Тихонова дина Валерьевна разработка метода верификации диагноза бластоцистоза при диарее неясной этиологии

Результаты исследования и их обсуждение Подбор праймеров и оптимизация параметров реакции амплификации Успех разработки ПЦР во многом зависит от правильного подбора праймеров. На основании литературных данных о нуклеотидной последовательности Blastocystis spp. и наших исследований были подобраны праймеры для диагностики ДНК бластоцист. Сравнение нуклеотидных последовательностей, анализ молекулярной структуры праймеров проводили с использованием компьютерной программы DNASIS, а выбор праймеров производился с помощью программы «OLIGO» (проверяли на образование димеров, шпилек и других вторичных структур). С помощью данных генетической информации, представленных в Gen Bank NCBI (National Centerfor Biotechnology Information), выбранные праймеры проверялись на гомологичность и отсутствие перекрестных реакций. Определение степени гомологии нуклеотидных последовательностей проводили в доступных базах данных в режиме on-line с использованием Basic Local Alignment Search Tool (BLASTn) на web-cepвepe Национального Центра Биотехнологической Информации (NCBI) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/. Нуклеотидная последовательность прямых и обратных праймеров, подобранных для детекции бластоцист методом ПЦР, представлена в таблице 1. Таблица 1. Нуклеотидная последовательность прямых и обратных праймеров для детекции Blastocystis spp. Условное наимено-вание праймера Олигонуклеотидная последовательность праймера Размер амплифици-рованного фрагмента f Bh 1 5'– GGAATCCTCTTAGAGGGACACTATACAT –3' 310 r Bh 1 5'– TTACTAAAATCCAAAGTGTTCATCGGAC – 3' 310 f Bh 2 5'– GGAGGTAGTGACAATAAATC – 3' 585 r Bh 2 5' –TAAGACTACGAGGGTATCTA –3' 585 По данным Национального Центра Биотехнологической Информации отобранные нами праймеры Bh1 и Bh2 являются комплементарными разным участкам 18 S гена рибосомального кластера, который кодирует малую субъединицу рРНК у бластоцист. Условия и режимы проведения реакции были отработаны экспериментально. Одним из критериев подбора праймеров являлась температура отжига с соответствующими матрицами. При определении оптимальной температуры отжига было апробировано несколько температурных режимов для исследуемых праймеров в диапазоне 53 - 60°С с интервалом 1°С для праймеров системы Bh1, а для Bh 2 от 56°С до 70°С, а также с интервалом 1°С. Понижение температуры отжига приводило к наработке неспецифичных продуктов, а её повышение сопровождалось изменением чувствительности реакции. В результате опытов была установлена оптимальная температура отжига праймеров, которая обеспечивала синтез специфичных фрагментов. Наибольший выход продукта амплификации наблюдали при 60°С для праймеров Bh1. Для праймеров Bh2 температура отжига составила 64°С. Разработанные режимы амплификации для праймеров систем Bh1 и Bh2 представлены в таблице 2. Таблица 2. Оптимизированные режимы амплификации для праймеров систем Bh1 и Bh2. Стадия Режим для праймеров rBh1 и fBh1 Режим для праймеров rBh2 и fBh2 Количество циклов амплификации Начальная денатурация 95°С – 5 мин 95 °С – 7 мин 1 Денатурация 94°С – 1 мин 94°С – 1 мин 35 Отжиг праймеров 60°С – 1 мин 64°С – 45 сек Элонгация 72°С – 1 мин 72°С – 45 сек Финальная элонгация 72°С – 5 мин 72°С – 7 мин 1 В оптимальных условиях проведения ПЦР на чистых препаратах ДНК четкий положительный результат с формированием одиночных специфичных ампликонов размером 310 п.н. получен в реакции амплификации с праймерами Bh1. При использовании праймеров Bh2 размер синтезируемых ампликонов составлял 585 п. н. Результаты анализа продуктов амплификации представлены на рисунке 1. Рисунок 1. Электрофореграмма продуктов амплификации, полученных с использованием праймеров Bh1и Bh2 при выделении Blastocystis spp. из чистой культуры. дорожки М, 7 – маркеры молекулярных размеров (Gene Ruler 100 п.н.); 1 - 4 – изученные образцы ДНК, полученные с применением праймеров Bh2; 5 –отрицательный контроль; 6 - изученные образцы ДНК, полученные с применением праймеров Bh1 Эти результаты соответствовали расчетным данным, которые были получены с помощью компьютерного анализа и свидетельствовали о потенциальной пригодности выбранных нами праймеров для конструирования амплификационной тест-системы с целью идентификации генома Blastocystis spp. Выделенные сорбционным методом пробы ДНК чистой культуры бластоцист позднее использовались в качестве положительного контроля реакции аплификации (ПК) при проведении апробации праймеров на клиническом материале. Таким образом, в ходе проведенных исследований нами были подобраны специфические праймеры и определены оптимальные режимы проведения ПЦР, что позволяет в перспективе создать отечественную диагностическую тест-систему для выявления генома бластоцист. Использование ПЦР для обнаружения бластоцист в клиническом материале В качестве клинического материала были исследованы фекалии пациентов. Следующим этапом исследований явилась разработка оптимального способа выделения ДНК, который обеспечивал бы эффективный лизис клеток возбудителя, качественную очистку нуклеиновых кислот от компонентов, ингибирующих реакцию амплификации, а также концентрирование препарата при проведении ПЦР. Была проведена сравнительная оценка различных способов выделения ДНК Blastocystis spp. при исследовании чистых культур. Использовались: метод аффинной сорбции на силикагеле с предшествующим лизированием пробы в гуанидинтиоционате, лизирующий метод с реагентом для преципитации и метод нуклеосорбции на носителе (стеклянные шарики) с разрушением клеточной стенки гуанидинтиоцианатом. Основным критерием служило наличие специфической амплификации в исследуемых пробах. Результат сравнительного применения трех наборов для выделения ДНК представлен на рисунке 2. Рисунок 2. Электрофореграмма продуктов ПЦР при различных способах экстракции ДНК Blastocystis spp. Праймеры Bh1. A –пробы, подготовленные лизирующим методом с реагентом для преципитации; Б – пробы, подготовленные методом нуклеосорбции на носителе с гуанидинтиоционатом; В – пробы, подготовленные методом аффинной сорбции на силикагеле с предшествующим лизированием в гуанидинтиоционате По данным литературы известно, что длительное замораживание образцов не влияет на результат ПЦР, однако размораживание материала может снижать эффективность ПЦР. В этой связи, для изучения воздействия многократного размораживания и замораживания проб на результаты ПЦР нами было проведено несколько экспериментов. После первого размораживания фекалий из проб с помощью сорбентного метода выделяли ДНК Blastocystis spp. Затем проводили ПЦР с использованием праймеров Bh2. Из 34 микроскопически положительных проб, реакция ПЦР была положительной 94,4% (32 пробы). Исследованные пробы вновь замораживались и выдерживались при температуре -20°С в течение суток. После повторного размораживания проб положительный результат ПЦР наблюдался уже в 29,4% (10 проб). После третьего цикла заморозки-разморозки, положительная ПЦР была только в 2 пробах (5,8%). Таким образом, проведенные нами исследования показали, что повторное размораживание клинического материала существенно снижает эффективность ПЦР, что проявляется значительным снижением частоты получения позитивных результатов в заведомо положительных пробах. Исходя из этого, при транспортировке и хранении замороженных образцов следует строго соблюдать температурный режим и не допускать случаев размораживания клинического материала. Несоблюдение этих правил негативно отражается на результатах ПЦР диагностики бластоцистной инвазии. На следующем этапе работы была изучена диагностическая информативность метода ПЦР с данными праймерами при исследовании клинического материала. Для оценки эффективности разработанной методики с целью верификации бластоцист подобранный метод выделения ДНК из клинического материала и модифицированные условия амплификации ДНК были применены для анализа клинических образцов (фекалии) 77 пациентов. Исследование клинических проб проводили параллельно микроскопическим и молекулярно-биологическим (ПЦР) методами. При электрофорезе в УФ с длиной волны излучения 312/254 нм размеры анализируемых фрагментов ДНК определяли относительно маркера молекулярного веса, что составляло для праймеров Bh1 - 310 п.н., а для Bh2 - 585 п.н. Частота выявления ДНК конкретного возбудителя в значительной мере зависит как от условий проводимой реакции, чувствительности метода, так и от количества детектируемых ДНК в исследуемом клиническом материале. Данное утверждение в определенной мере может быть обосновано тем, что наряду с отрицательными и положительными результатами определения ДНК, мы часто наблюдали слабоположительную реакцию. Слабоположительная реакция была при анализе проб, содержащих бластоцисты в количестве до 10 в поле зрения, выявленных микроскопически. При малых количествах ДНК Blastocystis spp. отмечалось снижение интенсивности соответствующих полос на геле - слабоположительная реакция. На основании проведенных исследований был сделан вывод о принципиальной возможности использования праймеров Bh 1 и Bh 2 для идентификации бластоцист в клиническом материале. Однако чувствительность этих праймеров при постановке ПЦР отличалась. Исследования при проведении амплификационного метода с чистыми культурами бластоцист показали, что более высокий процент выявления положительных результатов был получен с помощью праймеров Bh2, по сравнению с праймерами Bh1. Следует также отметить, что при постановке ПЦР с пробами кала, в которых микроскопически не определялись бластоцисты, положительные либо слабоположительные результаты регистрировались при применении праймеров Bh2. В то же время, при использовании праймеров Bh1 на электрофореграммах часто выявлялись дополнительные полосы так называемые «шмеры ДНК», что затрудняло интерпритацию результатов реакции. При микроскопии фекалий в 36 из 77 пробах (46,8%) были выявлены бластоцисты, которые определялись в количестве от единичных до нескольких десятков в поле зрения, у 41 пациента – микроскопические исследования были отрицательными. Все эти пробы были проверены методом ПЦР с помощью праймеров Bh1 и Bh2. С помощью праймеров Bh2 мы определили ДНК Blastocystis spp. в клиническом материале у 43 из 77 пациентов, что составило 55,8%, при использовании праймеров Bh1 – в 34 пробах (44,2%). Отрицательные результаты ПЦР регистрировались в клиническом материале, в котором было низкое содержание Blastocystis spp., менее 10 в поле зрения. Получение этих отрицательных результатов по всей вероятности, было связано с не соблюдением температурных условий транспортировки материала, в результате чего, в ряде случаев, проходило его частичное размораживание. Слабоположительную реакцию наиболее часто наблюдали при анализе проб кала, в которых содержались единичные бластоцисты, выявленные методом микроскопии. При сравнении способов детекции бластоцист в кале микроскопическим методом и ПЦР при использовании праймеров Bh1 совпадение положительных результатов отмечено в 88,8% (32 положительные пробы при ПЦР с Bh1 из 36 положительных проб, подтвержденных микроскопически) и 94,4% при использовании праймеров Bh2 (34 положительные пробы при ПЦР с Bh2 из 36 положительных проб, подтвержденных микроскопически) (таблица 3). Таблица 3. Сравнительная эффективность методов детекции бластоцист в клиническом материале. Результаты обследования 77 пациентов микроскопическим методом Результаты ПЦР, применение праймеров Bh1 Результаты ПЦР, применение праймеров Bh2 положитель-ные отрицатель-ные положитель-ные отрицатель-ные Положительные, n=36 (100%) 32 88,8% 4 11,2% 34 94,4% 2 5,6% Отрицательные, n=41 (100%) 3 7,3% 38 92,7% 9 21,9% 32 78,1% Из таблицы видно, что при исследовании микроскопически отрицательных проб методом ПЦР с использованием праймеров Bh1 у 3 пациентов (7,3%) был получен положительный результат. При использовании праймеров Bh2 в группе пациентов с микроскопически отрицательными результатами, амплификационный метод позволил обнаружить нуклеотидные последовательности ДНК бластоцист в 21,9% случаев (9 пациентов). При этом следует заметить, что все положительные результаты, полученные с использованием праймеров Bh1 при исследовании микроскопически отрицательных проб, были также положительными при проведении ПЦР с праймерами Bh2. Таким образом, полученные нами данные свидетельствуют о высокой чувствительности метода ПЦР с использованием праймеров Bh1 и Bh2, позволяющих идентифицировать ДНК бластоцист в пробах, которые по данным микроскопического метода были отнесены в группу отрицательных. С помощью амплификационного метода удалось установить наличие бластоцистной инвазии у пациентов, у которых интенсивность инвазии была минимальна и микроскопически не определялась. Отрицательные результаты ПЦР в пробах с заведомым содержанием бластоцист, полученные в 4 пробах (11,2%) при использовании праймеров Bh1 и в 2 пробах (5,6%) при использовании праймеров Bh2, возможно обусловлено техническими ошибками в методике постановки реакции, результатом чего, вероятнее всего, явилось попадание в рабочий раствор ингибирующих примесей. Не смотря на это, результаты проведенных исследований наглядно демонстрируют, что эти два метода – микроскопический и молекулярно-биологический, имея каждый свои недостатки и достоинства, при их комплексном использовании способны увеличить выявляемость бластоцист, а значит улучшить диагностику этого протозооза. Высокая технологичность и большая «пропускная» способность метода ПЦР делает его незаменимым при проведении обследования различных людских контингентов с большой численностью и может служить дополнительным методом, позволяющим улучшить качество лабораторной диагностики при обследовании пациентов с патологией желудочно-кишечного тракта.

Похожие:

	Методическая разработка по внедрению проектного метода на уроках географии Данная методическая разработка предполагает проведение уроков по дисциплине География с использованием элементов проектного метода...		Разработка и исследование методов определения видимости полигонов... Целью диссертации является разработка метода, который бы позволил отрисовывать сцены, геометрическая сложность которых, в настоящее...
	Доклад ронжина Андрея Леонидовича по диссертационной работе «Разработка... «Разработка адаптивного метода робастного понимания слитной речи на основе интегральной обработки данных», представленной на соискание...		Разработка проекта по литературе с применением метода сравнительно-типологического... Традиционная для 11 класса тема «Основные темы и идеи литературы Русского Зарубежья» может быть изучена на основе метода проектов....
	Заболевания химической этиологии, развивающиеся при, как правило,... Острые отравления заболевания химической этиологии, развивающиеся при, как правило, однократном попадании в организм человека химических...		Разработка урока алгебры в 9 классе Тема урока: Стандартный вид числа Учебник Ш. А. Алимов, Ю. М. Калягин, Ю. В. Сидоров, Н. Е. Фёдорова, М. И. Шабунин. Алгебра, 9 класс. Под научным руководством академика...
	Методическое пособие для студентов старших курсов, интернов, ординаторов и практикующих врачей Ания больных с заболеваниями лёгких, плевры; умение трактовать результаты обследования этих больных с учётом данных инструментальных...		Реферат Разработка метода оценки физического состояния спортсменов... Разработка метода оценки физического состояния спортсменов с использованием биолюминесцентной системы светящихся бактерий
	Методическая разработка практического занятия по теме: «Кардиомиопатии»... Цель занятия: освоение навыков постановки диагноза и тактики ведения пациентов с кардиомиопатиями (целенаправленный сбор анамнеза,...		Методическая разработка практического занятия по теме: «Дерматомиозит»... Цель занятия: освоение навыков постановки диагноза и тактики ведения пациентов с дерматомиозитом (целенаправленный сбор анамнеза,...
	Методическая разработка практического занятия по теме: «лекарственная... Цель занятия: освоение навыков постановки диагноза и тактики ведения пациентов с лекарственной болезнью (целенаправленный сбор анамнеза,...		Рабочая программа по физике (предмет) 8 «В»класс умк перышкин А. В. под редакцией Тихонова Е. Н Подчеркнем, что ознакомление школьников с методами научного познания предполагается проводить при изучении всех разделов курса физики,...
	Список работ д ф. м наук В. Л. Бычкова Авилова И. В., Бычков В. Л.,... Авилова И. В., Бычков В. Л., Касьянов В. А., Подлубный Л. И. Расчет вероятностей радиационных процессов при помощи метода модельного...		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... «аптеку» для использования ее в качестве средства первой доврачебной помощи при острых простудных заболеваниях и при некоторых хронических...
	Тема: “ Системы 2-х, 3-х линейных уравнений Г.), теории электричества и магнетизма, геодезии (разработка метода наименьших квадратов) и мн разделов астрономии		Реферат тема: "Язвенные гастродуоденальные кровотечения" Цель исследования: изучение этиологии, патогенеза, клиники, ди­агностики и особенностей хирургической тактики при язвенных гастродуоденальных...