Тихонова дина Валерьевна разработка метода верификации диагноза бластоцистоза при диарее неясной этиологии
Скачать 333.31 Kb.
|
| На правах рукописи ТИХОНОВА Дина Валерьевна РАЗРАБОТКА МЕТОДА ВЕРИФИКАЦИИ ДИАГНОЗА БЛАСТОЦИСТОЗА ПРИ ДИАРЕЕ НЕЯСНОЙ ЭТИОЛОГИИ 03.02.11 - паразитология АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва – 2013 Работа выполнена в государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации Научный руководитель: кандидат медицинских наук, доцент Морозов Евгений Николаевич Официальные оппоненты: Тумольская Нелли Игнатьевна доктор медицинских наук, профессор Научно-исследовательский Институт медицинской паразитологии и тропической медицины им. Е.И. Марциновского ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации, заведующая лабораторией разработки методов лечения паразитарных болезней Козлов Сергей Сергеевич доктор медицинских наук, профессор ФГКВОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М.Кирова» Министерства обороны Российской Федерации, профессор кафедры инфекционных болезней (с курсом медицинской паразитологии и тропических заболеваний) Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Российский университет дружбы народов» Министерства образования и науки Российской Федерации Защита состоится______ июня 2013 года в ____часов на заседании диссертационного совета Д208.040.12 ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (119991, г. Москва, ул. Трубецкая д. 8, стр. 2) С диссертацией можно ознакомиться в ГНЦМБ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (117997, г. Москва, Нахимовский пр-т, д. 49) Автореферат разослан « ___» _________ 2013 года Ученый секретарь Диссертационного совета Фролова Александра Александровна ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность исследования. Blastocystis hominis – полиморфный паразит кишечника человека и животных. Он вызывает интерес не только с точки зрения дифференциальной диагностики простейших кишечника, но и с точки зрения недостаточно установленной патогенной роли [Сергиев В.П. и др., 2008; Cekin A.H. et аl. 2012]. Длительное время считалось, что бластоцисты принадлежат к дрожжам, в дальнейшем на основании данных электронной микроскопии в 1967 году C.H. Zierdt отнес их к типу Рrotozoa и получил первые указания на возможную этиологическую роль этих простейших в возникновении кишечной патологии у лиц с иммунной недостаточностью [Garavelli P.L., 1996]. В последние годы выявлены высокие показатели зараженности B. hominis у различных групп населения [Державина Т.Ю. и др., 2011]. На протяжении нескольких лет ведется изучение биологии паразита [Garavelli P.L. et аl., 1996; Tan K.S.W. et аl., 2002]. В настоящее время имеется достаточное число эпидемиологических и клинических материалов, а также лабораторных данных, подтверждающих как потенциальную, так и реальную этиологическую роль В. hominis в патологии человека, развивающейся на фоне снижения резистентности макроорганизма [de Silva et al. 1997; Dagci H. et аl. 2002; Ласкин А.В. 2006]. По мнению Г.Г. Онищенко в группе «другие протозойные болезни» наиболее часто встречаемым паразитозом является бластоцистоз. На большинстве территорий Российской Федерации не проводится расшифровка острых кишечных инфекций неясной этиологии, которые могут быть вызваны инвазией бластоцист [Онищенко Г.Г., 2006]. В литературе имеются данные о наличии кожных высыпаний у больных при выявлении у них кишечных паразитов [Hameed D.M et аl., 2011]. R. Gupta и K. Parsi [2006] рекомендуют всем больным хронической идиопатической крапивницей, имеющим в анамнезе эпизоды диареи, проводить культуральное или микроскопическое исследования кала с целью возможного выявления бластоцист, как фактора, утяжеляющего течение основного заболевания. Существуют работы, подтверждающие возможную роль B. hominis в этиологии синдрома раздраженного кишечника (СРК). Однако только присутствие B. hominis в кишечнике у лиц с СРК не ассоциируется с его повреждением, что подтверждено эндоскопическим обследованием этих пациентов. Поэтому все большее внимание исследователей привлекает определение факторов, которые могут быть связаны с клиническим проявлением болезни у носителей бластоцист [Yakoob J. et аl. 2004; 2010]. По данным разных источников при исследовании фекалий больных ВИЧ/СПИДом микроскопическим методом в 45,6% обнаруживаются кишечные паразиты, в том числе B. hominis – от 2,2% до 2,5%, что указывает на необходимость паразитологического исследования фекалий у больных СПИД-ом и наблюдения за консистенцией стула [Kurniawan A. et аl. 2009; Saksirisampant W. et аl. 2009]. В постановке диагноза бластоцистоза ведущую роль играет обнаружение бластоцист в кале микроскопическим и культуральным методом. Однако диагностика бластоцистоза затруднена обилием различных морфологических форм бластоцист [Stensvold R. et аl. 2006; Смирнова М.О. и др. 2010]. В качестве альтернативных и наиболее перспективных методов обнаружения B. hominis рассматриваются амплификационные методы, в частности, полимеразная цепная реакция [Stensvold R. et аl. 2006; Parkar U. et аl. 2007]. Для детекции возбудителей таких паразитарных болезней как малярия, лейшманиозы, токсоплазмоз, дирофиляриоз активно применяют ПЦР, однако, для определения бластоцист в клиническом материале (фекалии) на территории РФ не существует отечественных тест-систем. Приведенные литературные данные свидетельствуют о том, что изучение проблемы бластоцистоза и разработки методов лечения этой инвазии в значительной степени сдерживается отсутствием эффективных стандартизованных методов лабораторной диагностики этой нозоформы. Цель исследования. Разработка оригинальных праймеров для верификации Blastocystis spp. в клиническом материале на основе метода ПЦР и их апробация, а также изучение клинических особенностей диарейного синдрома у лиц с бластоцистной инвазией. Задачи исследования.
Научная новизна исследования. Впервые в России разработаны и апробированы праймеры, перспективные для разработки отечественной тест-системы с целью идентификации ДНК бластоцист в клиническом материале (фекалии), в том числе оптимизированы температурные режимы амплификации, определены параметры применения метода ПЦР, подобрана методика выделения ДНК бластоцист. Уточнена частота встречаемости бластоцист у больных с диарейным синдромом и у лиц из группы «декретированные контингенты», жителей Москвы и Московской области, определен симптомокомплекс для проведения целенаправленного паразитологического обследования больных с диарейным синдромом. Установлено, что обнаружение генома бластоцист молекулярно-биологическим методом в испражнениях больных с диарейным синдромом не уступает микроскопическим методам исследования. В случаях низкой численности бластоцист в исследуемом материале, он может служить дополнительным методом исследования. Практическая значимость. Оптимизированный молекулярно-биологический метод подтверждения бластоцистной инвазии кишечника больных с диарейным синдромом рекомендуется для практического использования при популяционных обследованиях организованных мигрантов из эндемичных стран, при расследовании вспышек ОКИ на предприятиях общественного питания, благодаря высокой чувствительности, специфичности и быстроте получения результата. Личное участие автора в получении результатов. Автор принимал непосредственное участие в клиническом обследовании 414 пациентов, лично проводил лабораторную подготовку 231 пробы и исследовал их методом ПЦР, организовал проведение лабораторных и инструментальных исследований. Диссертантом выполнена статистическая обработка и обобщение полученных результатов. Основные положения, выносимые на защиту.
Внедрение результатов исследования в практику. Полученные результаты внедрены в диагностических целях при консультации пациентов в отделении медицинской паразитологии КДЦ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова; используются в научно-педагогической работе на кафедре тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова для подготовки студентов лечебного и медико-профилактического факультетов; в работе специализированной клинико-диагностической лаборатории по паразитарным болезням КЦ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова. Апробация работы. Материалы диссертационной работы были доложены на X съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Инфекция и иммунитет» (Москва, апрель 2012 г.) и на заседании кафедры тропической медицины и паразитарных болезней МПФ Первый МГМУ им. И.М. Сеченова. Диссертация была представлена и обсуждена на заседании специализированной комиссии в Научно-исследовательском Институте медицинской паразитологии и тропической медицины имени Е.И. Марциновского Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (протокол № 2 от 19 марта 2013). По результатам диссертации опубликовано 5 научных работ в журналах, в том числе 2 статьи в журналах, входящих в перечень ВАК. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 109 страницах машинописного текста и состоит из введения, 5 глав, заключения, выводов, практических рекомендаций, приложения и списка литературы. Последний содержит 167 публикаций, из которых 94 отечественных и 73 зарубежных. Работа иллюстрирована 17 рисунками и 15 таблицами, приведено 2 клинических примера. СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ Материалы и методы исследования. Сбор клинического материала производился на базе отделения медицинской паразитологии и тропической медицины КДЦ ГБОУ ВПО Первый МГМУ им. И. М. Сеченова. Поскольку сходная клиническая картина с диарейным синдромом может быть вызвана различными гельминтозами и протозоозами, сбор клинического материала (кал) был проведен у всех пациентов, обратившихся в отделение медицинской паразитологии и тропической медицины КДЦ ГБОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова. Для апробации праймеров, идентифицирующих Blastocystis spp. методом классической ПЦР, было исследовано 77 проб клинического материала больных, страдающих диареей на момент обращения или имеющих эпизоды диареи в анамнезе. Для выяснения клинических особенностей течения бластоцистной инвазии было проведено клинико-лабораторное обследование 414 человек: 337 сотрудников клиники акушерства и гинекологии им. В.Ф.Снегирева Первый МГМУ им. И.М. Сеченова, проходивших диспансеризацию и не предъявляющих жалоб, и 77 больных, обратившихся в отделение медицинской паразитологии и тропической медицины с жалобами на неустойчивый стул, боли в животе различной локализации, появление полиморфных высыпаний на коже туловища и конечностей и/или кожный зуд в местах высыпаний. Для определения особенностей клинического течения диарейного синдрома, ассоциированного с Blastocystis spp., были сформированы 3 группы наблюдения. В первую группу вошли 45 больных с диарейным синдромом, у которых при лабораторном обследовании, в том числе методом ПЦР, в испражнениях выявляли бластоцисты. Вторую группу составили больные с диарейным синдромом, у которых при лабораторном обследовании не обнаружена паразитарная инвазия (32 человека). Третью группу (31 человек) составили пациенты, носители бластоцист, не предъявлявшие жалоб (контрольная группа). Всем пациентам проводили клинические исследования, включавшие оценку выраженности основных проявлений болезни, характера стула и наличия в нем патологических примесей, клинический и биохимический анализы крови. Микроскопическое исследование кала на наличие яиц гельминтов, личинок, простейших, в том числе бластоцист проводили методом эфир-формалинового обогащения по стандартной методике [МУК 4.2.735-99]. Клинический материал от пациентов, обратившихся в отделение медицинской паразитологии и тропической медицины (пробы фекалий) отбирали для исследования в стерильные пластиковые контейнеры. Клинический материал доставляли в КДЛ не позднее 6 часов после дефекации. До проведения исследования ПЦР пробы хранили при температуре -20°С не более 30 дней. Для проведения ПЦР в качестве метода предобработки клинического материала готовили фекальную суспензию (при водянистой консистенции кала суспензию не готовили). ДНК Blastocystis spp. выделяли из 100 мкл пробы. Для составления реакционной смеси для ПЦР использовали набор реагентов Gen Pak PCR – Core, произведенный компанией «Биоком», Россия (состав: PCR Master Mix, PCR Diluent, PCR Oil). Регистрация результатов полимеразной цепной реакции осуществлялась разделением продуктов амплификации методом горизонтального электрофореза в 1% агарозном геле с добавлением бромистого эдития 0,5 мкг/мл. Статистическая обработка результатов исследования были выполнены по программе Statistica Miicrosoft Wordfor Windows, Excel-2000, BioStatс использованием методов вычисления среднеарифметических показателей, стандартной ошибки средней и интервала доверительных границ (95%). Достоверность различий непараметрических показателей определяли по χ2 [Кучеренко В.З., 2007]. |
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Методическая разработка по внедрению проектного метода на уроках географии Данная методическая разработка предполагает проведение уроков по дисциплине География с использованием элементов проектного метода... | | Разработка и исследование методов определения видимости полигонов... Целью диссертации является разработка метода, который бы позволил отрисовывать сцены, геометрическая сложность которых, в настоящее... |
| Доклад ронжина Андрея Леонидовича по диссертационной работе «Разработка... «Разработка адаптивного метода робастного понимания слитной речи на основе интегральной обработки данных», представленной на соискание... |  | Разработка проекта по литературе с применением метода сравнительно-типологического... Традиционная для 11 класса тема «Основные темы и идеи литературы Русского Зарубежья» может быть изучена на основе метода проектов.... |
| Заболевания химической этиологии, развивающиеся при, как правило,... Острые отравления заболевания химической этиологии, развивающиеся при, как правило, однократном попадании в организм человека химических... | | Разработка урока алгебры в 9 классе Тема урока: Стандартный вид числа Учебник Ш. А. Алимов, Ю. М. Калягин, Ю. В. Сидоров, Н. Е. Фёдорова, М. И. Шабунин. Алгебра, 9 класс. Под научным руководством академика... |
| Методическое пособие для студентов старших курсов, интернов, ординаторов и практикующих врачей Ания больных с заболеваниями лёгких, плевры; умение трактовать результаты обследования этих больных с учётом данных инструментальных... | | Реферат Разработка метода оценки физического состояния спортсменов... Разработка метода оценки физического состояния спортсменов с использованием биолюминесцентной системы светящихся бактерий |
| Методическая разработка практического занятия по теме: «Кардиомиопатии»... Цель занятия: освоение навыков постановки диагноза и тактики ведения пациентов с кардиомиопатиями (целенаправленный сбор анамнеза,... | | Методическая разработка практического занятия по теме: «Дерматомиозит»... Цель занятия: освоение навыков постановки диагноза и тактики ведения пациентов с дерматомиозитом (целенаправленный сбор анамнеза,... |
| Методическая разработка практического занятия по теме: «лекарственная... Цель занятия: освоение навыков постановки диагноза и тактики ведения пациентов с лекарственной болезнью (целенаправленный сбор анамнеза,... | | Рабочая программа по физике (предмет) 8 «В»класс умк перышкин А. В. под редакцией Тихонова Е. Н Подчеркнем, что ознакомление школьников с методами научного познания предполагается проводить при изучении всех разделов курса физики,... |
| Список работ д ф. м наук В. Л. Бычкова Авилова И. В., Бычков В. Л.,... Авилова И. В., Бычков В. Л., Касьянов В. А., Подлубный Л. И. Расчет вероятностей радиационных процессов при помощи метода модельного... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... «аптеку» для использования ее в качестве средства первой доврачебной помощи при острых простудных заболеваниях и при некоторых хронических... |
| Тема: “ Системы 2-х, 3-х линейных уравнений Г.), теории электричества и магнетизма, геодезии (разработка метода наименьших квадратов) и мн разделов астрономии | | Реферат тема: "Язвенные гастродуоденальные кровотечения" Цель исследования: изучение этиологии, патогенеза, клиники, диагностики и особенностей хирургической тактики при язвенных гастродуоденальных... |
