КИНЕТИЧЕСКИЙ МЕТОД ОЦЕНКИ ЭФФЕКТИВНОСТИ
БИОЦИДНОГО ДЕЙСТВИЯ ХИМИЧЕСКИХ ВЕЩЕСТВ
Калинина И. Г., Гумаргалиева К. З.
Учреждение Российской академии наук Институт химической физики им. Н. Н. Семенова РАН, г. Москва (119991 ул. Косыгина, 4, т. (495) 939-7276, i_kalinina1950@mail.ru)
Для защиты материалов, применяемых в изделиях техники, от биообрастания, используют биоциды. Необходимые свойства биоцида – широкий спектр активности к различным микроскопическим грибам и бактериям, а также они должны ингибировать процессы коррозии металлов и старение полимеров, т.е. должны регулируемо управлять как процессом стабилизации так и деструкции материалов изделий различной природы. В настоящее время наиболее широко применяются методы оценки фунгицидной активности химических веществ, основанные на измерении скорости роста колоний грибов на агаризованных средах в присутствии этих веществ. Эти методы являются полуколичественными и субъективными, поскольку основываются на балльной оценке роста микроскопических грибов на материале, они не позволяют определить влияние биоцидов на различные стадии развития микроорганизмов. Так как биообрастание материалов развивается во времени, то кинетические методы исследования в наибольшей степени подходят для оценки эффективности биоцидов.
Целью настоящей работы было оценить действие различных химических веществ, как водорастворимых, так и водонерастворимых на рост колоний микроскопического гриба Aspergillus niger. В качестве подложки для роста колоний применяли синтезированный специально для этих целей гидрогель – трехмерносшитый полигидроксиэтилметакрилат следующего состава: мономер – гидрооксиэтилметакрилат – 32 об. %, инициатор полимеризации – перекись бензоила – 0,01г, сшивающий агент – дигидрооксиэтилметакрилат – 0,1 об. %, вода – 68 об. %. Пористая структура гидрогеля обеспечивает постоянный доступ питательных веществ к развивающимся на его поверхности микроорганизмам. Подложки из гидрогеля не повреждаются микроорганизмами и легко стерилизуются, что позволяет применять их многократно. Рост конидий Aspergillus niger оценивали гравиметрически – путем измерения биомассы и измерением среднего радиуса колоний. Кинетические кривые культивирования имеют S – образную форму и удовлетворительно описываются уравнением [1]:
m = m∞/(1+a∙exp(-bt)) (1)
Экспериментально показали, что параметр b практически не зависит от условий эксперимента и определяется природой питательной среды и видом микроорганизма. Следовательно, этот параметр может быть использован для оценки эффективности биоцидов. Для всех исследованных нами веществ зависимость продолжительности лаг – фазы (период индукции) от концентрации биоцида описывается уравнением :
Lc = LoeKLC , (2)
где Lo – длительность лаг – фазы в отсутствие биоцида, KL – константа, С – концентрация биоцида. Влияние биоцидов на микроорганизмы часто связывают с ингибированием протекающих ферментативных реакций в клетке и описывают уравнением [1]:
bL= boKc/(Kc + C) (3)
В координатах ln 1/Kc - ln KLэкспериментальные точки для исследованных биоцидов укладываются на прямую линию, что может использоваться для предсказания биоцидной активности веществ и предварительной оценки их концентрации в материале, которая необходима для надежной защиты изделий от биообрастания.
[1] Эмануэль Н.М. Кинетика экспериментальных опухолевых процессов. М: Наука, Москва, 1977, 416
АДАПТИВНОЕ ИЗМЕНЕНИЕ ЭКСПРЕССИИ ГЕНОВ
ГЛУТАТИОН-ЗАВИСИМЫХ ФЕРМЕНТОВ И ФЕРМЕНТОВ,
КОНТРОЛИРУЮЩИХ СИНТЕЗ ГЛУТАТИОНА, ПРИ
ФОРМИРОВАНИИ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К ДОКСОРУБИЦИНУ
Калинина Е.В.1, Чернов Н.Н.1, Березов Т.Т.1, Новичкова М.Д.1
Саприн А.Н.2
1Российский университет дружбы народов, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10; т. 434-35-05, elena.v.kalinina@gmail.ru
2Центр теоретических проблем физико-химической фармакологии РАН, Москва, ул. Косыгина, 4; т. 938-2533, e-mail: kevsan@orc.ru
Одним из наиболее значительных ограничений эффективности химиотерапии рака является развитие множественной лекарственной устойчивости. Среди ряда хорошо известных факторов, вызывающих развитие множественной лекарственной устойчивости свободнорадикальные механизмы остаются малоизученными, хотя действие химиотерапевтических агентов, обладающих прооксидантным эффектом, как правило, связано с развитием лекарственной резистентности опухолевых клеток. Результаты данной работе показывают существенные изменения в экспрессии генов, связанные с антиоксидантной защитой, при формировании резистентности опухолевых клеток эритролейкемии человека К562, аденокарциномы яичника человека SKOV-3, аденокарциномы молочной железы человека MCF-7 к доксорубицину (DOX), обладающему прооксидантным действием. Исходно имея разную чувствительность к цитотоксическому действию DOX при практически одинаковом уровне резистентности (1С50 - 4,0, 4,1, 4,5 мкг/мл для клеток K562/DOX, MCF-7/DOX, SKVLB, соответственно), исследуемые линии опухолевых клеток демонстрируют значительный рост экспрессии генов ключевых ферментов в синтезе GSH de novo - у-глутамилцистеинтрансферазы (y-GCS) и глутатионсинтетазы. У всех трех сублиний резистентных клеток установлен рост уровня мРНК как каталитической y-GCSH, так и регуляторной y-GCSL субъединиц y-GCS - скорость- лимитирующего фермента в синтезе GSH. Рост экспрессии генов y-GCSL и y-GCSH у всех трех исследуемых типов резистентных клеток скоординирован с ростом кспрессии гена глутатионсинтетазы, катализирующей образование GSH из у-глутамилцистеина и глицина, что создает оптимальные условия для синтеза GSH. Усиливает этот эффект рост экспрессии гена у-глутамилтрансферазы (y-GT), который отмечен как результат развития резистентности к DOX у всех трех клеточных линий. y-GT осуществляет транспорт у-глутамильных групп в клетку, а также поддерживает внутриклеточную концентрацию цистеина, которая наряду с уровнем активности y-GCS является фактором, лимитирующим синтез GSH. Кроме того, у всех трех исследуемых типов резистентных клеток обнаружен также рост экспрессии генов GSH-зависимых ферментов: изоформ глутатионтрансферазы (GSTP1-1, GSTA4-4), глутатионпероксидазы (GPxl, GPx4) и глутаредоксина (Grxl, Grx2), играющих существенную роль в клеточной антиоксидантной защите.
Таким образом, скоординированный рост экспрессии генов ключевых ферментов синтеза GSH de novo и генов GSH-зависимых ферментов, по-видимому, можно оценивать как важный механизм в развитии адаптивного антиоксидантного ответа на прооксидантное действие DOX, что является дополнительным фактором в формировании резистентности опухолевых клеток к этому противоопухолевому препарату.
ВОДОРАСТВОРИМЫЕ ПОЛИФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ
АНТИОКСИДАНТЫ:
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ НАПРАВЛЕНИЯ СИНТЕЗА
И БИОЛОГИЧЕСКАЯ АКТИВНОСТЬ
Кандалинцева Н.В., Просенко А.Е.
НИИ химии антиоксидантов
Новосибирского государственного педагогического университета
630126 Новосибирск, ул. Вилюйская, 28
Тел./факс (383) 2441856. E-mail: aquaphenol@mail.ru
Одним из приоритетных направлений поиска новых антиоксидантов для использования в биологии и медицине является создание гидрофильных гибридных соединений, содержащих в молекуле несколько антиоксидантно-активных центров, ингибирующих перекисное окисление липидов различными путями.
Из 2,6- и 2,4-диалкилфенолов (содержащих в качестве заместителей метильные, трет-бутильные, циклогексильные группы в различных сочетаниях) непосредственно или через промежуточный синтез аллил- и (или) галоидалкилзамещённых производных нами были синтезированы гидрофильные моно-, ди- и триалкилфенолы, включающие в свою структуру различные ионогенные группы (–SO3Na, –SSO3Na, –S(CH2)nCOONa(K), –Sе(CH2)nCOONa(K), –SC(NH2)2Hlg, –SC(NHMe)2Hlg, –NH3+Hlg–, –NH2Alk+Hlg–, –NHAlk2+Hlg–, –NAlk3+Hlg–, –P(Ph)3+Hlg–, –ОР(О)(Н)ОNa).
Введение сера-, селен-, азот-, фосфорсодержащих ионогенных фрагментов в молекулу алкилфенолов привело к получению водорастворимых антиоксидантов, обладающих в отличие от классических фенольных ингибиторов дополнительно способностью восстанавливать предшественники активных радикалов – липопероксиды, что существенно повышает их антиокислительную активность in vitro и in vivo.
Синтез большого числа соединений с незначительными вариациями в структуре и системное сравнительное исследование их противоокислительной и биологической активности позволили выявить закономерности «структура – свойство», которые были с успехом использованы при создании структур эффективных водорастворимых антиоксидантов.
Впервые для гидрофильных фенольных антиоксидантов проведено исследование зависимости степени выраженности токсических свойств от строения в отношении бактериальных культур и лабораторных животных. Установлено, что в отличие от липофильных алкилфенолов, в рядах их гидрофильных аналогов токсичность снижается при уменьшении степени пространственного экранирования фенольного гидроксила.
По данным исследований, проведенных в НИИ терапии СО РАМН, НИИ клинической иммунологии СО РАМН, НИИ молекулярной биологии и биофизики СО РАМН, НЦ клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, ряд синтезированных соединений проявляют низкую токсичность в сочетании с выраженной биологической активностью и могут найти применение в качестве гепато-, кардиопротекторных, противовоспалительных и иммуностимулирующих средств.
ОСОБЕННОСТИ ПЕРЕКИСЕОБРАЗОВАНИЯ В МЕМБРАНАХ ЭЛЕМЕНТОВ КРОВИ БОЛЬНЫХ С ЛЕКАРСТВЕННО УСТОЙЧИВЫМ ТУБЕРКУЛЕЗОМ И ЭФФЕКТЫ КАЛЬЦИЕВОГО ПРЕЦИПИТАТА ДС-РНК НА ЭТОМ ФОНЕ
Карагезян К.Г.1, Сафарян М.Д.2, Овакимян С.С.1, Амирханян О.М.1, Овакимян Сур.С.1, Карагезян М.К.3, Мамиконян В.Х.1, Арутюнян Д.А.1
1Научно-технологический Центр органической и фармацевтической химии НАН РА, Ереван, kkarageuzyan@mail.ru
2Республиканский противотуберкулезный диспансер МЗ РА
3Российско-армянский (славянский) университет
Ранее проведенные исследования установили высокий уровень терапевтической эффективности дрожжевой низкомолекулярной двуспиральной РНК (дс-РНК), послуживший основанием для синтеза армянскими учеными ее более активной разновидности в виде кальциевого преципитата (Са2+-дс-РНК). Последний оказался несравненно более результативным при лекарственно устойчивом туберкулезе (ЛУТ), что было показано на многочисленных биологических объектах в эксперименте. Причастность указанного соединения к иммунитет стимулирующим механизмам проявилось в его роли как индуктора интерферона и активатора процесса образования лизофосфатидилхолинов (ЛФХ). Изучение особенностей качественно-количественных нарушений процессов деацилирования фосфатидилхолинов (ФХ) в мембранах эритроцитов (МЭ) и лимфоцитов (МЛ) больных с ЛУТ установило их высокий уровень с образованием значительных концентраций ЛФХ и свободных жирных кислот. Вовлечение последних в реакции свободнорадикального окисления (СРО) сопровождалось образованием большого количества липидных перекисей различных категорий и конечного продукта переокисления их - малонового диальдегида (МДА).
По данным ВОЗ ЛУТ занимает одно из главенствующих положений среди многих патологических состояний организма, сопровождаясь расстройствами его генетического аппарата и приобретенной устойчивостью к лекарственным препаратам специфического действия. Проявляющееся при этом состояние оксидативного стресса характеризуется высоким уровнем в МЭ и МЛ МДА и ЛФХ, известных своим мембранотоксическим мембранолитическим действием. Инкубирование МЭ и МЛ в буферной среде (370С, рН-7,4) в присутствии сверхнизких концентраций Са2+-дс-РНК сопровождается картиной его ярко выраженного антиоксидантного действия, обусловленного нормализацией уровня МДА и тенденцией к упорядочению количественного содержания ЛФХ.
Упорно поддерживаемая при этом под действием Са2+-дс-РНК сравнительно высокая концентрация ЛФХ в изученных биологических объектах заслуживает особого внимания. Последнее созвучно результатам обсуждений на годичной сессии Нью-Йоркской АН 2000г, посвященных особенностям регуляторной роли лизопроизводных фосфолипидов и главным образом ЛФХ в формировании молекулярно-биологических и биохимических преобразований на клеточном, субклеточном, мембранном, тканевом и общеорганизменном уровнях в норме и патологии.
ПОВРЕЖДЕНИЯ ДНК IN VIVO ПОД ВОЗДЕЙСТВИЕМ
ДОЛГОЖИВУЩИХ РАДИКАЛОВ БЕЛКА И ИХ НЕЙТРАЛИЗАЦИЯ ПРИРОДНЫМИ БИОАНТИОКСИДАНТАМИ
Карп О.Э., Гудков С.В., Брусков В.И.
Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, г. Пущино, 142290, Московская область, г.Пущино, ул. Институтская, 3, (4967)739497, olgakarp1@rambler.ru)
Окислительный стресс, возникающий в клетках живого организма под воздействием ионизирующего излучения, приводит к образованию долгоживущих радикалов белка (ДЖРБ) с временем полужизни, достигающим 20 и более часов. Показано, что ДЖБР являются источниками образования активных форм кислорода, продолжительного протекания окислительного стресса и посредниками в переносе окислительных повреждений на другие молекулы, включая ДНК. В данной работе показана способность ДЖРБ, индуцироваанных рентгеновским излучением, вызывать повреждения в ДНК in vivo в организме крыс и мышей. С помощью метода микроядерный тест определяли количество полихроматофильных эритроцитов, содержащих микроядра в костном мозге животных. Исследовано влияние облученного в дозе 100 Гр крысиного сывороточного альбумина при внутривенном введении его самцам крыс. Введение облученного белка (1 мкг/г) приводит к увеличению количества полихроматофильных эритроцитов, содержащих микроядра, в 2,5 раза по сравнению с контролем. При скармливании в течение суток мышам обезжиренного и обезвоженного творога, облученного в дозе 100 Гр, в красном костном мозге происходит увеличение числа полихроматофильных эритроцитов с микроядрами, эквивалентное их количеству, образующемуся при тотальном облучении животных в дозе близкой к 0,2 Гр. Этот факт свидетельствует о способности долгоживущих радикалов белка сохранять свой окислительный потенциал и при переваривании пищи. При одновременном скармливании белка и приеме с питьевой водой в течение суток в качестве природных антиоксидантов 5 мМ растворов инозина, L-триптофана, L-метионина и витамина С не наблюдалось увеличения величины цитогенетических повреждений ДНК относительно интактных животных. Таким образом, установлено, что облученные белки способны приводить к повреждению структуры ДНК in vivo и показана возможность нейтрализации генотоксических повреждений ДНК с помощью некоторых природных биоантиоксидантов.
Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований (10-04-00949-а; 10-04-00800-а) и Президента Российской Федерации для поддержки молодых российских ученых (МК-108.2010.4).
ЭКДИСТЕРОИДСОДЕРЖАЩЕ РАСТЕНИЕ STEMMAKANTHA
SERRATULOIDES И ЕГО АДАПТАЦИЯ К УСЛОВИЯМ
ПРОИЗРАСТАНИЯ
Касимова Д.И., Хайбуллина Ф.З.
Башкирский государственный университет, г. Уфа, ул. Заки Валиди, 32, 450074, sulfirar@mail.ru
Stemmakantha serratuloides - стеммаканта серпуховидная – многолетнее растение, произрастающее на юге Западной Сибири, севере Средней Азии на солончаках и солонцеватых лугах. Является редким видом, включен в список Красных книг ряда районов (Сибирь, Алтай, Курган и др.). В «Красную книгу Республики Башкортостан» (2001) включен с категорией редкости 2 – уязвимый вид. В пределах республики встречается в юго-восточном районе Башкирского Зауралья на солонцах и солонцеватых лугах с хлоридно-сульфатным и сульфатным типом засоления. Cтеммаканта содержит экдистероиды, обладающие анаболической, адаптогенной, тонизирующей, антиоксидантной активностью. . Если Stemmakantha cartamoides – маралий корень как экдистероидсодержащее растение хорощо изучен и на основе выделенного из корневища 20-гидроксиэдизона (20 Е) был создан тонизирующий препарат «экдистен», то для стеммаканты серпуховидной также содержащей эти соединения, роль их пока неясна. Известно, что по сравнению с маральим корнем Stemmakantha serratuloides (рапонтикум серпуховидный) характеризуется более высоким содержанием экдистероидов, в то же время вид крайне редок и практически не изучен, сведения имеющиеся в литературе, скудны. Нами изучалась биология семян и начальные этапы онтогенеза Stemmakantha serratuloides. В семенах 2006г. – 2007 г. сбора в Хайбуллинском районе Республики Башкортостан определяли степень набухания, жизнеспособность, энергию прорастания и влияние на нее скарификации, стратификации, регуляторов роста, а также окислительные процессы в растениях первой вегетации по содержанию МДА (малонового диальдегида). Разнокачественные семена стеммаканты (по цвету семенной оболочки и по степени зрелости - черные, коричневые, желтые) различались степенью поглощения воды: 1,4% от сухой массы для черных, 53% для коричневых и 65% для желтых. Жизнеспособными в основном были семена с черной и коричневой окраской семенной кожуры. Поступлению воды в семена и ускорению прорастания до 50% способствовали их скарификация, продолжительная стратификация до 75-125 дней при температуру 4 С, а также обработка СК (салициловой кислотой 10 мг/л). По интенсивности протекания перикисного окисления липидов в различных органах можно оценивать неспецифические адаптационные возможности организма. Малоновый диальдегид (МДА) является своего рода «маркером» ускорения перекисного окисления. В наших опытах выявлены различия в его содержании у растений St. serratuloides, отличающихся по возрасту и условиям выращивания. Наибольшим содержанием МДА отличались семядоли проростков из стратифицированных семян, оставшихся расти в песке, а наименьшее выявлено в первом листе молодых растений из стратификацированных семян, но пересаженных в почву. У растений, произрастающих на их родной солонцовой почве, выявлено низкое содержание МДА в самом молодом листе, что, вероятно связано с адаптированностью к этой почве. |
