Роль аполипопротеина а-i и аполипопротеина е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре нормальных и опухолевых гепатоцитов
Скачать 203.63 Kb.
|
На правах рукописиКНЯЗЕВРОМАН АЛЕКСАНДРОВИЧРОЛЬ АПОЛИПОПРОТЕИНА А-I И АПОЛИПОПРОТЕИНА Е В РЕГУЛЯЦИИ БИОСИНТЕЗА БЕЛКА И НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ В КУЛЬТУРЕ НОРМАЛЬНЫХ И ОПУХОЛЕВЫХ ГЕПАТОЦИТОВ 03.00.04 - биохимия АВТОРЕФЕРАТдиссертации на соискание ученой степеникандидата биологических наукНовосибирск – 2007Работа выполнена в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Научный руководитель: академик РАМН Панин Лев Евгеньевич Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор Поляков Лев Михайлович Официальные оппоненты: доктор медицинских наук, профессор Колпаков Аркадий Ростиславович доктор биологический наук, профессор Гуляева Людмила Федоровна Ведущая организация: Государственное учреждение Научный центр клинической и экспериментальной медицины Сибирского отделения Российской академии медицинских наук (Новосибирск) Защита состоится «17» апреля 2007 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д 001.034.01 в Государственном учреждении Научно-исследовательском институте биохимии СО РАМН по адресу: 630117, Новосибирск, ул. Академика Тимакова, 2; тел.: 8-3832-33-54-81). С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Государственного учреждения Научно-исследовательского института биохимии Сибирского отделения Российской академии медицинских наук Автореферат разослан «___» ___________ 2007г. Ученый секретарь диссертационного совета Русских Г. С.  ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность темы. Известно, что липопротеины и их белковые компоненты участвуют в регуляции многих метаболических процессов. Среди которых можно выделить следующие. Аполипопротеины апоА-I и апоЕ осуществляют регуляцию обмена холестерина не только в плазме крови, но и посредством рецепторов внутри клетки за счет активного его выведения с помощью встроенных в мембрану специфических транспортных белков: АТР-связывающего кассетного транспортера (АВСА1) и мембранного рецептора для ЛПВП - скевенджер-рецептора класса В1 (Borst P., Elfehnk R.O., 2002; Wei C. e.a.,2005). Аполипопротеины оказывают влияние на функцию эндокринной системы, в частности, на стероидогенез; апоЕ является одним из регуляторов клеточного иммунитета; аполипопротеины способны связывать и транспортировать в клетку различные по структуре соединения (Поляков Л.М., Панин Л.Е., 2000). Имеются сообщения о регуляции аполипопротеинами генетического аппарата клетки. Это подтверждается в серии работ Института биохимии СО РАМН под руководством академика РАМН Л.Е. Панина. Действительно, в ядрах гепатоцитов крыс были обнаружены аполипопротеины А-I и Е. Оба белка присутствовали во фракции кислых негистоновых белков, принимающих участие в регуляции экспрессии генов. Оказалось, что аполипопротеин А-I способствует повышению транскрипционной активности хроматина. Были вскрыты и молекулярные механизмы этого процесса. Показано, что аполипопротеин А-I в комплексе с восстановленными формами стероидных гормонов взаимодействует с GC-богатыми участками ДНК. При этом восстановленная 4–3-кетогруппа А-кольца стероидных гормонов инициирует разрыв в GC-парах водородных связей. В дальнейшем разрыв увеличивается за счет гидрофобного взаимодействия между азотистыми основаниями и гидрофобными участками аполипопротеина А-I. С образовавшимися одноцепочечными участками ДНК взаимодействует РНК-полимераза, которая и запускает экспрессию генов с последующей активацией биосинтеза белка (Panin L.E. e.a., 1998; 2000). Другим регуляторным белком является аполипопротеин Е. Он известен, как ингибитор пролиферации некоторых типов клеток, включая опухолевые (Vogel T. e.a., 1994). Показано, что аполипопротеин Е повышает экспрессию мРНК перлекана, основного протеогликана в семействе гепарансульфатов, который и опосредует антипролиферативный эффект аполипопротеина Е в культуре крысиных и человеческих гладкомышечных клеток аорты (Paka L. e.a., 1999). По данным Хоу и соавторов (2001), аполипопротеин Е ингибировал стимулированную сывороткой пролиферацию эмбриональных фибробластов крыс, при этом в бессывороточной среде аполипопротеин Е увеличивал рост клеток, продлевая G1-фазу клеточного цикла. Аполипопротеин Е усиливал рост первичных нейронов через сигнальную функцию ЛПНП-подобного рецептора (LRP, lipoprotein receptor-related protein) (Qui Z. e.a., 2004). Отмечена способность аполипопротеина Е ингибировать сосудистую гиперплазию при воспалении, вызванном денудацией эпителия сонных артерий у мышей (Moore, Z.W., Hui D.Y., 2005). Результаты исследования эффекта аполипопротеина Е на клетки человеческой аденокарциномы НТ29 и распределение -катенина позволяют предположить, что данный белок участвует в сохранении межклеточных взаимодействий, ингибируя рост опухолевых клеток (Niemi M. e.a. 2002). В дополнение к этому, показано, что аполипопротеин Е снижает экспрессию генов канонического, или зависимого от -катенина Wnt-сигнального пути (Caruso A. e.a. 2006), конститутивная активация которого играет важную роль в канцерогенезе (Taipale J. e.a., 2001). Перечисленные работы о регуляторных эффектах аполипопротеинов А и Е позволили высказать предположение о существовании у этих белков конкурентных взаимоотношений в регуляции процессов внутриклеточной регенерации и пролиферации. В связи с этим, целью настоящего исследования являлось изучение роли аполипопротеинов А-I и Е в регуляции биосинтеза белка и нуклеиновых кислот в культуре нормальных и опухолевых гепатоцитов. Задачи исследования:
Научная новизна. Методами ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и тушения флуоресценции показано, что при образовании комплексов липопротеинов со стероидными гормонами и их метаболитами принимает участие белковый компонент. Основным аполипопротеином, участвующим в процессе комплексообразования является аполипопротеин А-I. Полученные константы ассоциации комплексов белок-лиганд свидетельствуют о достаточно высоком сродстве. На культуре гепатоцитов крыс показано, что комплексы аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом и прегненолоном обладают высокой биологической активностью, усиливая скорость биосинтеза белка. Принципиально важную роль в этом процессе играет восстановленная 4–3-кетогруппа кольца А стероидных гормонов. На культуре гепатоцитов крыс показано, что аполипопротеин Е проявляет конкурентный эффект по отношению к комплексу аполипопротеин А-I-тетрагидрокортизол и снижает увеличение скорости биосинтеза ДНК, РНК и белка, определяемую по включению радиоактивной метки. Впервые на модели асцитной гепатомы Эрлиха показано, что опухолевые макрофаги играют ключевую роль в образовании биологическиактивных комплексов аполипопротеина А-I со стероидными гормонами, которые в свою очередь увеличивают скорость биосинтеза белка в клетках асцитной гепатомы. Аполипопротеин Е подавлял биологическую активность комплекса, что отражалось в снижении скорости биосинтеза белка. Теоретическая и практическая значимость. Решение поставленных в диссертации задач является важным этапом в исследовании молекулярных механизмов межклеточных взаимодействий связанных с регуляцией экспрессии генов. Установление характера и степени связывания (аффинитета) липопротеинов со стероидными гормонами и их метаболитами важны для оценки роли изучаемых комплексов в регуляции важнейших внутриклеточных процессов. В результате проведенных исследований, описан неизвестный ранее механизм регуляции биосинтеза ДНК, РНК и белка – процесс, основанный на конкурентных взаимоотношениях между аполипопротеином Е и комплексом аполипопротеином А-I-стероид. Результаты работы свидетельствуют о том, что макрофаги занимают ключевые позиции в регуляции процессов регенерации и клеточной пролиферации. Эти межклеточные взаимодействия проявляют себя не только в нормальных тканях, но и в системе –макрофаг-опухолевая клетка. Показано, что в основе этих взаимоотношений также лежит способность макрофагов образовывать биологически активные комплексы восстановленных форм стероидных гомонов с аполипопротеином А-I. Однако способность к синтезу и секреции аполипопротеина Е у них снижена, что имеет принципиальное значение в противоопухолевой защите организма. Понимание тонких механизмов взаимоотношений макрофаг-опухолевая клетка может служить основой для повышения эффективности методов коррекции у онкологических больных. Положения, выносимые на защиту:
Апробация материалов диссертации. Материалы диссертационного исследования доложены на I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005). Публикации. По материалам диссертации опубликованы 3 работы, из них 2 статьи. Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4-х глав, включающих обзор литературы, материалов и методов, результатов исследований, обсуждения, выводов и списка литературы, включающих 30 отечественных и 172 зарубежных источников. Материалы диссертации изложены на 132 страницах машинописного текста. Работа иллюстрирована 9 таблицами и 16 рисунками. Диссертация выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Института биохимии СО РАМН. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙИсследования были проведены на крысах линии Вистар массой 180-200 г, мышах линии СВА массой 15-20 г, полученных из вивария СО РАМН (Новосибирск). Содержание, питание, уход за животными и выведение их из эксперимента осуществляли в соответствии с требованиями «Правил проведения работ с использованием экспериментальных животных» (Приложение к приказу МЗ СССР от 12.08.1977 г № 755). В работе использовались следующие методы:
Результаты экспериментов обработаны методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. При обработке экспериментальных данных использовали пакет прикладных программ Microsoft office (США). РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕСвязывание стероидных гормонов и их метаболитов отдельными классами ЛП и их белковыми компонентами, мы изучали с использованием методов ультрацентрифугирования, гель-фильтрации и флуоресцентной спектроскопии. Полученные методом ультрацентрифугирования данные показали, что связывание меченых стероидов с липопротеиновыми фракциями в целом оказалось на уровне 34-42%. Основная часть метки находилась во фракции белков инфранатанта. Однако нельзя не учитывать и тот факт, что в инфранатанте находится значительная часть аполипопротеинов, не связанных с липидами. Это, так называемый, "свободный пул" аполипопротеинов, который также может вносить свой вклад в связывание стероидов. Высокая специфичность и чувствительность флуоресцентных методов позволяет их широко применять для анализа взаимодействий типа "рецептор-лиганд". Метод белковой флуоресценции позволяет обнаружить зависимость спектральных характеристик хромофорных групп (триптофанилов) от конформационного состояния молекул белка. Считается, что триптофан является естественной "меткой-репортером", поэтому исследование параметров его флуоресценции дает представление о характере взаимодействий, в частности, при образовании комплексов белок-стероид. Анализ взаимодействия ЛП со стероидными гормонами показал, что наибольшее снижение флуоресценции было для частиц ЛПВП (55-65%). Менее выраженным данный эффект был для ЛПОНП (30-35%) и для ЛПНП (15-20%). При этом форма спектров, их полуширина практически не изменялись. В частицах ЛПВП основным структурно-функциональным белком является апоА-I. В связи с этим, изучали связывание стероидов хроматографически очищенным апоА-I. На рис. 1. приведены кривые тушения триптофановой флуоресценции апоА-I при образовании комплексов с тетрагидрокортизолом. Тушение составило 29%. На рис. 2. приведены кривые тушения триптофановой флуоресценции апоА-I при образовании комплексов с прегненолоном. Тушение составило 20%. Изучение временной зависимости тушения флуоресценции при одномоментном добавлении насыщающих количеств стероидов показало, что полное насыщение связывающих областей ЛП-частиц гормонами происходит уже через 30 мин от начала опыта.  Рис. 1. Спектры триптофановой флуоресценции апоА-I при комплексообразовании с тетрагидрокортизолом. (  ) – апоА-I (исходный спектр); (  ) – апоА-I + тетрагидрокортизол (через 60 мин); Рис. 2. Спектры триптофановой флуоресценции апоА-I при комплексообразовании с прегненолоном. ( ) – апоА-I (исходный спектр); (  ) – апоА-I + прегненолон (через 60 мин).В таблице 1. представлены константы связывания различных стероидов с ЛП фракциями и изолированного апоА-I, полученные на основе кривых тушения триптофановой флуоресценции. Константы ассоциации комплексов белок-лиганд (106 М-1) свидетельствуют о достаточно высоком сродстве, поэтому связывание можно назвать специфическим. Таблица 1. Константы ассоциации для комплексов липопротеин-стероид на основании кривых тушения флуоресценции триптофана.
Для изучения комплексообразования апоА-I c прегненолоном мы исполоьзовали также метод гель-фильтрации. Хроматографию проводили на сефадексе G-25. На колонку одновременно нанесли хроматографически чистый апоА-I и 14С-прегненолон, при этом белок выходил отдельным пиком без регистрации радиоактивности. Затем инкубация апоА-I с 14С-прегненолоном на выходе показала присутствие метки во фракции белка. Что подтверждает данные по тушению триптофановой флуоресценции о процессе комплексообразования апоА-I-гормон. Присутствие 1000-кратного избытка немеченого прегненолона практически вытесняло меченый, что также позволяет говорить о специфичности связывания гормон-белок. Для выяснения закономерностей в регуляции экспрессии генов, связанных с усилением биосинтеза белка, были проведены исследования в двух независимых парах стероидных гормонов. Первая пара представляет гормоны пучковой зоны коры надпочечников. Это кортизол и его восстановленная форма – тетрагидрокортизол. Разница между ними заключается в том, что у последнего гормона 4–3-кетогруппа А-кольца восстановлена. Гидроксил в 3-м положении ТГК находится в транс-позиции. Вторая пара гормонов – прогестерон и прегненолон. По структуре А-кольца первый гормон полностью соответствует кортизолу, а второй - тетрагидрокортизолу, только оксигруппа в 3-м положении у прегненолона находится в цис-позиции. Проведены нами исследования показали, что в паре кортизол – тетрагидрокортизол только комплекс апоА-I-ТГК значительно усиливал скорость биосинтеза белка в гепатоцитах по сравнению с контролем (табл. 2). Кортизол, комплекс апоА-I-кортизол и ТГК не вызывали достоверных изменений по сравнению с контролем. Таблица 2. Изменение скорости биосинтеза белка в гепатоцитах крыс (M±m)
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,001) # - достоверное различие по сравнению с комплексом апоА-I-ТГК (р < 0,05) Результаты в паре прогестерон – прегненолон оказались схожими, биологической активностью обладал комплекс апоА-I-прегненолон, который имеет восстановленную окси группу в А кольце, он значительно усиливал биосинтез белка, тогда как комплекс апоА-I-прогестерон не изменял скорость включения 14С-лейцина по сравнению с контролем (табл. 3). Таблица 3. Изменение скорости биосинтеза белка в гепатоцитах крыс (M±m)
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,001) # - достоверное различие по сравнению с комплексом апоА-I– прегненолон (р < 0,001) Сами прогестерон и прегненолон также не вызывали достоверных изменений по сравнению с контролем. Проведенные исследования говорят о том, что в комплексе с апоА-I биологической активностью обладает не только восстановленная форма кортизола - тетрагидрокортизол, но и соответствующий ему по структуре А-кольца прегненолон. Считаем, что в повышении скорости биосинтеза белка в гепатоцитах принципиально важную роль играет восстановленная 4–3-кетогруппа стероидных гормонов. Ранее уже было показано, что комплекс апоА-I с тетрагидрокортизолм обладает биологической активностью, которая заключается в усилении экспрессии генов и увеличении скорости биосинтеза ДНК, РНК и белка. Исходя из литературных данных о регуляторных эффектах апоЕ, мы предположили, что этот белок может играть роль отрицательной обратной связи в данном механизме усиления биосинтеза белка и нуклеиновых кислот. Проведенные нами исследования показали, что апоЕ полностью подавлял повышение биосинтеза ДНК, РНК и белка, вызванное действием комплекса апоА-I– ТГК (табл. 4). Таблица 4. Изменение скорости биосинтеза ДНК, РНК и белка в гепатоцитах (M±m)
* - достоверное различие по сравнению с контролем (р < 0,01) # - достоверное различие по сравнению с комплексом апоА-I – ТГК (р < 0,01) В отсутствии комплекса апоА-I-ТГК в среде инкубации апоЕ не оказывал влияния на биосинтез белка и РНК, но снижал скорость включения меченого тимидина в ДНК в 1,6 раза по сравнению с контролем. Таким образом, между комплексом апоА-I–ТГК и апоЕ существуют конкурентные взаимоотношения. Они проявляются в том, что комплекс апоА-I–ТГК усиливает синтез ДНК, РНК и белка в гепатоцитах, в то время как апоЕ полностью снимает эффект комплекса. В НИИ биохимии СО РАМН было показано, что клетки Купфера фагоцитируя продукты клеточной деградации, кооперативно с помощью рецептор-опосредованного эндоцитоза захватывают ЛПВП3 и стероидные гормоны. ЛПВП3 во вторичных лизосомах подвергаются дезинтеграции с образованием апоА-I, а стероидные гормоны восстанавливаются при участии - и -редуктаз с образованием тетрагидросоединений. Полученные продукты образуют биологически активный комплекс, который сначала попадает в интерстициальное пространство, а затем в ядра гепатоцитов, где и усиливает экспрессию генов. Мы изучали этот процесс на культуре клеток асцитной гепатомы Эрлиха. Полученные данные показали, что добавление ЛПВП и кортизола увеличивала скорость биосинтеза белка в сокультуре клеток асцитной гепатомы и опухолевых макрофагов (табл.5). Добавление ЛПВП и кортизола в культуру без прилипающих клеток не вызывало достоверных изменений по сравнению с контролем. Что подтверждает данные, полученные ранее на нормальных клетках Купфера (Усынин И.Ф. 1996). У нас была задача изучить роль апоЕ в данном механизме, предположительно, он должен играть роль отрицательной обратной связи, снимая биологический эффект комплекса апоА-I-тетрагидрокортизол образованного в макрофагах. Полученные данные показали – апоЕ действительно ингибировал эффект комплекса апоА-I-ТГК (табл. 5). Таблица 5. Изменение скорости биосинтеза белка в клетках асцитной гепатомы Эрлиха (M±m)
* - достоверное различие по сравнению с группой 1 (р < 0,05) # - достоверное различие по сравнению с группой 2 (р < 0,05) Мы провели аналогичное исследование еще на одном стероиде-прогестероне. Предположительно в макрофагах окси группа в А кольце прогестерона может восстанавливаться с образованием предшественника прогестерона – прегненолона, который в свою очередь образует комплекс с основным компонентом ЛПВП – апоА-I. Этот комплекс и должен усиливать экспрессию генов в клетках гепатомы. Полученные данные показали увеличение скорости биосинтеза белка в сокультуре под действием ЛПВП и прогестерона (табл. 6). Добавление ЛПВП и прогестерона в культуру клеток гепатомы Эрлиха без прилипающих клеток не вызывало эффекта. Инкубация клеток в присутствии ЛПВП, кортизола и апоЕ также не оказывало эффекта на изменение биосинтеза белка. Таблица 6. Изменение скорости биосинтеза белка в клетках асцитной гепатомы Эрлиха (M±m)
* - достоверное различие по сравнению с группой 1 (р < 0,05) # - достоверное различие по сравнению с группой 2 (р < 0,05) Таким образом, на культуре асцитной гепатомы Эрлиха было показано, что в процессе образования биологически активного комплекса ключевая роль принадлежит макрофагам, что подтверждается серией работ выполненных в Институте биохимии под руководством академика РАМН Панина Льва Евгеньевича (Панин Л.Е., 1998). Аполипопротеин Е принимает участие в подавлении биологических эффектов комплекса аполипопротеина А-I с тетрагидрокортизолом и, предположительно, комплекса аполипопротеина А-I с прегненолоном в культуре клеток асцитной гепатомы Эрлиха. ВЫВОДЫ
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ.
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Добавить документ в свой блог или на сайт
Похожие:
 | Тема: «Нарушение обмена нуклеиновых кислот» Нарушения обмена нуклеиновых кислот: редупликации и репарации днк, синтеза информационной, транспортной и рибосомальной рнк | | Роль биосинтеза стеролов в чувствительности опухолевых клеток к блокаторам... Работа выполнена на кафедре биохимии фгаоу впо «Казанский (Приволжский) федеральный университет» |
| Конспект урока по биологии на тему: «Нуклеиновые кислоты» Образовательные: Дать знания о нуклеиновых кислотах, раскрыть особенности строения нуклеиновых кислот: ДНК и рнк; определить черты... | | Программа-минимум кандидатского экзамена по специальности 03. 00.... В основу настоящей программы положены следующие разделы: структура и функции белков; структура и биосинтез нуклеиновых кислот; структура... |
| Т. Г. Заболотская лабораторная диагностика Молекулярно-биологические методы: выявление и идентификация вирусных нуклеиновых кислот | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Сформировать знания об основных этапах процесса биосинтеза белка: транскрипции и трансляции |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Проверить качество усвоения знаний о механизмах метаболизма клетки, на осмысление и осознание биосинтеза белка | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель урока: изучение сущности пластического обмена как одного из важнейших процессов жизнедеятельности клеток – биосинтеза белка |
 | Развитие технологий секвенирования ... | | Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Задачи: раскрыть ведущую роль белков в строении и жизнедеятельности клетки; объяснить строение макромолекул белка, углубить знания... |
| 1 Центральная нервная система и ее роль в регуляции физиологических функций Первый введение посвящен характеристике предмета физиологии ее связи с другими науками, основным понятиям физиологии и регуляции... | | Регуляция I и II типов программированной клеточной гибели т-лимфоцитов... Работа выполнена в нил биохимии нуклеиновых кислот кафедры биохимии фгаоувпо «Казанский (Приволжский) федеральный университет», г.... |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Цель: обобщение и углубление знаний учащихся о строении и функциях нуклеиновых кислот; развить познавательный интерес, реализуя межпредметные... | | Урок изучения нового материала. Методы: частично-поисковый, объяснительно-иллюстративный.... Обучающие: сформировать представление о процессе биосинтеза белка, как сложнейшем многоступенчатом процессе, протекающем в живой... |
| 8-800-700-06-61 (звонок по России бесплатный) Вода после присутствия в ней пантов приобретает терапевтические свойства в следствии того, что в нее переходит биологически-активные... | | Программа курса «Основы цитологии и гистологии» Вторую половину ХХ века некоторые ученые называют “золотым веком биологии”. Так как за последние 30 лет было совершено ряд чрезвычайно... |
