Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств

Скачать 334.3 Kb.

Название	Получение рекомбинантных белков западносибирских изолятов borrelia burgdorferi sensu lato и изучение их антигенных свойств
страница	1/3
Дата публикации	30.11.2014
Размер	334.3 Kb.
Тип	Автореферат

100-bal.ru > Биология > Автореферат

1 2 3

На правах рукописи

РЯБЧЕНКО

АЛЕКСАНДР ВЛАДИМИРОВИЧ

ПОЛУЧЕНИЕ РЕКОМБИНАНТНЫХ БЕЛКОВ ЗАПАДНОСИБИРСКИХ ИЗОЛЯТОВ BORRELIA BURGDORFERI SENSU LATO И ИЗУЧЕНИЕ ИХ АНТИГЕННЫХ СВОЙСТВ

03.00.04 – биохимия

03.00.03 – молекулярная биология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Новосибирск – 2009

Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Научный руководитель:

доктор биологических наук Беклемишев Анатолий Борисович

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук,

профессор Ильичёв Александр Алексеевич

доктор биологический наук,

профессор Гуляева Людмила Федоровна

Ведущая организация: Институт цитологии и генетики Сибирского отделения Российской академии наук, г. Новосибирск

Защита состоится « » 2009 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел.: 8 (383) 333-54-81.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук

Автореферат разослан «___» ___________ 2009г.

Ученый секретарь

диссертационного совета,

кандидат биологических наук Русских Г. С.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы

По морфологическим и генетическим признакам различают 13 геновидов спирохет комплекса Borrelia burgdorferi sensu lato (s.l.) (Baranton et al, 1998), относящихся к семейству SPIROCHAETACAE. Этиологическая роль спирохет этого комплекса как инфекционных агентов, переносимых клещами рода Ixodes была установлена в 1982 г. американскими исследователями и была названа «болезнью Лайма» (Steere, 2006). В нашей стране это природноочаговое трансмиссивное заболевание получило название «иксодового клещевого боррелиоза» (ИКБ). Три геновида этого комплекса являются патогенными для человека (Wang et al, 1999) и три условнопатогенными (Richter et al, 2006; Hofmann, 2005; Stanek and Strle, 2003; Hengge et al, 2003). По широте распространения и уровню заболеваемости ИКБ занимает одно из ведущих мест среди природно-очаговых заболеваний. Ареал инфекции простирается по всей Северной Америке, Европе, России, Японии, Китае (Stanek, 2003).

Отличия в генетической структуре патогенных геновидов боррелий, обусловливают полиморфизм клинических проявлений и органных поражений человека. Основные симптомы ИКБ сходны во всем мире, но есть и региональные отличия. В первую очередь между болезнью, обнаруженной в Америке и вызываемой исключительно геновидом B.burgdorferi sensu stricto (s.s.) с характерными проявлениями артрита, и болезнью, обнаруженной в Европе. В Европе болезнь вызывается, прежде всего, геновидами B.garinii - возбудителем, характеризующимся нейротропностью и B.afzelii, поражающим часто только кожу с развитием акродерматитов. При отсутствии своевременного лечения, инфекции переходят в хроническую форму.

В виду разнообразия клинических проявлений заболевания, для подтверждения диагноза используют дополнительные лабораторные методы, среди которых широкое распространение получили методы, основанные на выявление антител к возбудителю. В качестве антигенов используются лизаты клеток боррелий, либо рекомбинантные белки спирохет. Большая изменчивость антигенов возбудителя обуславливает сложность серодиагностики. Высокая вариабельность особенно характерна для внешних поверхностных белков боррелий, которые с одной стороны являются иммунодоминантными, с другой стороны - гомология среди белков этого класса варьирует от 70 до 100% даже среди изолятов выделенных на одной территории.

Используемые для серологической диагностики белки североамериканских и западноевропейских изолятов боррелий, такие как внешние поверхностные липопротеины, флагеллярные белки, основные мембранные белки, декорин-связывающие белки и некоторые другие хорошо изучены и описаны. Однако, практически отсутствует информация об аминокислотных последовательностях и иммунохимических свойствах антигенов спирохет комплекса B. burgdorferi s.l. распространенных на территории азиатской части России. Большая протяженность территории России с запада на восток позволяет предполагать, значительное отличие антигенов в изолятах циркулирующих на этой территории. В связи с этим, целью настоящего исследования являлось получение рекомбинантных иммунодоминантных белков западносибирских изолятов B. burgdorferi s.l. и сравнительное исследование их первичных структур и антигенных свойств.
Задачи исследования:

Оценить зараженность клещей Ixodes persulcatus Shulze, населяющих рекреационную зону Новосибирского Научного Центра, различными геновидами спирохет B.burgdorferi s.l.
Получить культуры западносибирских изолятов B. burgdorferi s.l.
На основе анализа литературных данных выбрать в качестве объектов исследования белки спирохет B.burgdorferi s.l. наиболее перспективные для создания средств серодиагностики ИКБ.
Сконструировать экспрессирующиие плазмидные векторы, пригодные для получения в клетках E.coli рекомбинантных белков боррелий и их последующей аффинной очистки.
Клонировать кодирующие области генов выбранных иммунодоминантных белков B.burgdorferi s.l. в клетках E.coli в составе экспрессирующих векторов.
Определить нуклеотидные последовательности клонированных генов спирохет B.burgdorferi s.l. и исследовать гомологию соответствующих им белков с опубликованными в базе данных GeneBank аналогичными белками боррелий.
Получить очищенные рекомбинантные белки западносибирских изолятов B.burgdorferi s.l. и исследовать их антигенные свойства методом ИФА на сыворотках больных ИКБ.
Оценить пригодность каждого из рекомбинантных антигенов боррелий для серодиагностики локализованной и диссеминированной стадий ИКБ.

Научная новизна работы

Исследована зараженность клещей Ixodes persulcatus Shulze, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в 2003, 2005, 2006 и 2008 годах, различными геновидами спирохет B.burgdorferi s.l. Отмечены зависимые от года наблюдений колебания в количестве инфицированных спирохетами особей (20% - 32%). Установлено, что только два геновида боррелий циркулировали до 2006 г. в популяции иксодовых клещей на обследованной терриртории – B.garinii и B.afzelii, с доминирующим преобладанием первого (70%-80%), включающего представителей двух геномных групп: NT29 и 20047. В 2006 и 2008 г.г. в нескольких особях клещей обнаружены спирохеты геновида B. japonica.

Сконструированы оригинальные бактериальные экспрессирующие вектора pRAC и pRAC3, содержащие химерные регуляторные районы, полилинкер для клонирования генов и участки, кодирующие олигогистидиновые последовательности в С-концевой области рекомбинантных белков. Штаммы E.coli, несущие полученные векторы обеспечивают трёхкратное увеличение синтеза белка GFP по сравнению с клетками, содержащими исходный экспрессирующий вектор pREB.

Определены нуклеотидные последовательности кодирующих областей генов flaA, flaB, ospC, ospA и dbpB западносибирского изолята B.garinii, группы 20047^Т и гена ospC западносибирского изолята B.afzelii; выведены соответствующие этим генам аминокислотные последовательности белков. Нуклеотидные последовательности выше названных генов депонированы в электронную международную базу данных генетической информации GenBank под инвентарными номерами: EU979631.1, EU979630.1, EU979629.1, EU979628.1, EU979626.1 и EU979627.1.

На основе сравнения аминокислотных последовательностей антигенов FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB спирохет B. burgdorferi s.l., представленных в базе данных GeneBank (декабрь 2008 г.) и установленных в настоящей работе, показано, что западносибирский изолят B.garinii группа 20047^Т (NSK-10-06, музейный штамм №10) филогенетически близок изолятам B.garinii, выделенным в Европе.

Исследованы антигенные свойства рекомбинантных белков FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB методом ИФА в экспериментах с сыворотками от больных ИКБ и здоровых доноров. Продемонстрирована перспективность использования названных рекомбинантных белков для серодиагностики ИКБ. Предложена комбинация рекомбинантных антигенов для выявления антител к возбудителям ИКБ в крови больных, как с локализованной, так и с диссеминированной стадиями заболевания.
Практическая значимость работы

Полученные в настоящей работе данные о зараженности клещей Ixodes persulcatus, отловленных в рекреационной зоне ННЦ в 2003, 2005, 2006 и 2008 годах, различными геновидами спирохет B.burgdorferi s.l. могут быть использованы для прогнозирования эпидемической ситуации по ИКБ и возможных клинических проявлений заболеваний.

Создана музейная коллекция западносибирских изолятов B.burgdorferi s.l. распространенных на территории Новосибирской области и определена их геновидовая принадлежность. Коллекция включает 2 изолята B.afzelii, 14 изолятов B.garinii, 7 образцов смеси изолятов B.afzelii и B.garinii. Культуры полученных изолятов боррелий могут быть использованы в качестве посевного материала для культивирования и наработки биомассы спирохет и решения исследовательских и прикладных задач.

Сконструированы векторы pRAC и pRAC3 пригодные для клонирования и эффективной индуцируемой экспрессии генов в клетках E.coli. Штаммы E.coli, содержащие в составе этих векторов экспрессируемые гены флюоресцирующих белков, могут применяться в химической, фармацевтической, пищевой промышленности и в экологическом мониторинге окружающей среды в качестве цельноклеточных биосенсоров для обнаружения генотоксикантов в исследуемых образцах.

Сконструированные штаммы E.coli - продуценты рекомбинантных белков FlaA, OspC, OspA, DbpB и FlaB, специфичных для геновидов B.garinii (группа 20047^Т), и OspC B.afzelii, могут быть использованы в качестве источников получения соответствующих антигенов боррелий.

Разработана технология получения рекомбинантных белков B.burgdorferi s.l. с помощью экспрессии соответствующих им генов в составе сконструированного вектора pRAC3 и модифицированного в настоящей работе вектора pET36b⁽⁺⁾ (pETm) в клетках E.coli (шт. BL-21(DE3) и Rosetta 2) и последующей аффинной очистки рекомбинантных полипептидов на металло-хелатных сорбентах.

Полученные в настоящей работе рекомбинантные антигены FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB могут быть использованы в серодиагностике ИКБ, вызываемого спирохетами B.burgdorferi s.l., циркулирующими на азиатской территории России.
Положения, выносимые на защиту:

В рекреационной зоне Новосибирского научного центра в период с 2003 по 2008 г.г. в популяции клещей Ixodes persulcatus Schulze циркулировали только три геновида боррелий – B.garinii, B.afzelii и B.japonica с доминирующим преобладанием B.garinii (более 75%). Заражённость иксодовых клещей боррелиями составляла, в зависимости от года наблюдений, 20% - 32%.
Западносибирский изолят B.garinii группы 20047^Т (NSK10-06, музейный штамм №10) филогенетически близок боррелиям, изолированным на территории Европы.
Сконструированные плазмидные векторы pRAC, pRAC3 и модифицированный в настоящей работе вектор pET36b⁽⁺⁾ (pETm) являются эффективными системами для экспрессии клонируемых в их составе генов в клетках E.coli.
Штамм E.coli, содержащий в составе плазмиду pRAC может применяться в качестве цельноклеточного биосенсора для обнаружения генотоксикантов.
По результатам исследований антигенных свойств рекомбинантных белков FlaA, FlaB, OspC, OspA и DbpB, данные белки могут быть рекомендованы для серодиагностики ИКБ.

Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационной работы доложены на следующих научных форумах: Междисциплинарный конгресс "Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека", 10-21 июня 2004, Судак, Украина; Международная конференция «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». «Сосновка», Новосибирская область, 8-10 сентября 2004; Третий Московский международный конгресс "Биотехнология: состояние и перспективы развития", 14-18 марта, 2005 г., Москва; Московская международная конференция «Биотехнология и медицина», 14-17 марта, 2006 г., Москва.

Публикации. По материалам диссертации опубликованы 14 работ, из них 4 тезиса, 9 статей и один патент.

Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, включающих обзор литературы, материалов и методов, результатов исследований и обсуждения, заключения, выводов, списка литературы, включающих 27 отечественных и 225 зарубежных источников и приложения. Материалы диссертации изложены на 160 страницах машинописного текста, включая 5 страниц приложений. Работа иллюстрирована 8 таблицами и 25 рисунками. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ биохимии СО РАМН.

Основное содержание работы
Оценка зараженности клещей Ixodes persulcatus, населяющих рекреационную зону Новосибирского научного центра, спирохетами Borrelia burgdorferi s.l.

В работе использовали клещей Ixodes persulcatus Schulze, собранных в весенние периоды 2003, 2005, 2006 и 2008 гг. на территории Новосибирского научного центра (ННЦ). Для обнаружения и генотипирования геномных ДНК спирохет Borrelia burgdorferi s.l., выделенных непосредственно из клещей, использовали двух-этапную процедуру (Postic et al, 1994). На первом этапе определяли присутствие геномных ДНК боррелий в препаратах ДНК, выделенных из клещей, с помощью амплификации методом ПЦР межгенной области rrf-rrl (генов 5S и 23S рРНК) генома спирохет. ПЦР проводили в присутствии прямого (№ 126: 5’-TGCGAGTTCGCGGGAG-3’) и обратного (№ 127: 5’-TCCTAGGCATTCACCATAGACTCTT-3’) праймеров, причём для исключения ложноотрицательных результатов анализа, реакцию проводили в присутствие ДНК внутреннего контроля, в качестве которого служил ампликон фрагмента генома вируса гепатита В, размером 150 п.н. (Beklemishev et al., 2003). В качестве положительного контроля в ПЦР использовали геномную ДНК B.burgdorferi sensu stricto эталонного штамма В31. На втором этапе исследовали полиморфизм длин рестриктных фрагментов, полученных гидролизом ампликонов межгенной области rrf-rrl эндонуклеазами рестрикции MseI или Tru9I. Поскольку представителям каждого геновида геномной группы спирохет B.burgdorferi s.l. свойственен определённый набор отличающихся по размерам рестриктных фрагментов ампликона межгенной области rrf-rrl (Postic et al, 1996), то по результатам электрофоретического анализа полученных рестриктов можно судить о геновидовой принадлежности боррелий, содержащихся в исследуемом клеще.

На рис. 1 представлены результаты типичного анализа ПДРФ ампликонов межгенной области rrf-rrl, полученных на исследуемых образцах ДНК клещей.