4.2.2 Изучение динамики изменения углеводов люпина в процессе индуцированного автолиза
Еще одной группой антиалиментарных веществ бобовых культур являются олигосахариды рафинозной группы. К наиболее важным олигосахарам, которые необходимо отделять от белка, относятся раффиноза и стахиоза. Они содержатся в семенах бобовых и масличных культур, травах и листьях. Содержание олигосахаридов рафинозной группы в бобовых культурах показано в таблице 15 [40].
Таблица 15 - Содержание олигосахаридов рафинозной группы в бобовых культурах, %
Бобовые
|
Рафиноза
|
Стахиоза
|
Вербаскоза
|
Нут обыкновенный
|
1,1
|
2,5
|
-
|
Вигна
|
0,4
|
4,8
|
0,5
|
Фасоль обыкновенная
|
0,2
|
1,2
|
4,0
|
Чечевица
|
0,9
|
2,7
|
1,4
|
Горох
|
0,6
|
1,9
|
2,2
|
Соя
|
1,1
|
5,4
|
-
|
У многих людей олигосахариды, представленные в табл. 15, вызывают метеоризм - образование газов и расстройство желудочно-кишечного тракта. Метеоризм обусловлен отсутствием у человека фермента β-галактозидазы, необходимого для гидролиза рафинозы и стахиозы, т.е. они не гидролизуются ферментами желудочно-кишечного тракта, а подвергаются анаэробному распаду под действием микрофлоры кишечника, сопровождающемся образованием углекислого газа, водорода и метана [56]. α-галактозиды способствуют жизнедеятельности вредных микроорганизмов в кишечнике человека и животных [57]. При кулинарной обработке семян бобовых содержание олигосахаридов в них значительно возрастает, а при прорастании снижается [56].
В результате ферментативного воздействия увеличивается пищевая ценность, повышается степень экстракции белка, идет частичный гидролиз белков и полисахаридов, происходит накопление свободных аминокислот и легкоусвояемых сахаров [58,59,60].
В препаратах протеолитического действия обычно присутствуют сопутствующие ферменты, как правило, амилаза и β-глюканаза. Наличие таких сопутствующих ферментов оказывает положительный эффект на выход конечного продукта, так как действие этих ферментов проявляется в разрушении полисахаридов клеточных стенок сырья и улучшении экстракции в целом [58,59].
Определения гидролитических изменений сахаров с помощью 3,5-динитросалициловой кислоты
Содержание олигосахаридов, как следует из таблицы 15, в муке люпина незначительно, однако, исходя из вышеописанных эффектов, оказываемых олигосахаридами на организм человека, представлялось целесообразным определить влияние процесса индуцированного автолиза на изменение содержание редуцирующих сахаров.
Метод основан на взаимодействии сахаров с 3,5-динитросалициловой кислотой, последняя восстанавливается в 3-амино-5-нитросалициловую, а карбонильная группа моно-, ди-, олиго- и полисахаридов окисляется до карбоксильной, что приводит к переходу окраски от желтой к красно-бурой.
К 1 мл испытуемого раствора прибавляли 1 мл 10%-ного формамида и 1 мл 2,27 н NaOH, через 30 минут добавляли 2 мл динитросалицилового реактива. 2,27 н NaOH используется для лучшего растворения сахаров. Полученные образцы тщательно перемешивали и погружали в кипящую водяную баню на пять минут, для того, чтобы компоненты прореагировали, и произошло изменение окраски. Затем охлаждали до комнатной температуры. После этого на спектрофотометре проводили определение оптической плотности при длине волны 545 нм. В качестве контроля служил раствор, в котором 1 мл пробы заменяли 1 мл дистиллированной воды. Содержание продуктов гидролиза сахаров рассчитывали по калибровочной кривой (зависимость оптической плотности от концентрации сахаров), построенной по моногидрату мальтозы. Для этого готовили растворы моногидрата мальтозы с концентрацией от 0,2 мг/мл до 2,0 мг/мл.
Динитросалициловый реактив готовили следующим образом: в мерной колбе на 250 мл растворяли в 20 мл дистиллированной воды навеску 3,5-динитросалициловой кислоты (2,5 г), полученный раствор кипятили на водяной бане до полного растворения реактива. К полученному раствору добавляли 50 мл 8%-ного раствора NaOH и 125 мл 60%-ного раствора виннокислого натрия-калия, и доводили до метки дистиллированной водой [61,62].
Исследование динамики изменения сахаров в процессе индуцированного автолиза
Согласно литературным данным, в процессе проращивания претерпевают изменения не только белки, но и углеводы [35]. Colmenares de Ruiz с коллегами показали, что в течение 48 часов проращивания происходит снижение содержания олигосахаридов, а к 72 часам они полностью исчезают [7,54]. Аналогичные данные были получены Jaya и Venkataraman [8], Kon [9] и др. Происходит распад запасных углеводов и увеличение общего содержания растворимых и редуцирующих сахаров [7,63]. Схожие данные об увеличении в процессе проращивания содержания моносахаридов и снижении концентрации олигосахаридов были получены East [64], Kuo [65] и др.
Для выявления идентичности процессов, происходящих с углеводами в муке люпина, модифицированной методом индуцированного автолиза, процессам, происходящим с углеводами в семенах при проращивании, нами было проведено определение гидролитических изменений сахаров в муке люпина с помощью 3,5-динитросалициловой кислоты, т.е. в качестве критерия оценки нами также было выбрано определение динамики изменения редуцирующих сахаров в процессе индуцированного автолиза.
Как было отмечено, одним из алиментарных факторов бобовых являются α-галактозиды или рафинозные олигосахариды, такие как раффиноза, стахиоза и вербаскоза. Вопросу исследования содержания этих веществ в бобовых культурах посвящено значительное количество работ – Nakayama [66], Murphy [67], Mansour и Khalil [68] и др. Все эти исследования объединяет одно – признание α-галактозидов антиалиментарным фактором бобовых и поиски путей снижения их содержания.
В муке семян люпина узколистного содержится в среднем 4% рафинозных олигосахаридов, что снижает их пищевую ценность и усвояемость, в связи с чем перед нами стояла задача определить как будет влиять процесс индуцированного автолиза на содержание данной группы углеводов. В процессе проращивания семян происходит снижение содержания рафинозных олигосахаридов, это отмечали в своих работах Mansour и Khalil [68], Cuadra и Burbano [10] и др. В исследованиях Jaya и Venkataraman, Dagnia и Petterson [8,54,69] было показано, что концентрация олигосахаридов раффинозной группы снижается практически до нуля.
Поэтому процесс изменения содержания нередуцирующих сахаров, к которым и относятся α-галактозиды, был использован для сравнения процесса проращивания и индуцированного автолиза.
Об изменениях, происходящих с олигосахаридами в процессе индуцированного автолиза, судили по динамике образования редуцирующих сахаров в муке люпина. Данный выбор был основан на том, что согласно литературным данным [44,63,7] олигосахариды, в том числе α-галактозиды, в процессе гидролиза распадаются до редуцирующих сахаров, не оказывающих неблагоприятного воздействия на организм человека.
Параллельно с опытом осуществлялся контроль, аналогично опыту, но без внесения в суспензию муки люпина куриного пепсина.
На первом этапе индуцированного автолиза (протеолизе) изменение оптической плотности растворов, содержащих редуцирующие сахара, было равно 0, т.е. в образцах и опыта и контроля были получены одинаковые значения оптической плотности. Это связано с тем, что в качестве эндогенного фермента нами был использован куриный пепсин, который приводит к гидролизу белков, но не затрагивает углеводы, а экзоферменты муки бобов люпина на первом этапе индуцированного автолиза не работают.
В таблице 16 представлены полученные результаты измерения прироста продуктов гидролиза сахаров во время автолиза (второй этап индуцированного автолиза). На рис. 11 показана динамика изменения содержания редуцирующих сахаров.
Таблица 16 - Результаты измерения гидролитических изменений сахаров с помощью 3,5-динитросалициловой кислоты в процессе индуцированного автолиза (второй этап)
Время автолиза, ч
|
Значение оптической плотности е.о.п.
|
Δ *
|
пробы опыта
|
пробы контроля
|
0
|
1,08
|
1,07
|
0,01
|
1
|
1,08
|
1,08
|
0,0
|
3
|
1,22
|
1,17
|
0,05
|
22
|
1,23
|
1,18
|
0,05
|
24
|
1,23
|
1,18
|
0,05
|
43
|
1,3
|
1,18
|
0,12
|
48
|
1,29
|
1,17
|
0,12
|
70
|
1,42
|
0,91
|
0,51
|
72
|
1,57
|
0,85
|
0,72
|
*Δ – разность значений е.о.п. между опытом и контролем, характеризующая изменение содержания редуцирующих сахаров в опыте по отношению к контролю
Представленные в таблице 16 и на рис. 11 данные показывают, что в процессе автолиза идет увеличение оптической плотности проб опыта, по сравнению с пробами контроля. Полученные результаты можно интерпретировать следующим образом, в процессе автолиза под действием собственных ферментов муки семян люпина происходит гидролиз нередуцирующих сахаров, в результате которого увеличивается содержание редуцирующих сахаров.
 Рисунок 11 - Динамика редуцирующих сахаров муки люпина в процессе индуцированного автолиза (второй этап), в сравнении с контролем
Приведенные экспериментальные данные позволяют говорить о распаде нередуцирующих сахаров до более простых, что коррелирует с результатами исследований Dagnia и Petterson [54], Cuadra и Burbano [10], East [64] и др. В этих работах отмечалось увеличение содержания растворимых и редуцирующих углеводов и снижение содержания олигосахаридов и крахмала в процессе проращивания семян бобовых. Так, Kuo в своих исследованиях семян сои отмечал, что в процессе проращивания идет превращение сахаров группы раффинозы в сахарозу и ее гидролиз до моносахаров, которые используются проростком для развития. Этот процесс сопровождается повышением инвертной активности проростков и значительным увеличением содержания глюкозы и фруктозы в тканях проростка [65].
В ходе проведения исследования было выяснено, что максимальное наращивание оптической плотности в растворах пробы опыта происходило после 40 часов автолиза, т.е. увеличение концентрации продуктов гидролиза сахаров происходит к концу вторых суток, что коррелируют с литературными источниками, так, Ruiz с Bressani [7] отмечали увеличение содержания редуцирующих сахаров после 48 часов проращивания.
Определение содержания редуцирующих и нередуцирующих сахаров в муке люпина и сои
Определение содержания сахаров проводилось методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Сущность метода состоит в простом изократическим разделении сахаров на силикагелевых и полимерных колонках с привитыми амино-пропильными группами или катионообменными смолами в соединении с рефрактометрическим детектированием [70].
Предварительно осуществляли пробоподготовка образцов. Навеску муки обезжиривали смесью гексана и метанола. Для четкого разделения пиков при хроматографировании наибольшую роль играет содержание именно жира, т.к. даже следы жира могут помешать определению содержания сахаров. Сахара извлекают из исследуемых образцов 80% этиловым спиртом, трехкратной экстракцией по 15 мин при температуре 75-80°С на водяной бане. Спиртовые экстракты объединяют, спирт упаривают под вакуумом при температуре не выше 40°С, разбавляют водой и фильтруют через 0,45 мкм фильтр [70,71,72].
В исследовании использовали хроматограф фирмы Gilson (Франция), оснащенный изократическим насосом, устройством для введения образца, рефрактометрическим детектором. Колонка - силикагель с химически привитой аминофазой (Aminex HPX - 87 P (размеры 300x7,8мм) фирмы Bio-RAD. На колонку наносили пробы объёмом 50 мкл. Подвижная фаза - вода бидистиллят, скорость потока 0,6 мл/мин, температура термостатирования колонки 85ºС. Обнаружение с помощью рефрактометрического детектора.
Идентификацию хроматографических пиков проводили, используя внешние стандарты следующих сахаров (фирма «Supelco»): мальтозы, фруктозы, сахарозы, глюкозы. Обработка результатов велась в программе Multichrom [73,74,75].
Углеводам в питании человека принадлежит важная роль, они являются главным источником энергии для организма. В пищевых продуктах углеводы представлены сахарами, крахмалом, пищевыми волокнами и т.д. [76].
В таблице 17 представлено содержание общего сахара, а также редуцирующих и нередуцирующих сахаров в исследуемых образцах муки люпина и сои.
Таблица 17 - Содержание сахаров в исследуемых образцах муки люпина и сои
|
Исследуемый образец муки
|
Мука люпина нативная
|
Мука люпина модифицированная
|
Соевая мука
|
Массовая доля общего сахара, %,
в том числе
|
14,66
|
14,8
|
13,96
|
Массовая доля сахарозы, %
|
4,08
|
3,5
|
4,46
|
Массовая доля глюкозы, %
|
3,74
|
4,31
|
2,88
|
Массовая доля мальтозы, %
|
1,93
|
2,31
|
2,12
|
Массовая доля фруктозы, %
|
0,55
|
1,12
|
-
|
Массовая доля других сахаров, в том числе олигосахаридов, %
|
4,36
|
3,56
|
4,5
|
Общее содержание сахаров в соевой муке коррелирует с литературными данными [71,76] и достаточно близко по значению к муке люпина. Из усвояемых сахаров первостепенное значение принадлежит сахарозе, содержание которой в исследуемых образцах почти одинаково и составляет чуть более 4,0%, кроме муки люпина модифицированной, где содержание сахарозы составляет 3,5%, что на 0,6% меньше, чем в нативной муке люпина, данное различие связано с гидролитическими процессами, происходящими в сахарах в процессе индуцированного автолиза. Также в муке люпина присутствуют моносахара, такие как глюкоза и фруктоза. Необходимо отметить, что в состав сахаров входят также олигосахариды, вещества которые не гидролизуются в организме человека и являются антиалиментарными факторами в питании [40]. Но в модифицированной муке люпина содержание олигосахаридов меньше, это связано с изменениями, происходящими в процессе индуцированного автолиза, в результате которого нередуцирующие сахара (олигосахариды) гидролизуются до редуцирующих, этим и объясняется увеличение количества глюкозы и фруктозы в модифицированной муке люпина по сравнению с нативной, более чем на 1,5%.
|
