Студента 2-го курса Нилова Дмитрия Константиновича Руководители: к Х. н., м н. с. Г. Г. Чилов д Х. н., проф. В. К. Швядас

Московский Государственный Университет им. М. В. Ломоносова Факультет Биоинженерии и Биоинформатики Реконструкция трехмерной структуры пенициллинамидазы из Providencia rettgeri самостоятельная научная работа студента 2-го курса Нилова Дмитрия Константиновича Руководители: к.х.н., м.н.с. Г. Г. Чилов д.х.н., проф. В. К. Швядас Москва, 2003 г. Содержание 1.Аннотация……………………………………………………………………… 2.Введение………………………………………………………………………... 3.Обзор литературы…………………………………………………………….. 3.1 Свойства пенициллинамидазы ………………………………………… 3.2 Первичная структура пенициллинамидазы …………………………. 3.3 Пространственная структура пенициллинамидазы………………… 3.4 Структура активного центра пенициллинамидазы…………………. 3.5 Механизм катализа………………………………………………………. 4. Постановка цели работы……………………………………………………. 5. Экспериментальная часть…………………………………………………... 6. Обсуждение результатов……………………………………………………. 6.1 Построение трехмерной четвертичной структуры пенициллинамидазы из Providencia rettgeri …………………………. 6.2 Оценка качества построенной трехмерной структуры……………... 6.3 Сравнение четвертичной структуры ПА из P.rettgeri c четвертичной структурой фермента из E.coli……………………….. 7.Выводы………………………………………………………………………… 8.Список литературы………………………………………………………...... 2 3 4 4 5 6 6 7 9 9 11 11 20 22 25 26 1. Аннотация Фермент пенициллинамидаза (ПА) из E.coli используется в синтезе антибиотиков. Поэтому изучение ПА из других организмов представляет научный и коммерческий интерес. В результате работы была построена четвертичная структура пенициллинамидазы из Providencia rettgeri по известной структуре фермента из Escherichia coli , оценено качество построенной модели и произведено сравнение 3D-структур пенициллинамидаз из P.rettgeri и E.coli . Было показано, что с помощью программы SWISS-MODEL можно построить достаточно качественную четвертичную структуру данного белка, исходя из его первичной структуры и известной четвертичной структуры ‘матрицы’. Отличие смоделированной структуры от экспериментальной (среднеквадратичное отклонение 1.3 Å) находилось в пределах ошибки эксперимента (2.5 Å по данным рентгеноструктурного анализа). Было установлено высокое сходство трехмерных структур пенициллинамидаз из P.rettgeri и E.coli, в особенности, сходство их активных центров, наводящее на предположение о схожей субстратной специфичности ферментов. 2. Введение Пенициллинамидаза (penicillin amidase, penicillin acylase, penicillin amidohydrolase) известна как фермент, используемый в производстве антибиотиков (рис.1). Научный интерес к ПА обусловлен уникальными каталитическими свойствами и механизмом катализа. На примере ПА из E.coli показано, что фермент обладает широкой субстратной специфичностью и может быть использован для решения задач тонкого органического синтеза. Сравнительное изучение ПА из разных организмов представляет значительный интерес, так как, с одной стороны, может дать важную информацию о неизвестном ранее механизме биокатализа, и, с другой стороны, выявить новые области практического использования этой группы ферментов. Рис. 1 : Фермент пенициллинамидаза катализирует синтез антибиотиков из активированных производных аминокислот и ядер антибиотиков. 3. Обзор литературы 3.1 Свойства пенициллинамидазы Пенициллинамидаза (ПА) относится к классу гидролаз, подклассу амидогидролаз (К.Ф.: 3.5.1.11) и известна в основном как катализатор гидролиза амидной связи в антибиотиках пенициллинового ряда,(рис.2). Рис. 2: Фермент пенициллинамидаза катализирует гидролиз амидной связи. Уникальность свойств ПА заключается в том, что они катализируют расщепление только одной, более стабильной из двух амидных связей пенициллина. Впервые ПА выделили в 50-х годах из грибов Penicillium chrysogenum и Aspergillus oryzae . В дальнейшем ее обнаружили у разных микроорганизмов. Ферменты из разных продуцентов отличаются не только по субстратной специфичности, но, вероятно, и по физиологической роли. Физиологическая роль ПА до настоящего времени точно не установлена. Существует несколько предположений: резистентность к пенициллинам, метаболизирование фенилуксусной кислоты (ФУК) в качестве единственного источника углерода и энергии, связь с белковым метаболизмом клетки. 3.2 Первичная структура пенициллинамидазы ПА из E.coli является одним из первых ферментов, для которых первичная структура была определена методом секвенирования гена и впоследствии хорошо изучен биосинтез. Зрелый фермент из E.coli- гетеродимер, состоящий из - и - цепей. Предшественник синтезируется как полипептид, состоящий из сигнального пептида, содержащего 26 аминокислот (а.к.), а также - и -субъединиц (209 а.к. и 557 а.к., соответственно), разделенных эндопептидом (54 а.к.). Сначала устраняется сигнальный пептид, после этого происходит расщепление предшественника на -субъединицу и -субъединицу, связанную с эндопептидом. Дальнейшее созревание активной ПА характеризуется последующим удалением эндопептида, в результате чего образуется зрелая -субъединица. При этом -субъединица сворачивается первой и действует как матрица для сворачивания -субъединицы [1], (Рис.3). Рис. 3: Созревание пенициллинамидазы. Предшественник состоит из сигнального пептида (sp) и А- и В-субъединиц, разделенных эндопептидом (ep). В процессе самосплайсинга удаляются сигнальный пептид и эндопептид. Зрелый белок состоит из А- и В-субъединиц. N-концевой серин В-цепи является каталитически активным остатком. До настоящего времени также определены первичные структуры методом секвенирования гена ПА из A.faecalis, K.citrophila, P.rettgeri, A.viscosus, B.megaterium и показано, что эти ферменты обладают высокой степенью гомологичности. Авторы сопоставили их аминокислотные последовательности и обнаружили много высококонсервативных участков на протяжении как -, так и -цепи ферментов, большинство из которых, если исходить из трехмерной структуры ПА из E.coli, находятся вблизи активного центра. Следует отметить, что N-концевой аминокислотный остаток -цепи всех рассмотренных ПА является серин (каталитически активный остаток). 3.3 Пространственная структура пенициллинамидазы Рентгеноструктурный анализ (РСА) ПА из E.coli был опубликован в 1995 году. Фермент имеет форму почки в поперечном сечении, с глубокой чашеобразной выемкой по центру. Гетеродимер имеет усредненные размеры 70x50x55Å и состоит из двух тесно переплетенных цепей (α- и β-субъединицы). Отдельные субъединицы не связаны ковалентно. Для проявления ферментативной активности ПА из E.coli и P.rettgeri обязательно необходимы обе субъединицы [2], (Рис.4) Рис. 4: Пространственная структура пенициллинамидазы. ПА состоит из двух цепей. А-субъединица обозначена красным цветом, В-субъединица- синим. 3.4 Структура активного центра пенициллинамидазы Участок связывания ацильной части субстрата образован многочисленными ароматическими структурами и гидрофобными боковыми радикалами аминокислот. При связывании ингибитора его фенилацетильная часть погружается в этот гидрофобный “карман”, а карбоксильная группа ориентируется к растворителю и близка к каталитическому сериновому остатку 1, расположенному в устье связывающего кармана [3, 4],(Рис.5). Связывание нуклеофила с ферментом недостаточно изучено. Рис. 5: Активный центр пенициллинамидазы из E. coli. Помеченные а.к. остатки участвуют в связывании фермента с субстратом (Arg145A, Phe146A, Ser1B, Gln23B, Phe24B, Ala69B, Phe241B, Arg263B). Ser1B является каталитически активным а.к. остатком. 3.5 Механизм катализа При взаимодействии пенициллинамидазы с субстратом (рис.6) кислород гидроксильной группы серина В1 образует связь с карбонильным углеродом субстрата. При этом а. к. остатки AlaB69 и AsnB241 стабилизируют отрицательный заряд на кислороде субстрата. Далее происходит отщепление амина и нуклеофильное присоединение воды, в результате которого образуется кислота [5]. Рис. 6: Механизм катализа гидролиза амидной связи. Пенициллинамидазы из разных источников в принципе отличаются по своим каталитическим свойствам. Поэтому можно ожидать, что отдельные ферменты этой группы могут быть использованы для решения различных задач. 4. Постановка цели работы Задача работы состояла в построении трехмерной четвертичной структуры пенициллинамидазы из Providencia rettgeri по известной структуре фермента из Escherichia coli, оценке качества построенной модели и сравнении 3D-структур пенициллинамидаз из P.rettgeri и E.coli. 5. Экспериментальная часть 1) Поиск белковых последовательностей пенициллинамидаз Белковые последовательности искались в FASTA-формате с помощью системы поиска SRS (http://www.srs.ebi.ac.uk) в банке spTrembl по видовому названию (последовательность ПА из P.rettgeri) и с помощью системы поиска Entrez в банке Swiss-Prot (http://www.ncbi.nlm.nih.gov) по К.Ф. 3.5.1.11-амидогидролазы (последовательность предшественника ПА из E.coli). 2) Поиск PDB-файлов пенициллинамидаз из E.coli PDB-файлы пенициллинамидаз из E.coli искались в банке PROTEIN DATA BANK (http://www.rcsb.org) в качестве предполагаемых матриц по К.Ф. 3.5.1.11. Брались также последовательности этих белков в FASTA-формате из PDB-файлов (опция Download Structures or SequencesFASTA format). 3) Выравнивание Парные выравнивания проводились на сервере GeneBee-Molecular Biology Server (http://www.belozersky.msu.ru) с помощью программы AliBee-Multiple alignment белковой последовательности предшественника из E. coli с каждым ферментом из E.coli из PROTEIN DATA BANK. 4) Построение трехмерной структуры Для построения трехмерной структуры использовался сервис SWISS-MODEL (http://swissmodel.expasy.org/), расположенный на сервере швейцарского института биоинформатики ExPASy Molecular Biology Server (http://www.expasy.org). Чтобы смоделировать белок, состоящий из двух субъединиц А и В (Oligomer modeling) был выбран режим Project mode. Для того, чтобы создать файл-project в программе Swiss-PdbViewer (http://kr.expasy.org/spdbv/) загружаются PDB-файл 1GK9 (c вырезанной информацией о гетероатомах) и последовательность ПА из P. rettgeri. Затем последовательность выравнивается с матрицей (Fit Raw Sequence). Выравнивание подправлялось вручную так, чтобы в последовательности матрицы не было делеций (Window Alignment). Таким образом был создан файл (Project.pdb: http://kodomo.cmm.msu.ru/~nilov), отправленный на сервер SWISS-MODEL. Полученный результат- трехмерная структура пенициллинамидазы из P. rettgeri (файл PA-from-P.rettgeri.pdb: http://kodomo.cmm.msu.ru/~nilov ). 5) Поиск PDB-файла пенициллинамидазы из P.rettgeri PDB-файл пенициллинамидазы из P.rettgeri (ID: 1CP9) искался в банке PROTEIN DATA BANK (http://www.rcsb.org) по К.Ф. 3.5.1.11. 6) Подсчет среднеквадратичного отклонения Среднеквадратичное отклонение (RMS) атомов построенной ПА от ПА из P.rettgeri из банка PROTEIN DATA BANK (ID: 1CP9) подсчитывалось с помощью программ Swiss-PdbViewer и g_rmsf. RMS для всех атомов и отдельно для С-альфа атомов подсчитывалось с помощью программы Swiss-PdbViewer. Для этого в программе загружаются файлы PA-from-P.rettgeri.pdb (с предварительно вырезанной информацией о матрице) и 1CP9.ent. Затем загруженные белки выравниваются (Magic Fit) и подсчитывается среднеквадратичное отклонение (Calculate RMS). RMS для каждого а.к. остатка подсчитывалось с помощью программы g_rmsf из пакета программ GROMACS 3.1.4 (http://www.gromacs.org). 7) Визуализация трехмерных структур Для визуализации трехмерных структур и создания рисунков использовалась программа VMD (Visual Molecular Dynamics) (http://www.ks.uiuc.edu/Research/vmd/). 6. Обсуждение результатов 6.1 Построение трехмерной четвертичной структуры пенициллинамидазы из Providencia rettgeri Пенициллинамидазы из P.rettgeri и E.coli обладают высокой степенью сходства, поэтому, зная трехмерную структуру фермента из E.coli, можно смоделировать по аналогии трехмерную четвертичную структуру ПА из P.rettgeri, исходя из известной первичной структуры этого белка (Рис.7, Accession number в банке SpTrEMBL: Q7WZI9). >ПА из Providencia rettgeri Сигнальный пептид: MKKHLISIAIVLSLSSLSLSSFS А-субъединица QSTQIKIERDNYGVPHIYANDTYSLFYGYGYAVAQDRLFQMEMAKRSTQGTVSEVFGKDYISFDKEIRNNYW PDSIHKQINQLPSQEQDILRGYADGMNAWIKQINTKPDDLMPKQFIDYDFLPSQWTSFDVAMIMVGTMANRF SDMNSEIDNLALLTALKDKYGEQLGVEFFNQINWLNNPNAPTTISSEEFTYSD SQKTKNIS Эндопептид: QLNQISDYRLTAPMFERTAKDTTGKVLALSSQENNALIAKQYEQSGANGLAGYPTT В-субъединица: SNVWLVGKTKASGAKAILLNGPQFGWFNPAYTYGIGLHGAGFNIVGNTPFAYPAILFGHNGHVSWGSTAGFG DGVDIFAEQVSPEDPNSYLHQGQWKKMLSRQETLNVKGEQPITFEIYRTVHGNVVKRDKTTHTAYSKARAW DGKELTSLMAWVKQGQAQNWQQWLDQAQNQALTINWYYADKDGNIGYVHTGHYPDRQINHDPRLPVSGT GEWDWKGIQPFANNPKVYNPKSGYIANWNNSPAKNYPASDLFAFLWGSADRVKEIDNRIEAYDKLTADDM WAILQQTSRVDLNHRLFTPFLTQATQGLPSNDNSVKLVSMLQQWDGINQLSSDGKHYIHPGSAILDIWLKEML KATLGQTVPAPFDKWYLASGYETTQEGPTGSLNISTGAKLLYESLLEDKSPISQSIDLFSGQPQNDVIRKTLNTT YQKMIEKYGDNPANWQTPATALTFRENNFFGIPQALPQENFHQNEYHNRGTENDLIVFTEEGVSAWDVVAPG QSGFISPQGKPSPHYQDQLSLYQQFGKKPLWLNSEDVAPYIESTETLIIER

Похожие:

	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Авторский коллектив: В. Г. Антонов, д э н., проф., О. Н. Громова д э н., проф., Г. Р. Латфуллин, д э н., проф., А. В. Райченко, д...		Основные направления научных работ кафедры Механическое активирование реакционных порошковых смесей как эффективный способ управления кинетикой процессов горения, спекания...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Проф. В. М. Гаврилов, проф. В. А. Голиченков, проф. Л. П. Корзун, проф. А. М. Рубцов, проф. Е. С. Лобакова, доц., к б н		Элективный курс 9 кл. Мир профессий Составитель курса Шааф О. В.,... Назначение документа – руководители спецкурсов, классные руководители, учителя, желающие вести элективный курс
	1 Теория свс, структурная макрокинетика, механизмы фазо- и структурообразования,... Механическое активирование реакционных порошковых смесей как эффективный способ управления кинетикой процессов горения, спекания...		Рабочая программа учебной дисциплины Российского государственного медицинского университета (ака­демик ран и рамн, проф. В. С. Савельев, проф. Ю. А. Нестеренко, проф....
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Дмитрия Донского, объяснить обстоятельства восхождения на княжение Дмитрия, познакомиться с его дальнейшей деятельностью. Также вы...		Программа дисциплины экономическая история Авторы: д и н., проф. Л. И. Бородкин и д э н., проф. С. К. Никитина (ответственные за выпуск), к э н., доц. Г. Д. Гловели, д э н.,...
	Информационный бюллетень московского онкологического общества. Издается... Президиум: проф. А. И. Пачес, проф. Г. А. Клясова, проф. Н. В. Дмитриева, к м н. К. Н. Мелкова		Студента 617 группы фртк давидюка Дмитрия Сергеевича Научный к т.... Поэтому, когда мы измеряем биологические потенциалы, мы видим результат синхронной деятельности совокупности клеток мозга, и эта...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Администрация оу, руководители музеев и комнат боевой славы, классные руководители		Вестник балтийской педагогической академии Доктор психол наук, проф. И. П. Волков; доктор мед наук, проф. Ю. А. Горяев, канд мед наук, доц. А. Н. Калягин, доктор мед наук,...
	Программа курса онтология теория познания” для специальности -522700... Цель изучения дисциплины: обучение студентов культуре мышления, общефилософским методам; формирование навыков саморефлексии, философского...		Программа курса «Сравнительные стратегические культуры» Программу курса разработала д ф н., проф кафедры сравнительной политологии Малинова О. Ю
	Программа дисциплины история экономических учений для направления... Авторы: проф. В. С. Автономов, проф. О. И. Ананьин, доц. Г. Д. Гловели, П. Н. Клюкин, проф. Н. А. Макашева		Всероссийская олимпиада школьников 2013-2014 г. Информация для учащихся и родителей ...