-макрофагов

КОЕ-ГЭММ – колониеобразующая единица гранулоцитов, эритроцитов, моноцитов/макрофагов, мегакариоцитов

КОЕс-8 – восьмисуточная колониеобразующая единица селезенки

КОЕ-Э – эритроидная колониеобразующая единица

CFSE – carboxyfluorescein succinimidyl ester

GSK3beta – glycogen synthase kinase-3 beta

PDE4 – phosphodiesterase-4

PI3K – phosphoinositid-3-kinase

РКС – proteinkinase C

VPA – valproic acid