Роль мутаций гена KRAS при колоректальном раке.
И.А.Демидова
Московская городская онкологическая больница №62
Значение сигнального пути рецептора эпидермального фактора роста (EGFR)
Одной из причин опухолевой пролиферации является постоянная активация внутриклеточных сигнальных каскадов, функция которых заключается в передаче сигнала от ростовых факторов, соединяющихся с рецепторами, расположенными на клеточной мембране, к ядру [1]. Для опухолей эпидермального происхождения основное значение имеет путь, ведущий свое начало от рецептора эпидермального фактора роста, EGFR (epidermal growth factor receptor), принадлежащего к семейcтву HERs (human epidermal growth factor receptors). EGFR также называется HER1 или ERBB1. Последнее название рецептора относится к истории его открытия – его гомолог был выделен из вируса птичьего эритробластоза (avian viral erythroblastosis –v-erbB). Сигнальный каскад, стимулируемый EGFR, вовлечен в регуляцию практически всех функций клетки: роста, дифференцировки, пролиферации [2]. Схематически путь передачи сигнала изображен на рис. 1.
Рисунок 1. Сигнальные пути EGFR (по Laurent-Puig et al, JCO 2009)
Получая сигнал при присоединении лиганда (эпидермального фактора роста), рецептор димеризуется, возникший комплекс активируется за счет гидролиза присоединившейся молекулы ATP (АТФ), и передает сигнал нижележащим участникам каскада. В общих чертах можно выделить два основных сигнальных пути – ведущий к активации МАР-киназы через RAS и RAF и активирующий mTOR через PI3K и АКТ. Далее сигнал распространяется огромному количеству генов-партнеров, отвечающих за пролиферацию, дифференцировку, ингибирование апоптоза, способность клетки к миграции и т.д. [3]
Постоянная активация сигнального пути EGFR в опухолевых клетках может возникать по нескольким причинам. Во-первых, это может происходить в результате многократного увеличения количества рецепторов на мембране, вызванного амплификацией гена или усилением его экспрессии. Во-вторых – по причине возникновения мутаций в гене EGFR и приобретении рецептором способности к постоянной связи с энергетической молекулой, и, в-третьих, за счет мутаций в генах нижележащих участников каскада, что ведет к активации сигнального пути без участия EGFR.[4] Для колоректального рака характерны первый и третий пути активации.
Возможности блокирования сигнального пути EGFR
Так как активация каскада EGFR характерна для огромного количества опухолей эпидермальной природы, его блокада является весьма привлекательной точкой приложения для таргетных препаратов разного рода. В целом, можно выделить два основных подхода, получивших наибольшее распространение в настоящее время: один из них – использование моноклональных антител, блокирующих внеклеточную часть рецептора и препятствующих его связи с лигандом.[5] Два таких антитела, цетуксимаб и панитумумаб доказали свою исключительную селективность к EGFR в связи с чем получили наибольшее распространение. Второй подход – использование малых молекул (ингибиторов тирозинкиназ), имитирующих АТФ и имеющих высокое сродство к внутриклеточной киназной части рецепторов.[6] Соединяясь с этой частью рецептора, ингибиторы гефитиниб и эрлотиниб препятствуют его связи с АТФ и предотвращают дальнейшую передачу сигнала. Наиболее эффективны эти препараты при мутациях в киназной части гена EGFR, когда связь дефектного рецептора с АТФ хоть и постоянная, но существенно слабее, чем у рецептора дикого типа.
Моноклональные антитела, направленные против EGFR, показали свою высокую эффективность как при лечении первичных больных с метастатическим колоректальным раком, так и пациентов с приобретенной резистентностью к полихимиотерапии.[7, 8, 9, 10]. Однако при использовании этих препаратов в неселектированной группе пациентов ответ на лечение достигается лишь у части больных, не превышающей 25%. В связи с этим были предприняты поиски адекватных маркеров чувствительности опухоли к таргетной терапии. Проведенное молекулярное исследование образцов пациентов, участвовавших в двух наиболее репрезентативных исследованиях, OPUS и CRYSTAL, показало, что обнаружение активирующих мутаций в гене KRAS ассоциируется с отсутствием ответа на применение цетуксимаба (табл. 1).
Таблица 1. Зависимость ответа на применение цетуксимаба от статуса гена KRAS  
Полученные данные убедительно доказали необходимость проведения предварительного тестирования мутаций гена KRAS в образцах опухоли у пациентов, которым планируется проведение таргетной терапии цетуксимабом, что было отражено в рекомендациях ASCO.
«Всем пациентам с метастатическим колоректальным раком, которым планируется терапия таргетными препаратами, направленными против EGFR, должно проводиться тестирование на наличие мутаций гена KRAS в 12-м и 13-м кодонах. При обнаружении мутации терапия этими таргетными препаратами не показана»( ASCO Provisional Clinical Opinion Recommendations, 2008).
Функции гена KRAS и активирующие мутации 12-го и 13-го кодонов.
Семейство генов RAS (Retrovirus Associated DNA Sequences) включает 3 члена: KRAS, HRAS, NRAS. Первые два гена получили название от своих гомологов, выделенных из линий вирусов мышиной саркомы Kirsten и Harvey, последний был идентифицирован в клеточной линии нейробластомы. Три гена кодируют четыре варианта протеинов – два типа KRAS, А и В (наиболее часто распространенный), и по одному типу HRAS и NRAS. [11] Все они относятся к белкам, связывающим энергетическую молекулу GTP и участвующим в различных сигнальных каскадах. KRAS является центральным звеном одного из основных путей, активирующихся через рецептор EGFR, а именно – пути RAF- MEK-ERK-MAPK. Передача сигнала от рецептора к белку KRAS происходит при участии адапторных молекул (например, Grb2), привлекающих переносчиков GTP (белков из семейства SOS). Образующаяся связь KRAS с GTP активирует протеин и ведет к передаче сигнала как минимум по 10 каскадам, регулирующим транскрипцию огромного количества генов, участвующих во всех основных процессах жизни клетки. [12]
Соматические активирующие мутации гена KRAS относятся к часто встречающимся генетическим аномалиям при злокачественных новообразованиях. Особенно характерны такие мутации для опухолей поджелудочной железы, колоректального рака и немелкоклеточного рака легких (таблица 2).
Таблица 2. Частота встречаемости мутаций гена при опухолях различной локализации. (по E Vakiani и DB Solit, J Pathol 2011; 223: 219–229)
Локалзация опухоли
|
Мутации KRAS (%)
|
Желчные пути
|
31
|
Мочевой пузырь
|
4
|
Молочная железа
|
4
|
Шейка матки
|
7
|
Толстая кишка
|
33
|
Эндометрий
|
14
|
Печень
|
6
|
Легкое
|
17
|
Меланома
|
2
|
Яичники
|
14
|
Поджелудочная железа
|
58
|
Щитовидная железа
|
3
|
При колоректальном раке почти 90% всех нарушений представляют собой точечные замены одного нуклеотида на другой во втором экзоне гена, в последовательностях, кодирующих 12-ю и 13-ю аминокислоты. В норме в обеих позициях располагается глицин, единственная аминокислота, не имеющая боковой цепи. Любое изменение этой последовательности приводит к замене глицина на разветвленные аминокислоты, что ведет к нарушению пространственной конформации протеина. В результате этого блокируется способность специальных белков инактивировать комплекс KRAS с GTP путем гидролиза энергетической молекулы. Сигнал начинает передаваться от активированного KRAS к другим участникам каскада независимо от статуса EGFR.[12] Около 10% мутаций этой гена в колоректальных опухолях происходят в 3-м и 4-м экзонах, с одинаковой частотой в 61-м и 146-м кодонах и крайне редко – в 117-м кодоне. Мутации, затрагивающие 61-й кодон, нарушают водородные связи между KRAS и белками-инактиваторами, приводя к тому же эффекту, что и при нарушениях в 12-м и 13-м кодонах гена. Мутации 146-гокодона не сопровождаются существенными изменениями активности протеина, поэтому не рассматриваются, как влияющие на эффективность цетуксимаба. [13,14]. Тем не менее, в некоторых случаях эти мутации оказывают свое негативное воздействие в результате накопления дефектного белка на фоне аллельного дисбаланса - увеличения копийности мутантного гена или перехода его в гомозиготное состояние, что весьма характерно для опухолей с мутациями KRAS. [15].
Рисунок 2. Аллельный дисбаланс в опухолевых клетках (по Soh et al. Plos ONE 2009; 4(10)
Самые распространенные мутации 12-го и 13-го кодонов гена KRAS весьма разнообразны. В шести идущих подряд положениях, с 34-го по 39-е могут встречаться 13 различных видов замен. Наиболее частыми при колоректальном раке являются 7 мутаций, перечисленных ниже в табл. 3, причем 6 из них встречаются в 12-м кодоне.[16]
Таблица 3. Распределение мутаций в 12-м и 13-м кодонах гена KRAS при колоректальном раке (по J. Neumann et al. Pathol Res Pract 205 (2009) 858–862)
Предиктивное значение мутаций в 12-м и 13-м кодонах, возможно, неодинаково. Исследование, опубликованное De Roock и соавт. в 2010 году, показало, что в группе пациентов с метастатическим колоректальным раком, резистентных к химиотерапии, значимый эффект после применения цетуксимаба достигался не только у больных с диким типом гена KRAS, но и у пациентов, чья опухоль несла мутацию типа G13D.[17] Данные об общей выживаемости этих пациентов представлены на рис. 3. Косвенным подтверждением возможной чувствительности опухолевых клеток с мутацией G13D к цетуксимабу являются эксперименты с клеточными культурами, подтвердившие чувствительность таких клеток к антителам, направленным против EGFR in vitro. [18]. Тем не менее, ретроспективный характер исследования De Roock и соавт., небольшая группа больных в исследуемой группе и группе сравнения (32 человека) и отсутствие работ, воспроизводящих эти результаты на больших проспективных группах, заставляют относиться к полученным данным с осторожностью и не исключать мутацию типа G13D из списка негативных предикторов. Дополнительным подтверждением правильности такого подхода являются результаты, опубликованные группой Van Cutsem на 2012 Gastrointestinal Cancers Symposium, не подтвердившие улучшения выживаемости у пациентов с мутацией G13D, получавших панитумумаб.[19]
Рисунок 3. Результаты общей выживаемости больных с мутацией G13D, получавших лечение цетуксимабом (по De Rook W et al, JAMA 2010; 304:1812-1820)
Совпадение между мутантным статусом первичной опухоли и метастазов прослеживается в 95-100% случаев. Некоторые исследователи обнаруживают в ряде случаев отличия между статусом первичного поражения и отдаленных метастатических очагов, сопровождающиеся различным ответом на применение цетуксимаба, однако, эти находки не говорят об истинной гетерогенности опухоли. Как правило, этот феномен связан с эволюцией опухоли и проявлением эффекта аллельного дисбаланса, упомянутого выше. Тем не менее, исследование метастатических очагов в ряде случаев помогает установить истинный статус опухоли.[20]
Несмотря на то, что присутствие мутаций гена KRAS является чувствительным негативным предиктором ответа на терапию цетуксимабом, позитивное предиктивное значение этого маркера обладает недостаточной чувствительностью – только около 40% больных с диким типом гена отвечают на лечение. В связи с этим поиск дополнительных маркеров был продолжен и особое внимание уделено другим участникам каскадов, регулируемых EGFR, а именно генам BRAF, NRAS, PI3K.
Значение мутаций гена BRAF и других генов, участвующих в сигнальных каскадах EGFR.
Соматические мутации в гене BRAF возникают примерно в 8% всех злокачественных новообразований, причем более чем 90% этих нарушений представлено точечной мутацией в 600-м кодоне 15-го экзона, ведущей к замене валина на глютаминовую кислоту (V600E). [21]. Такая замена приводит к блокированию ингибирующего действия Р-петли протеина на активационный домен, что сопровождается постоянной передачей сигнала к другим участникам каскада MEK-ERK-MAPK. [22] Частота встречаемости мутаций гена BRAF при колоректальном раке составляет от 5 до 11 % по данным разных исследователей. Эти генетические нарушения ассоциируются с отсутствием ответа на терапию антителами, направленными против EGFR.[23, 24] Данные одного из исследований представлены на рис. 4.
Рисунок 4. Ответ на терапию цетуксимабом или панитумумабом в зависимости от мутационного статуса гена BRAF (по Di Nicolantonio et al, JCO 2008)
Значение мутаций других генов-участников сигнальных каскадов EGFR как предикторов чувствительности к цетуксимабу и панитумумабу изучено значительно меньше. Известно, что мутации гена NRAS, встречающиеся в 2-2,5% случаев колоректального рака, и мутации в 20-м экзоне гена PI3K (2,5-3% случаев) достоверно ассоциируются с плохим ответом на лечение блокирующими EGFR антителами. По данным исследования De Roock и соавт, количество больных с объективным ответом на терапию среди пациентов с мутациями NRAS составляло 7,7% против 38,1% среди пациентов с диким типом генов KRAS и NRAS. Больные с мутациями в 20-м экзоне гена PI3K вовсе не ответили на лечение, по сравнению с 36,8% ответивших среди пациентов с диким типом KRAS и PI3K. [25] Нарастание количества ответивших на лечение пациентов в процессе поэтапного тестирования отражено на рис..5.
Рисунок 5. Эффективность терапии цетуксимабом в зависимости от мутационного статуса генов KRAS, BRAF, NRAS, PI3K. (по De Roock et al, Lancet Oncology 2010, Vol 11, 753-762)
Ретроспективный характер исследований и малое количество наблюдений не позволяет пока сделать однозначные выводы, однако, становится совершенно очевидным, что молекулярное тестирование при колоректальном раке должно быть расширено. Такой подход позволит более эффективно применять таргетную терапию в целевой группе пациентов.
Литературные источники
Heldin CH, “Dimerization of cell surface receptors in signal transduction,” Cell 1995, vol. 80, no. 2, pp. 213–223,
Carpenterand G, Cohen S,“Epidermal growth factor,” J Biol Chem1 990, vol. 265, no. 14, pp. 7709–7712,
Citri A, Yarden Y, “EGF-ERBB signalling: towards the systems level,” Nature Rev Molecular Cell Biol 2006,vol.7,no. 7, pp. 505–516,
Hynes NE, Lane HA, “ERBB receptors and cancer: the complexity of targeted inhibitors,” Nature Rev Cancer 2005, vol. 5, no. 5, pp. 341–354,
Normanno N, Bianco C, De Luca A et al. “Target-based agents against ErbB receptors and their ligands: a novel approach to cancer treatment,” Endocr Rel Cancer 2003, vol. 10, no. 1, pp. 1–21,
Croce CM, “Oncogenes and cancer,” New Engl J Med 2008, vol. 358, no. 5, pp. 502–511,
Lenz HJ, Van Cutsem E, Khambata-Ford F et al. “Multicenter phase II and translational study of cetuximab in metastatic colorectal carcinoma refractory to irinotecan, oxaliplatin, and fluoropyrimidines,” J Clin Oncol 2006, vol. 24, no. 30, pp. 4914–4921,
Tabernero J, Van Cutsem E, Dıaz-Rubio E et al., “Phase II trial of cetuximab in combination with fluorouracil, leucovorin, and oxaliplatin in the first-line treatment of metastatic colorectal cancer,” J Clin Oncol 2007, vol. 25, no. 33, pp. 5225–5232,
Van Cutsem E, Nowacki M, Lang I et al., “Randomized phase III study of irinotecan and 5-FU/FA with or without cetuximab in the first-line treatment of patients with metastatic colorectal cancer (mCRC): the CRYSTAL trial,” J Clin Oncol 2007, vol. 25, no. 18, supplement, p. 164s,
Bokemeyer C , Bondarenko I, Makhson A et al., “Fluorouracil, leucovorin, and oxaliplatin with and without cetuximab in the first-line treatment of metastatic colorectal cancer,” J Clin Oncol 2009, vol. 27, no. 5, pp. 663–671,
Boguski MS, McCormick F. Proteins regulating Ras and its relatives. Nature 1993; 366: 643–654.
Vakiani E, Solit DB. KRAS and BRAF: drug targets and predictive biomarkers. J Pathol 2011; 223: 219–229
Edkins S, O’Meara S, Parker A, et al . Recurrent KRAS codon 146 mutations in human colorectal cancer. Cancer Biol Ther 2006; 5: 928–932.
Janakiraman M, Vakiani E, Zeng Z, et al . Genomic and biological characterization of exon 4 KRAS mutations in human cancer.Cancer Res 2010; 70: 5901–5911.
Soh J, Okumura N, Lockwood WW et al Oncogene mutations, copy number gains and mutant allele specific imbalance (MASI) frequently occur together in tumor cells.// PLoS One. - 2009 – 14, N4(10) – P.7464
Neumann J, Zeindl-Eberhart E, Kirchner T, Jung A. Frequency and type of KRAS mutations in routine diagnostic analysis of metastatic colorectal cancer. Pathol Res Pract 205 (2009) 858–862
De Roock W, Jonker DJ, Di Nicolantonio F, et al. Association of KRAS p.G13D mutation with outcome in patients with chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer treated with cetuximab. JAMA. 2010;304(16):1812-1820.
Guerrero S, Casanova I, Farre´ L, Mazo A, Capellà G, Mangues R. K-ras codon 12 mutation induces higher level of resistance to apoptosis and predisposition to anchorage-independent growth than codon 13 mutation or proto-oncogene overexpression. Cancer Res. 2000;60(23):6750-6756.
Peeters M, Douillard JY, Van Cutsem E, et al. Mutant (MT) KRAS codon 12 and 13 alleles in patients (pts) with metastatic colorectal cancer (mCRC): assessment as prognostic and predictive biomarkers of response to panitumumab (pmab). Program and abstracts of the 2012 Gastrointestinal Cancers Symposium; January 19-21, 2012; San Francisco, California. Abstract 383.
Sullivan K, Kozuch P. Impact of KRAS Mutations on Management of Colorectal Carcinoma. Pathol Res Intern 2011, 1-11
Davies H, Bignell GR, Cox C, et al. Mutations of the BRAF gene in human cancer. Nature 2002; 417: 949–954.
Wan PT, Garnet t MJ, Roe SM, et al. Mechanism of activation of the RAF–ERK signaling pathway by oncogenic mutations of B-RAF. Cell 2004; 116: 855–867.
DiNicolantonio F, Martini M, Molinarietal F,“Wild-type BRAF is required for response to panitumumab or cetuximab in metastatic colorectal cancer,” J Clin Oncol 2008,vol. 26, no. 35, pp. 5705–5712,
Laurent-Puig P, Cayre A, Manceauetal G,“Analysis of PTEN, BRAF, and EGFR status in determining benefit from cetuximab therapy in wild-type KRAS metastatic colon cancer,” J Clin Oncol 2009, vol. 27, no. 35, pp. 5924–5930,
De Roock W, Claes B, Bernasconi D et al., “Effects of KRAS, BRAF, NRAS, and PIK3CA mutations on the efficacy of cetuximab plus chemotherapy in chemotherapy-refractory metastatic colorectal cancer: a retrospective consortium analysis,” Lancet Oncol 2010, vol. 11, no. 8, pp. 753–762
Список сокращений: EGFR - epidermal growth factor receptor; HERs - human epidermal growth factor receptors; МАРК –mitogen-activated protein kinase; RAF –repidly accelerated fibrosarcoma; RAS – rat sarcoma; mTOR- mammalian (or mechanistic) target of rapamycin; PI3K – phosphatidylinositol 3-kinase; АКТ, also known as Protein Kinase B (PKB); GTP- guanosine triphosphate |
