ИЗУЧЕНИЕ ХИМИЧЕСКОГО СОСТАВА КАЛИНЫ ОБЫКНОВЕННОЙ, ПРОИЗРАСТАЮЩЕЙ В КУЗБАССЕ
Попов А.И., доктор фармакологических наук, профессор;
Дементьев Ю.Н., доцент
ФГБОУ ВПО «Кемеровский государственный сельскохозяйственный институт» Аннотация. В статье приводятся результаты качественного состава и количественного содержания химических элементов в калине обыкновенной, произрастающей в Кемеровской области, сырьё которой отличается повышенным содержанием селена (Se). В Сибири – на территории степной части Алтайского и южной части Красноярского краев, а также в Томской, Новосибирской и Кемеровской областей широко распространена калина обыкновенная (Viburnum opulus L) семейства жимолостные (Caprifoliaceae). Калина – евро-сибирский вид, который отдельные авторы относят к семейству калиновые (Viburnaceae) [1].
Калина отличается устойчивым, стабильным плодоношением, неурожаи у неё редки.
Калина обыкновенная – кустарник высотой 1,5 – 4,0 м или маленькое дерево с серовато-бурой, трещиноватой корой и гладкими, не одетыми пробкой, молодыми побегами. Листья супротивные, широко-яйцевидные или округлые темно-зеленые голые, снизу серовато-зеленые, трех-пятилопастные, по жилкам слабоопушенные. По количеству железок на черешках, по сведениям Н.С. Турчанинова и М.Г. Попова, в Средней Сибири калина обыкновенная отличается от калины даурской (V. dauricum Pall) и калины Саржента (V. sargentii Koehne). Калина обыкновенная, как правило, имеет 2-8 железок [2]. Иное количество железок у калины обыкновенной во время экспедиций установлено не было [1].
Соцветия расположены у калины обыкновенной на верхушках молодых ветвей, плоские, зонтиковидные и снабжены ножкой. Прицветники узкие, голые, опадающие; все части соцветия голые, реже усаженные мелкими железками. Цветки белые или розовато-белые, краевые-крупные, бесплодные, срединные-плодущие, сидячие или на очень коротких цветоножках. Завязь цилиндрическая. Плоды – овальные или шаровидные красные костянки, с крупной, сплюснутой косточкой.
В медицине используют кору и плоды калины. Ветви, вместе с цветами и плодами, употребляют в ветеринарии для лечения ящура крупного рогатого скота.
Плоды после заморозков употребляют в пищу. Используются в кондитерском и ликероводочном производствах [3].
Калина обыкновенная пользуется большой популярностью среди местного населения как декоративное и медоносное растение.
Субстанции и препараты калины обладают вяжущим, общеукрепляющим, кровоостанавливающим, отхаркивающим, успокаивающим, потогонным, противоспазматическим, слабительным, мочегонным, противоопухолевым действием, а также способствуют снижению кровяного давления при гипертонии, и применяются при кожных болезнях и язвенных заболеваниях. Вместе с тем, в формировании суммарного профилактического и лечебного эффекта извлечений калины, несомненно, участвуют полифенольные соединения данного растения и витаминная активность. Актуальным остается и изучение химического состава калины в экологическом аспекте, т. к. последний носит выраженный региональный характер. Информация подобного рода крайне недостаточная.
Данная работа посвящена исследованию химического состава калины и является продолжением ранее начатых исследований по изучению биологически активных веществ растений из угледобывающих районов Кузбасса [4,6,7,].
Исследования проводили на образцах сырья калины, собранных в течение весны и лета на территории Кузбасса (Кемеровской области) во время ресурсоведческих экспедиций.
Плоды, листья и кору ветвей калины заготавливали в типичных для данного вида местах произрастания – пойменные луга и долины рек, подлесок, леса и уремы лесной и лесостепной зоны, а также нижняя часть горнолесного пояса, в соответствии с общепринятыми требованиями. Визуальных признаков морфологических аберраций от избыточных количеств ксенобиотиков в почве и атмосфере не установлено.
При изучении анатомно-диагностических признаков изучаемых образцов калины обыкновенной различий не отмечено.
Обнаружение органических биологически активных веществ (БАВ) проводили методами хроматографии – на бумаге и в тонком слое сорбента (ТСХ), а также высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ); по качественным реакциям, величинам Rf в различных системах растворителей и сравнению с достоверными образцами. Выбор хроматографических систем и проявителей обусловлен природой БАВ, обнаруженных в видах калины и других представителей семейства Caprifoliaceae [4].
Извлечение БАВ из растительного сырья проводили методом дифференциальной экстракции. Для исследований сырье измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. В начале сырье обрабатывали 70%-ным этиловым спиртом, затем извлечение упаривали, остаток растворяли в кипящей воде, после чего последовательно обрабатывали хлороформом, этилацетатом и Н-бутанолом. Навески сырья, объемы этанола и массы сухих остатков (экстрактов), полученных после фракционирования, представлены в таблице 1.
Хлороформные фракции из плодов, листьев и коры ветвей исследовали на наличие стереоидных, тритерпеновых и иридоидных соединений, а также пигментов и жирных кислот. Остатки после удаления хлороформа предварительно растворяли в метаноле и фильтровали через слой окиси алюминия для освобождения от фенольных соединений. Таблица 1
Фракционирование извлечений из различных органов и частей калины
Орган или часть растения
| Масса воздушно-сухого сырья, г
| Объем спирто-водного извлече-ния, л
| Масса сухого остатка
после фракционирования, г
| хлоро-формное извлечение
| этил-ацетатное извлечение
| бута-нольное
извле-чение
| Плоды
| 1000,0
| 10,0
| 10,2
| 50,3
| 25,6
|
Продолжение таблицы
Листья
| 1000,0
| 12,0
| 50,4
| 30,1
| 15,7
| Кора ветвей
| 500,0
| 5,0
| 14,9
| 10,5
| 4,8
|
Хлороформную фракцию из листьев дополнительно освобождали от хлорофиллов обработкой гексаном. Очищенные экстракты разделяли методом хроматографии на бумаге и в тонком слое силикагеля в системах, указанных в табл. 2, затем проявляли соответствующими реактивами и просматривали в видимом и УФ – свете.
Этилацетатную и бутанольную фракции исследовали на присутствие фенольных соединений: флаваноидов, кумаринов, фенолкарбоновых и гидроксикоричных кислот, дубильных веществ, производных гидрохинона. В водном остатке обнаружены свободные сахара, амингидроксикоричные и алифатические кислоты (табл. 2). Таблица 2
Системы растворителей и реактивы, используемые для анализа биологически активных веществ, выделенных из калины
Вещества
| Система растворителей
| Детектирующие системы
| 1
| 2
| 3
| Хлорофиллы
| Бензол-этилацетат-метанол (100:6:0,5); петролейный эфир-метанол (99:1); петролейный эфир-ацетон (8:2)
| УФ-свет
| Каротиноиды жирные кислоты
| Бензол-этилацетат-метанол (100:6:0,5); петролейный эфир-метанол (99:1); петролейный эфир-ацетон (8:2); петролей-ный эфир; гептан-метанол (8:2)
| 6%-ный раствор хлорида сурьмы (III)
| Иридоиды
| Хлороформ-бензол-метанол (3:1:1); хлороформ-метанол (9:1); хлороформ-метанол (4:1)
| n-ДМАБА; реактив Шталя; реактив Бэкон-Эдельмана
| Тритерпеновые кислоты
Стероидные соединения
| Бензол-этилацетат-метанол (100:6:0,5); четыреххлористый углерод-этилацетат-метанол-аммиак (15:4:1:1)
| 6%-ный раствор хлорида сурьмы (III); 1%-ный раствор вани-лина в конц. Н2SO4
| Производные гидрохинона
| н-Бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2); 5%-ная уксусная кислота; 30%-ная уксусная кислота
| Диазореактив; 10%-ный спиртовый раствор щелочи
|
Продолжение таблицы
Флавоноиды
| н-Бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2); 5%-ная уксусная кислота; хлороформ-уксусная кислота-вода (13:6:1)
| 3%-ный раствор хлорида алюминия (III); 3%-ный раствор хлорида железа (III)
| Карбоновые кислоты
Органические алифатические кислоты
| Этанол-аммиак-вода (13:4:3); метанол-аммиак (8:2)
| 0,1%-ный раствор бромтимолового синего
| Фенолкарбоновые кислоты
Дубильные вещества
| н-Бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2); 5%-ная уксусная кислота
| 3%-ный раствор хлорида железа (III); диазореактив с 10%-ным раствор. щелочи
| Производные гидроксикоричных кислот
| н-Бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1); 15%-ная уксусная кислота
| 25%-ный раствор аммиака; диазореактив
| Катехины
| н-Бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1); 5%-ная уксусная кислота; 15%-ная уксусная кислота
| 1%-ный раствор ванилина в конц. НCl
| Гидроксикумарины
| Неподвижная фаза-ацетон-формамид (3:1); подвижная фаза-петролейный эфир, насыщенный формамидом; 5%-ная укс. кисл.
| 10%-ный раствор щелочи
|
|
|
| Антоцианы
| н-Бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1); муравьиная кислота; НCl конц.-вода (5:2:3); муравьиная кислота- НCl конц.-вода (15:3:82)
| УФ-свет
| Свободные сахара
| Н-Бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1); ацетон-пиридин-вода (6:4:3); 0,1 н. раствор НCl
| Анилинфталатный реактив
| Аминокислоты
| Н-Бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:1); пиридин-метанол-вода (4:80:20)
| Нингидриновый реактив
| Примечание. n-ДМАБА – n-диметиламинобензальдегид; конц. – концентрированная Результаты хроматографического анализа представлены в таблице 3. Как следует из таблицы, в хлороформной фракции обнаружены иридоиды, тритерпеновые соединения, стероиды, каротиноиды, хлорофиллы и жирны кислоты. Наибольшим числом соединений представлены иридоиды: в коре обнаружено не менее 9 веществ, а плодах – не менее 5. В хлороформной фракции из листьев также отмечено присутствие иридоидов, однако их четкого разделения в ходе предварительного анализа добиться не удалось. Всего в хлороформной фракции из коры обнаружено не менее 15 веществ, из листьев – не менее 10, а из плодов – не менее 13. Таблица 3
Содержание биологически активных веществ в различных фракциях, извлеченных из органов и частей калины
Вещества
| Кора
| Листья
| Плоды
| Вещества
| Кора
| Листья
| Плоды
| Хлорофильная фракция
| Гидроксикумарины
| 4
| 4
| –
| Иридоиды
| 9
| +
| 5
| Катехины
| 3
| –
| 3
| Стероиды
| 1
| 1
| 1
| Бутанольная фракция
| Тритерпенодиды
| 2
| 2
| 2
| Антоцианы
| –
| –
| 2
| Каротиноиды
| 2
| 2
| 2
| Дубильные вещества
| +
| +
|
| Хлорофиллы
| 3
| 5
| 3
| Флавоноиды (биозиды)
| +
| 2
| 2
| Жирные кислоты
| +
| +
| +
| Фенолкарбоновые кислоты
| +
| –
| +
| Этилацетатная фракция
| Катехины
| +
| –
| +
| Производные гидрохинона
| +
| +
| +
| Водный остаток
| Дубильные вещества
| 2
| 3
| 2
| Свободные сахара
| 2
| 3
| 3
| Флавоноиды:
агликоны
монозиды
|
+
|
2
3
|
2
2
| Аминокислоты
| +
| +
| +
| Производные гидрооксикоричной кислоты
| 6
| 6
| 6
| Органические алифа-тические кислоты
| +
| +
| 6
| Карбоновые кислоты
| 1
| 1
| 1
| Производные гидроксиричной кислоты
| +
| +
| +
| Фенолкарбоновые кислоты
| 1
| 1
| 1
|
|
|
|
| Примечание. Цифры – число обнаруженных пятен. Знак «+» означает присутствие,
«–» отсутствие соединений в исследуемых фракциях В этилацетатной фракции найдены производные гидрохинона, гидроксикоричные и фенолкарбоновые кислоты, гидроксикумарины, флавоноидные агликоны и монозиды, катехины, дубильные вещества. В бутанольной фракции обнаружены антоцианы, флавоноидные биозиды, а также фенолкарбоновые кислоты, катехины и дубильные вещества в следовых количествах. Всего в результате хроматографического разделения в этилацетатной фракции из коры обнаружено 18, из листьев – 21, а из плодов 20 соединений. В бутанольной фракции из плодов выявлено 4 вещества, из листьев – 2.
При исследовании водного остатка установлено наличие свободных сахаров, аминокислот, алифатических кислот, а также следовых количеств гидроксиричных кислот. Всего в водных остатках из листьев и из плодов выявлено по 9 соединений, а из коры – 8.
В тех случаях, когда достигалось четкое разделение веществ на хроматограммах, проводилась идентификация обнаруженных соединений в сравнении с соответствующими достоверными образцами. Результаты определения представлены в таблице 4. Таблица 4
Результаты химического исследования различных органов и частей калины
Вещества
| Кора
| Листья
| Плоды
| Вещества
| Кора
| Листья
| Плоды
| 1
| 2
| 3
| 4
| 5
| 6
| 7
| 8
| α-Каротин
| +
| +
| +
| n-Кумаровая кислота
| +
| +
| +
| β-Каротин
| +
| +
| +
| Хлорогеновая кислота
| +
| +
| +
| Ацетилопулюсиридоид
| +
| О
| –
| Неохлорогеновая кислота
| +
| +
| +
| Опулюсиридоид I
| +
| О
| +
| Кофейная кислота
| +
| +
| +
| Опулюсиридоид II
| +
| О
| +
| Умбеллиферон
| +
| +
| –
| Олеоноловая кислота
| +
| +
| +
| Скополетин
| +
| +
| +
| Урсоловая кислота
| +
| +
| +
| Эскулетин
| +
| +
| –
| 1
| 2
| 3
| 4
| 5
| 6
| 7
| 8
| β- Ситостерин
| +
| +
| +
| Эскулин
| +
| +
| –
| Арбутин
| +
| +
| +
| Цианидин-3-глюкозид
| –
| –
| +
| Бензойная кислота
| +
| +
| +
| Цианидин-3-ксилозилглюкозид
| –
| –
| +
| Галловая кислота
| +
| +
| +
| Д-Глюкоза
| +
| +
| +
| Кверцетин
| О
| +
| +
| Д-Ксилоза
| +
| +
| +
| Кемферол
| О
| +
| +
| Д-Арабиноза
| –
| +
| +
| Кверцетин-3-рамнозид
| О
| +
| +
| Яблочная кислота
| О
| О
| +
| Кверцетин-3-галактозид
| О
| +
| +
| Аскорбиновая кислота
| О
| О
| +
| Кверцетин-3-глюкозид
| О
| +
| +
| Янтарная кислота
| О
| О
| +
|
Кверцетин-3,7-диглюкозид
| О
| +
| +
| Уксусная кислота
| О
| О
| +
| Кемферол -3,7-диглюкозид
| О
| +
| +
| Муравьиная кислота
| О
| О
| +
| Катехин
| +
| О
| +
| Сорбиновая кислота
| О
| О
| +
| Примечание. Цифры – число обнаруженных пятен. Знак «+» означает присутствие, «–» отсутствие соединений в исследуемых фракциях, «О» - не достигнуто четкого хроматографического разделения Как видно из таблицы, в исследованных органах и частях калины идентифицировано 38 соединений, в том числе в коре – 22, в листьях – 27, в плодах – 34.
Дальнейшие исследования нашей работы посвящены более детальному изучению качественного состава полифенольного комплекса плодов калины и использованию современных физико-химических методов анализа.
Для изучения компонентного состава фенольной фракции плодов были проведены специфические качественные реакции по идентификации полифенольных соединений и последующая хроматография в тонком слое сорбента.
Изучение качественного химического состава плодов проводилось на пластинках «Сорбфил» в системах растворителей: этилацетат – кислота уксусная – вода (5:1:1); этилацетат – метилэтилкетон – кислота муравьиная – вода (50:30:10:10); бензол – спирт этиловый – кислота уксусная ледяная (45:8:3); хлороформ – этиловый спирт (40:10). В качестве объекта исследования, в данном случае, использовали спиртовые извлечения (спирт этиловый 70%) из плодов. Для обнаружения фенольных соединений спиртовые извлечения хроматографировали восходящим методом. В качестве растворов сравнения использовали растворы 0,05% стандартных образцов рутина, кверцетина, кемферола, лютеолина, лютеолин-7-гликозида, гесперидина, кислоты галловой, кислоты хлорогеновой, кислоты кофейной в метаноле. Детектирование зон адсорбции осуществляли в видимом свете, УФ-свете при длине волны 254 нм, а также при опрыскивании раствором алюминия хлорида 5% в спирте этиловом 95%.
В результате тонкослойного химического анализа было установлено, что лучшее разделение происходит при хроматографировании спиртовых извлечений на пластинках «Сорбфил» в системе растворителей: этилацетат – метилэтилкетон – кислота муравьиная – вода (50:30:10:10). В составе анализируемых образцов были выявлены соединения фенольной природы, идентичные кверцетину, кемферолу, лютеолину, лютеолин-7-гликозиду, гесперидину, кислоту кислоте галловой, кислоте хлорогеновой, кислоте кофейной.
Следующим этапом данной работы стало подтверждение ранее полученных результатов анализа методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Данный метод отличает высокая чувствительность и позволяет судить о качественном составе исследуемой группы соединений. Анализ проводили на высокоэффективном жидкостном хроматографе фирмы «Gilston» (Франция) c ручным инжектором «RHEO-DYNE-7125» (USA) с последующей компьютерной обработкой результатов исследования с помощью программы (Мульти Хром для Windows). В качестве неподвижной фазы была использована металлическая колонка PLA TINUM EPS C -18 100A размером 4,6х250 мм. Подвижная фаза: спирт метиловый – вода - кислота фосфорная концентрированная (40:60:0,5). Анализ проводили при комнатной температуре. Скорость подачи элюента 0,5 мл/мин. Продолжительность анализа 7 – 8 мин. Детектирование проводили с помощью УФ детектора при длине волны 254 нм.
Для исследования плоды измельчали до размера частиц, проходящих сквозь сито с диаметром отверстий 2 мм. Затем 10 г измельченного сырья помещали в круглодонную колбу вместимостью 250 мл, прибавляли 50 мл спирта этилового (70%), присоединяли к обратному холодильнику и нагревали на кипящей водяной бане в течение 1 часа с момента закипания спиртоводной смеси в колбе. После охлаждения смесь фильтровали через бумажный фильтр в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили объем этиловым спиртом 70% до метки (исследуемый раствор). Параллельно готовили серию 0,05% растворов сравнения в метиловом спирте: кверцетина, кемпферола, кверцетин-3-галактозида, кверцетина-3-рамнозина, ксипферол-3-гликозида, гесперидина, лютеолина, лютеолин-гликозид, пирогаллола и хлорогеновой, неохлорогеновой, кофейной, коричной, эллаговой, феруловой, галловой кислот.
По 20 мкл исследуемого раствора и растворов сравнения вводили в хроматограф и анализировали в ранее описанных условиях. Полученные результаты приведены в таблице 5. Таблица 5
Результаты исследования 70% спиртового извлечения из плодов калины методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
Идентифицированные соединения
| Время удерживания стандартных образцов, с
| Кверцетин
| 2107
| Кемпферол
| 306,4
| Кверцетин-3-галактозид
| 1641
| Кверцетин-3-рамнозид
| 1503
| Кверцетин-3-гликозид
| 1916
| Гесперидин
| 720
| Лютеолин
| 1085
| Лютеолин-7-гликозид
| 840,1
| Галловая кислота
| 323,3
| Эллаговая кислота
| 980,1
| Хлорогеновая кислота
| 312
| Неохлорогеновая кислота
| 268,5
| Кофейная кислота
| 327,2
| Коричная кислота
| 1713
| Пирогаллол
| 741
|
Фитохимический анализ различных органов и частей калины, собранной в Кемеровской области, показал, что в коре ветвей, листьях и плодах содержатся каратиноиды, иридоиды, флавоноиды, гидроксикумарины, сахара, стерины, производные гидрохинона, дубильные вещества, тритерпеновые соединения, гидроксикоричные, фенолкарбоновые алифатические кислоты и аминокислоты. Кроме перечисленных БАВ в плодах обнаружены антоцианы, в коре ветвей и в плодах катехины (табл. 1-4).
В результате высокоэффективной жидкостной хроматографии в извлечениях, полученных из плодов калины, было установлено наличие следующих веществ полифенольной природы, идентифицированных по времени удерживания стандартных растворов: кверцетин, кемпферол, кверцетин-3-галактозид, кверцетин-3-рамнозид, кверцетин-3-гликозид, гесперидин, лютеолин, лютеолин-7-гликозид, галловая кислота, эллаговая кислота, хлорогеновая кислота, неохлорогеновая кислота, кофейная кислота, коричная кислота и пирогаллол, что подтверждает качественный полифенольный состав соединений, ранее идентифицированных при помощи тонкослойной хроматографии на пластинка «Сорбфил» (табл. 5).
Проведенные исследования спиртоводных 70% извлечений из плодов калины методом тонкослойной хроматографии на пластинка «Сорбфил», показали, что в составе исследуемых образцов содержатся соединения полифенольной природы, идентичные кверцетину, кемпферолу, лютеолину, лютеолин-7-гликозид, гесперидину, галловая, хлорогеновой и кофейная кислотам.
Таким образом, изучен качественный состав полифенольного комплекса спиртовых извлечений плодов калины методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, в результате которого в исследуемых образцах установлено присутствие кверцетина, кемпферола, кверцетин-3-галактозида, кверцетин-3-рамнозида, кверцетин-3-гликозида, гесперидина, лютеолина, лютеолин-7-гликозида; галловой, эллаговой, хлорогеновой, неохлорогеновой, кофейной и коричной кислот, а также и пирогаллола.
Установлены вещества полифенольной природы, доминирующие в изучаемом растительном сырье, что является наиболее важным фактором для последующей разработки методики их количественной оценки.
Всего в исследованных органах и частях калины хроматографическими методами, описанными в доступной литературе, идентифицировано 38 соединений. Список использованной литературы
1. Красноборов, И.М. Определитель растений Кемеровской области / И.М. Красноборов, Э.Д. Крапивкина, М.Н. Ломоносова [и др.]. – Новосибирск: Изд-во СО РАН, 2001. – 477 с.
2. Попов, М.Г. Флора средней Сибири / М.Г. Попов. – М. – Л.: Изд-во АН СССР, 1959. – Т. 1-11. – 918 с.
3. Попов, А.И. Лекарственные растения в народной медицине. – К.: Изд-во РИМП «София», 1993. – 228 с.
4. Попов, А.И. Изучение влияния антропогенных факторов на элементный состав и ресурсы лекарственных растений Кемеровской области и республики Тыва / А.И. Попов: дисс. … докт. фарм. наук. – М., 1995. – 945 с.
5. Попов, А.И. Пищевые и лекарственные, технические и декоративные растения на грядках Кузбасса / А.И. Попов, Ю.Н. Дементьев // Инновации – приоритетный путь развития АПК. Сборник матер. VIII-й Международной науч.-практ. конф. 19-22 окт. 2009. – Кемерово: КемГСХИ, 2009. – С. 121-123.
6. Попов, А.И. Фитодиететика и фитотерапия / А.И. Попов, Ю.Н. Дементьев // Вестник Кемеровского государственного сельскохозяйственного института. – Кемерово: ИИО КемГСХИ, 2011. – №4. – С. 176-179.
7. Попов, А.İ. Елементный склад ликарскоï рослинноï сировины як показник геохiмiчноï экологii рослинних органiзмiв / А.İ. Попов, В.А. Попков // Фармац. журн. (Киïв). – 1994. – №4. – С. 91-97.
УДК 615.322
|