Научные, методические и организационные основы мониторинга устойчивости микроорганизмов к дезинфицирующим средствам в рамках эпидемиологического надзора

Таким образом, проведено 50700 исследований 4039 штаммов микроорганизмов; проанализировано 15832 истории болезни, наблюдением охвачено 3223 пациента с ИСМП

Для изучения искусственной адгезии на буккальном эпителии ставили реакцию по методу D.Goldman в собственной модификации.

Выделение ДНК Legionella pneumophila проводилось при помощи ПЦР с гибридизацинно-флюоресцентной детекцией в режиме реального времени с использованием тест-систем «АмплиСенс Legionella pneumophila-FL» (вариант FRT).

Полутонкие и ультратонкие срезы для электронной микроскопии готовили на ультратоме ULTRACUT (Reichert-yung), контрастировали по методу Reynolds, просматривали в электронном микроскопе Morgagni 268D фирмы FEI, через видеокамеру Mega View III изображение выводили на экран компьютера Pentium IV и фотографировали. Морфометрию проводили с помощью программы AnalySIS.

Статистическая обработка полученных результатов проводилась с помощью методов вариационной статистики (относительные показатели представлены как Р±2m), методов оценки достоверности результатов (параметрических - критерий t-Стьюдента и непараметрических – критерии c², итераций, Вилкоксона для связанных совокупностей), корреляционного анализа (коэффициент корреляции Пирсона). Обработка и анализ данных выполнялись на персональном компьютере с использованием прикладных программ Microsoft Office (Excel,) пакета статистических программ Statz, Statistica 6.0, программ EpiInfo, WhoNet 5.4. Использовались компьютерные базы данных учреждений Роспотребнадзора - программа популяционной заболеваемости, версия 2,0 (отчетная статистическая форма 2).

Результаты исследования и обсуждение

Обоснование МУ к ДС потребовало теоретической разработки данной проблемы. Основаниями для систематизации имеющихся сведений, разработки современной классификации устойчивости, согласования отечественной и зарубежной терминологии послужили результаты собственных исследований, а также данные выборочных исследований и предложения по классификации отечественных и зарубежных авторов (Russell A. D., 1990, 1995; Gerald Mc Donnel и A. Denver Russel, 1999; Р.П.Венцел, 2004; Научный комитет по возникающим и вновь определенным рискам для здоровья (Scientific Committee on Emerging and Newly Identified Health Risks – SCENIHR), 2009; Горбунов В.А., 2010; Тимошинова с соавт., 2010 и др.).

На основании классификационного признака «наличие или отсутствие исходной (природной) устойчивости к ДС» нами выделены следующие виды устойчивости: естественная устойчивость - имеется исходная/природная устойчивость к ДС; приобретенная устойчивость - отсутствует исходная/природная устойчивость к ДС (рис.1).

Естественная устойчивость микроорганизмов к ДС (соответствует зарубежным представлениям о внутренней устойчивости – Intrinsic, innate resistance) – генетически закрепленное свойство микроорганизмов, относящихся к одному таксону, проявляющееся в устойчивости (сниженной чувствительности, нечувствительности) микроорганизмов к воздействию некоторых ДС. Является «врожденным» свойством микроорганизмов и характерна для всех представителей данного семейства, рода, вида.

Приобретенная устойчивость микроорганизмов к ДС (Acquired Resistance) – адаптация микроорганизмов к воздействию ДС, характеризующаяся формированием устойчивости к бактерицидным концентрациям одного или нескольких ДС, к которым отсутствует исходная (природная) устойчивость.

Рисунок 1 Классификация устойчивости микроорганизмов к ДС

Базовым признаком, заложенным в основу классификации приобретенной резистентности, являются механизмы её формирования, в зависимости от которых можно выделить следующие виды устойчивости.

1. 
   Генотипическую устойчивость, обусловленную:
   

• 
  мутациями;
  
• 
  переносом плазмид и транспозонов (Plasmid-mediated resistance, Transferable biocide resistance);
  
• 
  другими изменениями хромосомной и внехромосомной ДНК.
  

2. 
   Фенотипическую устойчивость:
   

• 
  формирование биопленок;
  
• 
  индуцированную устойчивость - формирующуюся в результате воздействия ДС как адаптацию микроорганизмов, сопровождающуюся фенотипическими изменениями клеток.
  

Необходимо отметить, что феномен приобретенной фенотипической устойчивости на данный момент изучен недостаточно, в связи с чем в нельзя с полной уверенностью говорить о такой устойчивости исключительно как о внешнем (фенотипическом) проявлении адаптации. Вопрос о механизмах такой устойчивости и возможности её закрепления на генетическом уровне остается открытым и требует углубленного исследования.

Устойчивость к ДС должна рассматриваться в комплексе с устойчивостью к другим АБС, поэтому другим признаком, положенным в основу классификации устойчивости микроорганизмов к ДС, является наличие одновременной резистентности к ДС и другим АБС (рис. 2). Исходя из наличия/отсутствия резистентности к другим АБС, можно выделить следующие виды устойчивости.

1. 
   Устойчивость к одному ДС (монорезистентность).
   
2. 
   Устойчивость к другим ДС и АС:
   

• 
  перекрестную - устойчивость к различным ДС, относящимся к одной группе химических соединений на основе одного активно-действующего вещества (АДВ);
  
• 
  ассоциированную - устойчивость к ДС, относящимся к разным группам химических соединений по АДВ;
  
• 
  сочетанную - устойчивость к двум и более ДС из одной группы химических соединений, но с различными АДВ.
  

3. 
   Комбинированную устойчивость.
   

Рисунок 2 Классификация устойчивости микроорганизмов к антибактериальным средствам

Сочетанная устойчивость к ХДС регистрировалась с частотой 8,9 на 100 исследований; среди всех устойчивых к ХДС культур микроорганизмов 34,4% проявляли сочетанную резистентность. В структуре микроорганизмов, проявлявших сочетанную устойчивость, преобладали бактерии с одновременной резистентностью к 2-ум ДС – 79,2%; доля штаммов, устойчивых к 3-м ДС, составила 20,8% (рис.3).


монорезистентность

сочетанная устойчивость



Рисунок 3 Структура сочетанной устойчивости микроорганизмов (% резистентных к ХДС штаммов)

Определена представленность штаммов с комбинированной резистентностью к антибиотикам и ДС (рис. 4). Доля культур, обладающих полирезистентностью к антибиотикам, но чувствительных к ДС составила 32,7±6,7%; устойчивых к ДС, но чувствительных к большинству антибиотиков - 5,1±3,1%. Штаммы с комбинированной резистентностью к антибиотикам и ДС представлены только 1,02±1%.

Рисунок 4 Удельный вес микроорганизмов с устойчивостью к дезсредствам и антибиотикам

Экспериментальные исследования показали возможность выработки индуцированной устойчивости тест-штаммами микроорганизмов в лабораторных условиях в результате систематического воздействия ДС в заниженных (суббактерицидных) концентрациях. Проведена серия экспериментов в лабораторных условиях, которые включали: формирование устойчивости у тест-штамма E.coli к ДС на основе ЧАС и к ХДС.

Итогами эксперимента по формированию устойчивости к ЧАС стало:

1. 
   установление факта формирования устойчивости у тест-штамма E.coli при систематическом воздействии ЧАС в суббактерицидной концентрации;
   
2. 
   появление неполной чувствительности к бактерицидной концентрации после 5-го воздействия, устойчивости – после 6-го воздействия ЧАС в суббактерицидной концентрации;
   
3. 
   постепенное нарастание изменений культуральных и морфологических свойств бактерий в ходе формирования устойчивости;
   
4. 
   выраженный полиморфизм клеток по форме и размеру, изменения структуры клеточной стенки (КС) – утрата характерного слоистого строения, разрыхленность, складчатость («гофрированная стенка») и др. (фото 1).
   

Фотография 1 Электронно-микроскопические фотографии интактных (верхний ряд)
и устойчивых к ЧАС (нижний ряд) E.coli

При сравнении толщины КС интактной E.coli (1,957±0,52 нм), и устойчивой к ЧАС E.coli (2,642±0,9 нм), установлено, что в процессе формирования устойчивости произошло утолщение КС в 1,1 – 6 раз по сравнению с интактной (р0,01), что свидетельствует об участии внешних структур E.coli в формировании индуцированной устойчивости к ДС на основе ЧАС (рис.5).
Рисунок 5 Сравнение толщины клеточной стенки интактных (инт) и устойчивых к ЧАС (опыт) E.coli

Итогами эксперимента по формированию устойчивости к ХДС стало:

1. 
   установление факта формирования устойчивости к ХДС у тест-штамма путем систематического воздействия суббактерицидной концентрацией;
   
2. 
   появление неполной чувствительности микроорганизма к ХДС после 14-го воздействия ДС в суббактерицидной концентрации;
   
3. 
   стабильное проявление устойчивости к бактерицидной концентрации ДС после 40-го воздействия ХДС в суббактерицидной концентрации;
   
4. 
   постепенное изменение тинкториальных, культуральных, морфологических, биохимических свойств и подвижности, начиная с 3-4-го воздействия, которое предшествовало появлению неполной чувствительности к ХДС;
   
5. 
   выраженные ультраструктурные изменения клеток (фото 2). КС устойчивых к ХДС E.coli утолщена, разрыхлена, местами отслоена; имеет неровную поверхность, характеризовалась наличием выростов и петель, препятствующих проникновению ДС внутрь бактериальной клетки. Типично наличие участков значительно утолщенной КС на концах клеток в виде «полюсных шапочек».
   

1

2



3

4



Фотография 2 Электронно-микроскопические фотографии интактных (1),
неполностью чувствительных (2,3) и устойчивых к ХДС (4) E.coli

При сравнении толщины КС интактной E.coli (1,957±0,52 нм), неполностью чувствительной E.coli после 19-го воздействия ДС (3,357±0,7 нм) и устойчивой к ХДС E.coli после 40-го воздействия (3,389±1,18 нм), установлено, что в процессе формирования устойчивости произошло утолщение КС в 1,7 раза по сравнению с интактной (р0,01). Изменение толщины КС было еще более выраженным на полюсах клеток, где сформировались так называемые «полюсные шапочки», толщина которых, в среднем, составила 7,857±1,1 нм, что в 4 раза больше по сравнению с интактной E.coli (р0,001).

В результате серии экспериментов установлено, что индуцированная устойчивость к ЧАС и ХДС формируется в результате адаптации E.coli к систематическому воздействию заниженных концентраций указанных ДС за счет морфологических модификаций внешних структур клетки, сопровождается постепенным нарастанием изменений тинкториальных, культуральных, морфологических, биохимических свойств и подвижности E.coli, предшествующих появлению неполной чувствительности и устойчивости к ДС.

Проведенные эксперименты легли в основу создания «Способа моделирования формирования устойчивости бактерий к ДС» (рис.6).