4.1 Исследование степени гидролитических изменений белков в процессе индуцированного автолиза муки семян люпина
Определение концентрации белка микробиуретовым методом
Концентрацию белка в растворе определяли микробиуретовым методом [14]. Готовили раствор биурета CuSO4NaOH, для этого смешивали 38%-ный NaOH (79 мл) и 1%-ный CuSO4·5H2O (21 мл). Исследуемый раствор белка смешивали с биуретом в соотношение 2:1 и выдерживали 15 минут для прохождения реакции (происходит необратимое связывание пептидных связей белка с ионами меди), после этого измеряли оптическую плотность полученного раствора на спектрофотометре при длине волны 310 нм. В качестве контроля использовали дистиллированную воду, смешанную с биуретовым реактивом в том же соотношении. Концентрацию белка определяли по калибровочной кривой (зависимость оптической плотности от концентрации белка), построенной по бычьему сывороточному альбумину (БСА).
Для построения калибровочной кривой готовили растворы БСА с концентрацией от 0,1 мг/мл до 0,7 мг/мл. БСА был выбран в качестве белка для построения калибровочной кривой, в связи с хорошей изученностью свойств и относительно невысокой ценой. Бычий сывороточный альбумин, БСА (bovine serum albumine, BSA) – белок плазмы крови быка, состоящий из 582 аминокислот, используемый как носитель и в качестве стандарта при различных белковых анализах, а также как стандартный антиген при определении изменения иммунного ответа под действием иммуномодуляторов или других факторов.
Исследование динамики изменения концентрации белка муки люпина в процессе индуцированного автолиза
Для того чтобы охарактеризовать гидролитические изменения белка в процессе индуцированного автолиза и сопоставить их с данными, полученными при проращивании, нами был использован микробиуретовый метод определения концентрации белка.
Определение белка проводили до начала автолиза и через 24, 48 и 72 часа автолиза. Параллельно с опытом осуществлялся контроль, аналогично опыту, но без внесения в суспензию муки люпина куриного пепсина. Полученные результаты представлены в таблице 2 и на рис. 1.
Таблица 2 - Изменение концентрации (С) белка в муке люпина в зависимости от времени автолиза
Время автолиза, ч
|
C белка по биурету, мг/мл, опыт
|
C белка по биурету, мг/мл, контроль
|
Δ*
|
0
|
26,39+0,70
|
22,79+0,4
|
3,60+0,01
|
24
|
31,84+0,50
|
29,19+0,4
|
2,65+0,05
|
48
|
37,79+0,50
|
36,00+0,5
|
1,79+0,05
|
72
|
34,79+0,50
|
33,59+0,3
|
1,20+0,01
|
*Δ - разность значений С белка (по биуретовому методу), мг/мл, между опытом и контролем
Рисунок 1 - Изменение концентрации белка в растворе в зависимости от времени автолиза
Представленная на рис. 1 зависимость позволяет констатировать более высокую скорость гидролиза белка в пробах опыта, по сравнению с контролем.
Полученные результаты коррелируют с литературными данными об изменении запасных белков при прорастании семян. В работах Wilson с коллегами [15] описан распад основных запасных белков соевых бобов во время проращивания. В пользу снижения концентрации белков говорят данные, полученные Colmenares de Ruiz и Bressani, о значительном увеличении содержания свободных аминокислот в проращенных семенах амаранта [7]. В работе Hwei-Ming Bau и Christian Villaume также говорится о распаде основных запасных веществ – крахмала, белков, триглицеридов во время прорастания семян [2].
Исследование динамики гидролитических изменений белков в процессе индуцированного автолиза методом ВЭЖХ на гель-фильтрационной колонке
Протеолизом белка называется гидролиз белка с помощью протеолитических ферментов. Протеолиз с образованием устойчивого высокомолекулярного продукта называют ограниченным протеолизом. Ограниченный протеолиз наряду с индуцированным автолизом является одним из наиболее перспективных методов регулирования функциональных свойств пищевых белков, в частности легуминов зернобобовых [7,16]. При ограниченном протеолизе запасных белков образуются высокомолекулярный компонент (модифицированный белок), а также пептиды с существенно более низкой молекулярной массой [17,18,19]. В зависимости от требований, предъявляемых к свойствам белкового компонента пищевого продукта, возникает задача получения в процессе гидролиза преимущественно либо модифицированного белка, либо пептидов. Так, для обеспечения способности стабилизировать пены и эмульсии необходимо, чтобы в гидролизате содержался модифицированный белок [20,21,22], а для улучшения растворимости белкового препарата, плохо растворимого в заданных условиях, желательно, чтобы гидролизат состоял в основном из пептидов [21,22]. Таким образом, для получения гидролизата белка с требуемыми свойствами необходимо уметь управлять процессом гидролиза. Поэтому основными направлениями в области применения индуцированного автолиза являются исследования функциональных свойств модифицированного белка и изучение механизма автолиза.
На основании кинетических данных гидролиза запасных 11 S и 7S белков зернобобовых ферментами животного и растительного происхождения обнаружены общие закономерности механизма гидролиза этих белков. В настоящее время изучено действие гидролиза трипсином, химотрипсином, пепсином, эндогенными и экзогенными протеназами на легумины семян вики, сои, гороха, кормовых бобов и др. культур [17,23, 24,25,26,27,28]. В ходе протеолиза легуминов перечисленных культур выделяют две основные стадии.
В течение первой, относительно быстрой стадии, наблюдаются качественные изменения белка: увеличение его отрицательного заряда, снижение молекулярной массы начинается за счет отщепления фрагментов С-концевого участка - (кислых) цепей. Чувствительность к протеолизу этого участка - цепей является общей характеристикой легуминов многих семян. Молекулярная масса - (основных) цепей 11 S глобулинов на этой стадии протеолиза остается неизменной [24,26,27,29], за исключением 11 S глобулина сои (глицинина), при гидролизе которого наблюдается незначительное снижение на (0,5 – 1,0 кДа) молекулярной массы - цепей в их С- концевой области [28]. Следует отметить, что при действии фермента на легумины различных культур происходит отщепление различных (по молекулярной массе и аминокислотной последовательности) фрагментов кислых цепей, о чем свидетельствуют данные электрофореза при гидролизе трипсином 11 S глобулинов сои [30] и вики [17]. Наблюдаемые изменения субъедичного состава белков при гидролизе происходят только до определенного предела, после чего молекулярная масса образовавшихся крупных фрагментов кислых субъединиц остается неизменной, тогда как их содержание изменяется. При количественной оценке степени гидролиза легуминов обнаруживается их способность к глубокому расщеплению трипсином, химотрипсином, пепсином и эндогенными протеиназами [17,31,32]. В этих работах показано, что постоянство молекулярной массы основных субъединиц и фрагментов кислых субъединиц является следствием второй стадии гидролиза, при котором происходит глубокое расщепление молекул субстрата. Скорость второй стадии гидролиза значительно ниже, чем первой. На этом этапе, продолжающемся, по-видимому, вплоть до полного исчезновения высокомолекулярного белка в гидролизате [17], молекулярная масса и электрофоретическая подвижность частично гидролизованного легумина остаются неизменными.
Изменения легуминов в течение первой стадии протеолиза трипсином, химотрипсином и пепсином, указывают на последовательный или «zipper» [33] механизм протеолиза. При последовательном протеолизе скорость каждой последующей стадии значительно меньше предыдущей. Вследствие этого последовательный протеолиз протекает упорядоченно и позволяет обнаружить промежуточные продукты определенного состава. Характерным признаком последовательного протеолиза является уменьшение молекулярной массы высокомолекулярного остатка белка при сохранении его молярной концентрации. Завершение первой стадии протеолиза соответствует образованию устойчивого высокомолекулярного продукта [30,34].
Вторая стадия протеолиза развивается по одиночному («one-by-one» [33]) механизму, при котором происходит поочередное (поодиночное ) глубокое расщепление молекул субстрата. Вероятно, на первом этапе скорость «поодиночного» расщепления легумина мала, но она возрастает по мере развития конформационных изменений белка [17]. По характеру действия молекул фермента на молекулы белка первая стадия протеолиза является ‘некооперативной’, а вторая стадия имеет ‘кооперативный’ характер [27].
В процессе гидролиза легуминов эндогенными протеиназами А и В in vitro прослеживаются другие закономерности. Уже с самого начала процесса гидролиз легумина вики протеиназой А носит смешанный характер. Преобладает поодиночный («one-by-one») механизм протеолиза, но одновременно наблюдается и последовательный («zipper») протеолиз. Протеиназа В не действующая на нативный легумин, расщепляет легумин, модифицированный ограниченным гидролизом протеиназой А, практически только поодиночно. При увеличении степени предварительного воздействия протеиназы А скорость поодиночного расщепления модифицированного легумина протеиназой В вначале остается постоянной, а затем постепенно возрастает. Особенности хода протеолиза этими ферментами определяются специфичностью их действия [32].
Критерием получения модифицированного белка служит постоянство молекулярной массы в ходе протеолиза. На кинетической кривой этот момент соответствует смене типов протеолиза. Условия получения устойчивого промежуточного продукта для различных культур неодинаковы. Так, например, в случае гороха и кормовых бобов образованию легумина-Т соответствует время гидролиза порядка 15 мин. при соотношении фермент/субстрат 1/1000 [25]. Для получения легумина-Т (глицинина-Т) сои требуется время порядка 60 мин. при отношении фермент/субстрат 1/250 [26,30]. Поэтому различия в кинетике протеолиза легуминов различных культур могут приводить к различиям в структуре и свойствах модифицированных белков этих культур.
В процессе проращивания семян происходит изменение структуры запасных белков и их молекулярной массы. В литературе описан процесс распада запасных белков при проращивании бобов сои [15]. Согласно этим данным, в процессе проращивания уменьшается содержание белков с большой молекулярной массой, и появляются субъединицы с меньшим молекулярным весом. Наиболее существенные изменения в молекулярной массе белков происходят на вторые сутки проращивания [2,35].
Установлено, что изменение условий протекания гидролитической реакции, таких, как рН, температура, концентрация субстрата (белка), отношение концентраций фермента и субстрата (E/S), может влиять как на кинетику, так и на механизм гидролитической реакции, а значит и на свойства продуктов реакции [23,33,36]. Так, в работе [37] исследованы кинетика и механизм гидролиза легумина кормовых бобов трипсином при различных фермент-субстратных отношениях. Установлено, что уменьшение фермент-субстратного отношения приводит не только к непропорциональному снижению скорости гидролиза, но и к снижению относительного вклада ‘кооперативного’ гидролиза. Изменение E/S отношения сопровождается изменением субъединичного состава продукта ‘некооперативного’ гидролиза - модифицированного белка, изменением температуры и энтальпии его денатурации. Кроме того, при увеличении концентрации фермента наблюдается увеличение значений относительной гидрофобности модифицированного белка и изменение эмульгирующих свойств [18].
Определение изменения молекулярной массы белков методом гель-фильтрации
Для определения степени гидролитических изменений, происходящих в белках люпина во время индуцированного автолиза (определения изменения молекулярной массы белков), нами был использован метод высокоэффективной жидкостной хроматографии на гель-фильтрационной колонке (ВЭЖХ). Сущность метода состоит в том, что в хроматографическом процессе происходит фракционирование исходной смеси молекул на зоны в зависимости от их размеров. Соответствующие хроматографические зоны мигрируют с различными скоростями и выходят из колонки ввиде разделившихся пиков. Крупные молекулы вместе с подвижной фазой двигаются вдоль колонки быстрее, т.е. зоны выходят из колонки в порядке убывания молекулярной массы белков.
Гель – фильтрация – хроматографичекий метод фракционирования молекул по их размерам. Среди используемых жестких пористых матриц главную роль играет силика-гель. Неподвижная фаза представлена жидкостью, находящейся внутри пористых, хорошо смачиваемых гранул, заполняющих хроматографическую колонку. Если на такую колонку подается растворенное в элюенте смесь молекул различных размеров, то крупные молекулы, не способные проникнуть внутрь гранул, будут двигаться вдоль колонки вместе с подвижной фазой. В то же время наиболее мелкие молекулы, размеры которых заведомо меньше диаметра пор в гранулах, будут равномерно распределяться между подвижной и неподвижной фазами. Для них будет осуществляться хроматографический процесс с присущим ему замедлением миграции хроматографической зоны. Для молекул промежуточной величины благодаря статистическому распределению размеров пор окажется доступной только часть объема неподвижной фазы. Зоны таких молекул будут мигрировать вдоль колонки быстрее, чем мелкие молекулы, но медленнее, чем крупные. В результате произойдет фракционирование исходной смеси молекул на зоны в зависимости от их размеров. Зоны выходят из колонки в порядке убывания этих размеров. В простейшем случае, когда в исходной смеси содержатся молекулы только двух категорий (крупные и мелкие), гель-фильтрация позволяет осуществить «сортировку» этих молекул. Смесь молекул нескольких промежуточных размеров в ходе гель-фильтрации разделяется на ряд дискретных групп, различающихся между собой по степени доступности для них объема внутри гранул. Соответствующие хроматографические зоны мигрируют с различными скоростями и выходят из колонки в виде разделившихся «пиков» [38].
Пробоподготовка осуществлялась аналогично определению степени гидролитических изменений ТХУ растворимых пептидов. Пробы отбирались после трех часов гидролиза и на протяжении всего процесса автолиза со следующим интервалом 0, 48, 72 часа.
Условия хроматографии: хроматограф Gilson, колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент - 50мM К-фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин, УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой пробы - 100 мкл, концентрации белка - 10 мг/мл.
Параллельно с опытом осуществлялся контроль, аналогично опыту, но без внесения в суспензию муки люпина куриного пепсина. Полученные результаты измерения гидролитических изменений белков муки люпина представлены на рисунках 2,3,4,5,6,7,8,9. В таблицах 3,4,5,6,7,8,9,10 указаны время выхода фракций, различающихся по молекулярной массе, значения площадей пиков, характеризующие концентрацию каждой конкретной фракции, доля каждой фракции, в % к общему содержанию белка. Данные получены автоматически в ходе обработки хроматограмм специальным программным обеспечением.
Рисунок 2 - Гель-хроматограмма контрольной пробы (интенсивное гидратирование в течение 3 часов, рН 4,0) белков муки люпина. Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW (300 х 7,5); элюент - 50мM К-фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой пробы - 100 мкл. Концентрация пробы - 10 мг/мл
Таблица 3 - Результаты хроматографического анализа контрольной пробы белков муки люпина (интенсивное гидратирование в течение 3 часов, рН 4,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке
№ пика п/п
|
Характеристика хроматограммы контрольной пробы
|
Время выхода пика, мин.
|
Площадь пика
|
Доля фракции в общем содержании белка, %
|
1
|
13:09
|
4770,1
|
11,14
|
2
|
18:12
|
4064,1
|
9,49
|
3
|
23:16
|
6168,7
|
14,41
|
4
|
27:34
|
11931,8
|
27,87
|
5
|
29:59
|
5494,7
|
12,84
|
6
|
34:45
|
10375,6
|
24,24
|
Итого
|
|
42805,0
|
100,0
|
Рисунок 3 - Гель-хроматограмма пробы опыта (протеолиз белков муки люпина куриным пепсином в течение 3 часов, при соотношении E/S=1/50, рН 4,0). Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент - 50мM К-фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой пробы - 100 мкл. Концентрация пробы - 10 мг/мл
Таблица 4 - Результаты хроматографического анализа пробы опыта (протеолиз белков муки люпина куриным пепсином в течение 3 часов, при соотношении E/S=1/50, рН 4,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке
№ пика п/п
|
Характеристика хроматограммы пробы опыта
|
Время выхода пика, мин.
|
Площадь пика
|
Доля фракции в общем содержании белка, %
|
1
|
13:27
|
4236,3
|
8,5
|
2
|
18:20
|
6181,6
|
12,4
|
3
|
23:19
|
8663,9
|
17,38
|
4
|
27:04
|
10263,9
|
20,6
|
5
|
28:14
|
9116,8
|
18,3
|
6
|
33:22
|
11373,3
|
22,82
|
Итого
|
|
49835,8
|
100,0
|
При сравнении хроматограмм опыта (рис.3) и контроля (рис.2) на первом этапе индуцированного автолиза (протеолиз), заметно, что содержание фракции с большим молекулярным весом (пик 1) несколько меньше, а фракции с меньшим молекулярным весом (пик 5) больше, чем в контрольной пробе, такое различие обусловлено действием куриного пепсина, внесенного в пробу опыта и вызвавшего гидролитические изменения в белке, в виде расщепления высокомолекулярного белка, при этом происходит увеличение содержания белка с меньшим молекулярным весом.
Рисунок 4 - Гель-хроматограмма контрольной пробы (0 часов, рН 7,0) белков муки люпина Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент - 50мM К-фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой пробы - 100 мкл. Концентрация пробы - 10 мг/мл
Таблица 5 - Результаты хроматографического анализа контрольной пробы белков муки люпина (0 часов, рН 7,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке
N пика по п/п
|
Характеристика хроматограммы контрольной пробы
|
Время выхода пика, мин.
|
Площадь пика
|
Доля фракции в общем содержание белка, %
|
1
|
21:18
|
4430,3
|
12,34
|
2
|
29:11
|
4306,4
|
12,0
|
3
|
36:52
|
10008,1
|
27,89
|
4
|
42:40
|
7769,5
|
21,65
|
5
|
47:38
|
3581,1
|
9,98
|
6
|
54:14
|
5792,0
|
16,14
|
Итого
|
|
35887,4
|
100,0
|
Рисунок 5 - Гель-хроматограмма пробы опыта (автолиз 0 часов, рН 7,0) белков муки люпина. Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент - 50мM К- фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой пробы - 100 мкл. Концентрация пробы - 10 мг/мл
Таблица 6 - Результаты хроматографического анализа пробы опыта белков муки люпина (автолиз 0 часов, рН 7,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке
N пика по п/п
|
Характеристика хроматограммы пробы опыта
|
Время выхода пика, мин.
|
Площадь пика
|
Доля фракции в общем содержание белка, %
|
1
|
21:00
|
4710,3
|
12,36
|
2
|
29:01
|
4358,6
|
11,44
|
3
|
36:34
|
11247,5
|
29,53
|
4
|
42:08
|
7889,9
|
20,71
|
5
|
47:01
|
3926,5
|
10,31
|
6
|
53:34
|
5962,3
|
15,65
|
Итого
|
|
38095,1
|
100,0
|
Исходя из представленных в таблице 5, 6 и на рис. 4,5 данных, разница между пробами опыта и контроля в нулевой точке автолиза (рН 7,0) по содержанию фракций разного молекулярного веса очень незначительна, возможно, это связано с тем, что при изменении рН с 4,0 до 7,0, внесенный фермент куриный пепсин уже перестал действовать, а собственные эндогенные протеазы еще не активизировались.
Рисунок 6 - Гель-хроматограмма контрольной пробы (48 часов, рН 7,0) белков муки люпина. Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент- 50мM К- фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока-0,5 мл/мин, УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой пробы-100 мкл. Концентрация пробы 10 мг/мл.
Таблица 7 - Результаты хроматографического анализа контрольной пробы (48 часов, рН 7,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке.
N пика по п/п
|
Характеристика хроматограммы контрольной пробы
|
Время выхода пика, мин.
|
Площадь пика
|
Доля фракции в общем содержание белка, %
|
1
|
20:06
|
4125,8
|
14,28
|
2
|
28:02
|
3987,6
|
13,81
|
3
|
35:07
|
8409,8
|
29,12
|
4
|
40:59
|
5456,9
|
18,89
|
5
|
45:27
|
3109,0
|
10,76
|
6
|
51:45
|
3794,3
|
13,14
|
Итого
|
|
28883,4
|
100,0
|
Рисунок 7- Гель-хроматограмма пробы опыта (автолиз 48 часов, рН 7,0) белков муки люпина. Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент- 50мM К- фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока-0,5 мл/мин, УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой пробы-100 мкл. Концентрация пробы 10 мг/мл.
Таблица 8 - Результаты хроматографического анализа пробы опыта (автолиз 48 часов, рН 7,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке.
N пика по п/п
|
Характеристика хроматограммы пробы опыта
|
Время выхода пика, мин.
|
Площадь пика
|
Доля фракции в общем содержание белка, %
|
1
|
20:51
|
4530,4
|
12,96
|
2
|
27:52
|
4485,7
|
12,83
|
3
|
34:42
|
9595,7
|
27,45
|
4
|
41:05
|
7396,3
|
21,16
|
5
|
45:19
|
4205,7
|
12,03
|
6
|
51:51
|
4745,8
|
13,57
|
Итого
|
|
34959,6
|
100,0
|
Рисунок 8 - Гель-хроматограмма контрольной пробы (72 часа, рН 7,0) белков муки люпина. Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент - 50мM К- фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой пробы - 100 мкл. Концентрация пробы - 10 мг/мл
Таблица 9 - Результаты хроматографического анализа контрольной пробы белков муки люпина (72 часа, рН 7,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке
N пика по п/п
|
Характеристика хроматограммы контрольной пробы
|
Время выхода пика, мин.
|
Площадь пика
|
Доля фракции в общем содержание белка, %
|
1
|
20:04
|
4615,8
|
14,93
|
2
|
26:31
|
7736,8
|
25,03
|
3
|
33:27
|
6509,3
|
21,06
|
4
|
39:28
|
5483,3
|
17,74
|
5
|
43:05
|
2485,3
|
8,04
|
6
|
49:42
|
4079,5
|
13,2
|
Итого
|
|
30910,0
|
100,0
|
Рисунок 9 - Гель-хроматограмма пробы опыта (автолиз 72 часа, рН 7,0) белков муки люпина. Условия хроматографии: колонка TSK-Gel G2000SW(300 х 7,5); элюент - 50мM К- фосфатный буфер, pH 7,6; скорость протока - 0,5 мл/мин; УФ-детектирование при 254 нм. Объем вводимой пробы - 100 мкл. Концентрация пробы - 10 мг/мл
Таблица 10 - Результаты хроматографического анализа пробы опыта белков муки люпина (автолиз 72 часа, рН 7,0): время выхода фракций, площадь пиков фракций, доля фракции в общем белке
N пика по п/п
|
Характеристика хроматограммы пробы опыта
|
Время выхода пика, мин.
|
Площадь пика
|
Доля фракции в общем содержание белка, %
|
1
|
20:14
|
4328,2
|
14,64
|
2
|
26:43
|
4905,7
|
16,6
|
3
|
33:27
|
6646,0
|
22,49
|
4
|
39:39
|
5326,8
|
18,02
|
5
|
43:25
|
4049,9
|
13,7
|
6
|
49:35
|
4299,5
|
14,55
|
Итого
|
|
29556,1
|
100,0
|
Данные, представленные на рис. 8,9 и в таблицах 9,10 позволяют сказать, что в процессе автолиза идет уменьшение содержания высокомолекулярных фракций и увеличение содержания низкомолекулярных. При сравнении содержания первых трех пиков, которые отличаются более высокой молекулярной массой, заметно, что в пробе опыта по сравнению с контролем содержание этих фракций на 7,3% меньше, что позволяет нам говорить об автолитических процессах, происходящих в белке муки бобов люпина.
Исходя из представленных на рис. 2,3,4,5,6,7,8,9 хроматограмм и сущности хроматографического метода, можно сделать вывод, что в ходе автолиза происходит увеличение содержания белков с меньшим молекулярным весом. Особенно заметно эта тенденция проявляется на 3 сутки автолиза (72-х часовые пробы). Изменение молекулярного веса белков приводит к изменению технолого-функциональных свойств белковых препаратов люпина.
|
