Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста

Скачать 273.43 Kb.

Название	Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам рецептора эпидермального фактора роста
страница	1/3
Дата публикации	18.12.2014
Размер	273.43 Kb.
Тип	Автореферат

100-bal.ru > Химия > Автореферат

1 2 3

На правах рукописи

ГОРИН АНДРЕЙ ОЛЕГОВИЧ

РОЛЬ БИОСИНТЕЗА СТЕРОЛОВ В ЧУВСТВИТЕЛЬНОСТИ ОПУХОЛЕВЫХ КЛЕТОК К БЛОКАТОРАМ РЕЦЕПТОРА ЭПИДЕРМАЛЬНОГО ФАКТОРА РОСТА

03.01.04 – Биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Казань – 2013

Работа выполнена на кафедре биохимии ФГАОУ ВПО «Казанский (Приволжский) федеральный университет».

Научный руководитель:	доктор биологических наук, профессор
	Абрамова Зинаида Ивановна
Официальные оппоненты:	доктор медицинских наук, профессор Мустафин Ильшат Ганиевич (ГБОУ ВПО «Казанский государственный медицинский университет» заведующий кафедрой биохимии.

	доктор биологических наук, старший научный сотрудник Коксин Владимир Петрович (ГАУЗ «Республиканский центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями МЗ РТ» заведующий лабораторией биохимии.
Ведущая организация	Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Башкирский государственный медицинский университет».

Защита диссертации состоится 20 июня 2013 г. в 13⁰⁰ часов на заседании диссертационного совета Д212.081.08 при Казанском (Приволжском) федеральном университете по адресу: 420008, Республика Татарстан, г. Казань, ул. Кремлевская, д. 18, Казанский (Приволжский) федеральный университет, аудитория № 211.
С диссертацией можно ознакомиться в Научной библиотеке им. Н.И. Лобачевского при Казанском (Приволжском) федеральном университете.
Автореферат разослан «___» ___________ 2013 г.

420008, Казань, ул. Кремлевская, д.18, главное здание КФУ к.104, отдел аттестации научных кадров, ученому секретарю диссертационного совета Д212.081.08 проф. Абрамовой З.И., факс: (843)238-76-01. E-mail: ziabramova@mail.ru

Ученый секретарь Диссертационного совета, доктор биологических наук, профессор

Абрамова З.И.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Онкологические заболевания являются одной из основных причин смертности в XXI веке. Так как опухоль представляет собой совокупность бесконтрольно делящихся клеток, то для терапии опухолей самой предпочтительной мишенью является блокада сигнальных путей, ответственных за запуск митотических процессов. Одним из ключевых механизмов проведения таких сигнальных путей является рецептор эпидермального фактора роста (ЭФР), стимулирующий деление клеток после активации факторами роста. Многие опухолевые клетки приобретают амплификацию или активирующие мутации этого рецептора, что дает им преимущество в делении и росте (Yarden Y. // European journal of cancer. 2001. №37(4). P.3). Это привело к созданию многочисленных блокаторов этого рецептора, которые показали хорошие результаты при исследованиях in vitro (Jimeno A. // Critical reviews in oncology/hematology. 2005. №53. P.179). К таким блокаторам относятся антитела против внеклеточного домена рецептора и низкомолекулярные ингибиторы тирозиновых киназ. Однако в клинической практике блокада рецептора ЭФР оказалась значительно ниже предполагаемой вследствие развития опухолями первичной или приобретенной резистентности к используемым препаратам (Hopper-Borge E.A. // Expert opinion on therapeutic targets. 2009. №13. P.339). При большинстве опухолей эффективность такой терапии не превышает 10% (Metro G. // Reviews on recent clinical trials. 2006. №1. P.1)

Таким образом, поиск способов усиления эффективности блокаторов рецептора ЭФР является крайне актуальной проблемой современной онкологии, над котороый работают многочисленные лаборатории в России и за рубежом. Большинство опубликованных по данной теме работ направлены на изменение структуры самого лекарственного средства для усиления его эффективности и уменьшения вероятности развития резистентности клетками опухолей (Elloumi J.//Recent patents on biotechnology.2012.№6.P.45).

В данной работе был использован новый подход к увеличению эффективности блокаторов рецептора ЭФР, основанный на принципе синтетической летальности. Во многих случаях причиной развития приобретенной резистентности является запуск альтернативных сигнальных путей (Janne P.A. // Nature reviews Drug discovery. 2009. №8. P.709), поэтому в качестве основы для работы было взято устранение этого обхода. Сигнальная система клеток представляет собой огромную сеть пересекающихся путей, которые до сих пор остаются не до конца изученными. Так как спрогнозировать путь обхода клеткой опухоли блокады рецептора на современном этапе развития науки не представляется возможным, то в качестве средства поиска альтернативных путей использовались опубликованные скрининговые исследования, указывающие точечно на гены, блокада которых может усилить эффект ингибирования рецептора ЭФР (Astsaturov I. // Science signaling. 2010. №3. P.130).

Для сужения огромных баз данных были выбраны гены, относящиеся только к пути метаболизма стеролов. Блокада биосинтеза стеролов сама по себе была описана в качестве средства профилактики опухолей (Israel M. // Mol Cancer. 2011. №10. P.70). Кроме этого снижение уровня холестерола в мембранах клеток влияет на функционирование рецепторов факторов роста (Sigismund S. // Developmental cell. 2008. №15. P.209). Тем не менее, клинического применения лекарства, влияющие на биосинтез стеролов, не нашли. Более того дистальный участок пути стерольного синтеза в контексте онкологических заболеваний исследован не был. Нахождение генов из данного пути, блокада которых усиливает чувствительность опухолей к ингибиторам рецептора ЭФР, поможет существенно снизить смертность от опухолей, поддерживаемых функционированием рецептора ЭФР.

Цель настоящей работы заключалась в описании механизма влияния генов пути биосинтеза стеролов на сигнальный путь рецептора ЭФР.

В соответствии с поставленной целью решались следующие задачи:

Найти гены из пути биосинтеза стеролов, увеличивающие чувствительность опухолевых клеток к блокаторам рецептора ЭФР;
Провести биоинформатический анализ вовлечения найденных генов в общие клеточные процессы;
Исследовать механизм развития сенситизации к блокаде рецептора ЭФР при блокаде найденных генов;
Показать эффект блокады найденных генов на чувствительность к ингибированию рецептора ЭФР ксенографтных опухолей у мышей.

Научная новизна. В данной работе было впервые исследовано взаимодействие пути биосинтеза стеролов с сигнальным путем рецептора ЭФР. Показано, что эффект на жизнеспособность опухолевых клеток оказывает не сам факт блокады пути, а точечное ингибирование активности определенных генов, кодирующих этап С4-деметилирования предшественника холестерола. При этом было впервые описано, что эти гены контролируют такой общий клеточный процесс, как везикулярный транспорт, что не относится к их непосредственной функции. Это изменение движения везикул и является основной причиной развития опухолями сенситизации к лечению блокаторами рецептора ЭФР.

Научно-практическая значимость работы. Полученные результаты представляют интерес для разработки новых лекарственных препаратов, которые будут усиливать эффект лечения пациентов антагонистами рецептора ЭФР, а также будут препятствовать развитию приобретенной резистентности опухолевыми клетками к данной терапии.

Кроме этого описанные взаимодействия являются крайне интересными для понимания процессов внутриклеточного везикулярного транспорта, так как описан абсолютно новый механизм модификации данного процесса посредством блокирования генов из пути биосинтеза стеролов. Таким образом, полученные данные представляют интерес как с практической точки зрения в качестве лекарственного препарата, так и с точки зрения таких теоретических дисциплин, как молекулярная биология и биохимия.

Положения, выносимые на защиту:

Ингибирование двух ферментов С4-деметилирующего комплекса из пути биосинтеза стеролов сенситизирует опухолевые клетки к блокаде рецептора ЭФР.
Блокада С4-деметилирования приводит к изменению внутриклеточного движения везикул, что в результате ускоряет лизосомальную деградацию рецептора ЭФР.
Рост ксенографтных опухолей с выключенным ферментом из пути С4-деметилирования подавляется практически полностью лечением блокаторами рецептора ЭФР.

Апробация работы. Результаты исследования докладывались на ежегодных конференциях «Актуальные проблемы биохимии и нанотехнологии» (Казань, 2012 и 2013), на III Международной научно-практической конференции «Новые концепции механизмов воспаления, аутоиммунного ответа и развития опухоли» (Казань, 2012; приз за лучший устный доклад), на 50-й ежегодной конференции Американского общества клеточной биологии (Филадельфия, США, 2010), на 13-й конференции онкологического института Фокс Чейз (Филадельфия, США, 2011; второе место в постерной сессии), на конференции «Метаболизм и опухоль» Американской ассоциации исследования опухоли (Балтимор, США, 2011), на конференции «Молекулярные мишени и терапия опухоли» Американской ассоциации исследования опухоли (Сан-Франциско, США, 2011), на I конференции университета Тэмпл (Филадельфия, США, 2012).

Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 научных работ, среди которых 1 публикация в рецензируемом журнале, включенном в список ВАК и 2 публикации в журналах базы SCOPUS.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов, их обсуждения, выводов и списка цитированной литературы. Работа изложена на 96 страницах машинописного текста, включает 31 рисунок. Библиография включает 141 наименование.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. В экспериментах in vitro использовались клеточные линии эпидермоидной карциномы А431, сквамозных карцином SCC61, SCC68 и FaDu, немелкоклеточного рака легкого PC9. Для выключения ферментов стерольного синтеза использовалась трансфекция при помощи миРНК. Для блокады рецептора ЭФР применялись ингибитор эрлотиниб (Santa Cruz, США) и антитело цетуксимаб (FCCC, США), для стимуляции – ЭФР (Sigma-Aldrich, США). Для исследований in vivo использовались самцы мышей весом 25г линии C-B17.SCID (Jackson Laboratory, США).

Трансфекция клеток при помощи миРНК. Для проведения трансфекции использовались клетки в концентрации 250 тысяч для А431 или 170 тысяч для остальных линий на лунку 6-луночного планшета в среде DMEM, содержащей 1% сыворотки теленка и L-глютамин. Для одной лунки 6-луночного планшета 1,8 мкл миРНК (20 мкМ) смешивались с 6 мкл трансфекционного реагента HiPerfect в 96 мкл безсывороточной среды DMEM. Через 30 минут инкубации при комнатной температуре раствор с образовавшимися комплексами миРНК-HiPerfect добавлялся в 1 мл 1%-ной среды DMEM с клетками до конечной концентрации миРНК 10 нМ. Через 72 часа после трансфекции происходил полный нокдаун гена и клетки были готовы для проведения экспериментов. В экспериментах с использованием блокаторов через 48 часов начала после трансфекции к клеткам добавлялись лекарственные вещества. Также через двое суток среда клеток сменялась на бессывороточную DMEM для уменьшения процессов везикулярного транспорта и концентрации рецептора ЭФР на поверхности клеток.

Анализ экспрессии белка методом иммуноблотинга. Клетки сажались в концентрации 250 тысяч для А431 или 170 тысяч для остальных линий на лунку 6-луночного планшета в среде DMEM, содержащей 10% сыворотки теленка и L-глютамин. Через 24 часа инкубации клетки стимулировались 100 нг/мл ЭФР в бессывороточной среде. По окончании стимуляции клетки помещались на лед для остановки всех внутриклеточных процессов, отмывались два раза в натрий-фосфатном буфере и лизировались в 50 мкл буфера RIPA с добавлением ингибиторов протеаз и фосфатаз на лунку 6-луночного планшета. Клетки соскабливались клеточным скребком и полученные лизаты помещались в пробирки. Далее лизаты центрифугировались на скорости 13,000 g в течение 30 минут для осаждения нерастворенных частиц. В полученных супернатантах измерялся уровень белка по методу Лоури, после чего концентрации белка уравнивались путем добавления лизирующего буфера в более концентрированные образцы до концентрации наиболее разбавленного. После этого лизаты кипятились в растворе 2%-ного додецилсульфата натрия в течение пяти минут для полной денатурации белков. Полученные образцы разгонялись методом электрофореза при 120В на градиентном (4-12%) полиакриламидном геле. Белки с геля переносились на поливинилиденфторидную (PVDF) мембрану с помощью электроблоттинга при напряжении 30 В в течение 4-10 часов. Мембрана блокировалась в течение часа в блокирующем буфере Odyssey, после чего инкубировалась с первичными антителами в конечной концентрации 100 нг/мл в течение 12-24 часов при +4^оC. Затем мембрана отмывалась три раза по пять минут в трис-боратном буфере, содержащим 0.05% Твин-20, и в течение часа при комнатной температуре инкубировалась с вторичными антителами, меченными флуоресцентной меткой, в конечной концентрации 1 мкг/мл. После трех отмывок мембрана сканировалась на сканнере Licor Odyssey Scanner.

Анализ выживаемости клеток. Для анализа выживаемости клетки сажались в 96-луночные планшеты в концентрации 3 тысячи клеток на лунку. миРНК трансфекция проводилась описанным выше способом. Через 24 часа после трансфекции к клеткам добавлялось 10 мкл среды, содержащей 10-кратное количество лекарственных веществ. После этого клетки инкубировались в течение трех дней. Через 96 часов после трансфекции к клеткам добавлось 10 мкл на лунку реагента CellTiter Blue. Живые клетки метаболизируют входящий в состав реагента ресазурин, восстанавливая его до флуоресцентного ресоруфина. Через два часа после добавления реагента флуоресценция клеток считывалась при помощи спектрофотометра на длине волны 573 нм. Интенсивность сигнала была прямо пропорциональна количеству жизнеспособных клеток в лунке.

Анализ апоптоза. Анализ клеточной гибели проводился по методу мечения апоптотических клеток красителем аннексином V. Через 48 часов после трансфекции к клеткам SCC61 в 6-луночном планшете добавлялся эрлотиниб в рабочей концентрации. Через 72 часа клетки трипсинизировались, ресуспендировались и окрашивались аннексином V, меченным зеленой меткой, и 7-амино-актиномицмном, меченным красной меткой. Результаты считывались при помощи проточного цитометра.

Иммунопреципитация и анализ убиквитинилирования рецептора ЭФР. Через 72 часа после трансфекции клетки лизировались в буфере RIPA. Очищенные центрифугированием и нормализованные на уровень белка лизаты растворялись в 0.5 мл натрий-фосфатного буфера и инкубировались с 10 мкл антител к рецептору ЭФР в течение 12 часов при +4^оC при постоянном вращении. Затем к лизатам добавлялось 20 мкл протеин-G-конъюгированных агарозных бус и инкубировалиьс в течение 2 часов при +4^оC при постоянном вращении. Бусы осаждались центрифугированием при 3,000 g и отмывались в натрий-фосфатном буфере три раза, после чего кипятились в растворе додецилсульфата натрия в течение пяти минут для отщепления белков от бус и их денатурации. Суспензия бус центрифугировалась при 10,000 g и полученный супернатант подвергался анализу иммуноблоттингом по описанному выше протоколу. После переноса белков мембрана окрашивалась антителами к убиквитину и рецептору ЭФР в качестве контроля преципитации.