Публикации
Основные положения диссертационной работы нашли отражение в 58 научных публикациях, в т. ч. в журналах, рекомендованных ВАК для публикации материалов докторских диссертаций - 21, монографиях - 2, пособиях для врачей - 3, из них утвержденных УМО по медицинскому и фармацевтическому образованию вузов России - 1, методических рекомендациях для врачей-1, базах данных, получивших Свидетельства РОСПАТЕНТа – 4.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов собственных исследований, отраженных в 7 главах, главы обсуждения полученных материалов, выводов, списка использованных источников литературы. Работа изложена на 302 страницах, иллюстрирована 112 рисунками и 25 таблицами. Список литературы содержит 398 работ, из них 295 отечественных и 103 зарубежных авторов.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы
В работе представлены результаты изучения УПЭ, выделенных от детей, больных ОКИ, поступивших на лечение в Иркутскую областную инфекционную больницу; от здоровых детей, посещающих детские дошкольные учреждения (2006-2010 гг.); из вод крупнейших водоемов Восточной Сибири и Севера: река Ангара (Иркутская область), река Лена на всей ее протяженности, от верховья (Иркутская область) до впадения в море Лаптевых (Республика Саха (Якутия) (1999-2008 гг). Анализ заболеваемости острыми кишечными инфекциями, в т.ч. обусловленной УПЭ, проводили по материалам Управления Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Иркутской области (2000-2010 гг.); клинического течения ОКИ - с использованием медицинской карты стационарного больного (2006-2010 гг.). Объем выполненных исследований приведен в таблице 1.
Таблица 1
Объекты и объем выполненных исследований
Направление исследований
|
Количество
|
копрофильтраты детей
|
водные объекты
|
всего
|
больные ОКИ
|
здоровые
|
Антибиотикоустойчивость
|
1695
|
128
|
8518
|
10341
|
Антилизоцимная активность
|
924
|
128
|
504
|
1556
|
Продукция ДНК-азы
|
924
|
128
|
504
|
1556
|
Гемолитическая активность
|
924
|
128
|
504
|
1556
|
Адгезивная активность
|
924
|
128
|
504
|
1556
|
Протеолитическая активность
|
924
|
128
|
504
|
1556
|
Продукция фосфатазы
|
924
|
128
|
504
|
1556
|
Молекулярно-генетические
исследования (кол-во штаммов/кол-во исследований)
|
175/1050
|
65/390
|
89/623
|
329/2063
|
Определение вирулентности (внутрибрюшинная проба) (кол-во штаммов/кол-во животных)
|
15/45
|
5/15
|
9/27
|
29/87
|
Экспериментальные исследования по количественному определению ферментативной активности УПЭ
|
168
|
«-»
|
168
|
336
|
Экспериментальные исследования по определению способности образовывать биопленки
|
240
|
120
|
120
|
480
|
Анализ заболеваемости острыми кишечными инфекциями (2000-2010 гг.)
|
|
|
|
инф.бюллетени-14
|
Анализ многолетней динамики частоты встречаемости УПМ (2000-2010 гг.)
|
|
|
|
штаммы УПМ - 5924
|
Анализ клинического течения ОКИ (2006-2010 гг.)
|
|
|
|
ст.уч.ф. №0003/у-931
|
Прим.: «-»-исследования не проводились
Отбор проб воды, фильтрацию через мембранные фильтры, выделение культур микроорганизмов, их идентификацию проводили по общепринятым методикам (Приказ МЗ СССР № 535 от 22.04.85; «Энтеробактерии»…, 1985; Краткий определитель Берджи, 1997; Поздеев О.К., 2002; Марри П.Р., 2006). Биохимические свойства микроорганизмов определяли с помощью коммерческих тест-систем «Enterotest» фирмы Lachema (Чехия). Для выборочной идентификации использовали баканализатор Sceptor (Becton Dickinson, USA). Определение щелочной фосфатазы, продукции ДНК-азы, протеолитической и гемолитической активности осуществляли согласно стандартным методам («Частная медицинская микробиология…» под ред. А.С. Лабинской, 2005), адгезивной активности - по методу С.С. Гизатулиной с соавт. (Способ оценки…, 1991), персистентных свойств - по методике О.В.Бухарина (Бухарин О.В., 1999; Метод. рекомендации…, 2001). Определение антибиотикорезистентности микроорганизмов и оценку результатов проводили согласно МУК 4.2.1890-04.
Оценку вирулентности in vivo проводили по способности вызывать гибель белых мышей путем введения в/б 0,5 мл суспензии белым мышам в количестве трех для каждой бактериальной культуры, отмечая изменения через 6, 24, 48 и 72 часа и 10 суток (Методические указания…, 1999). Эксперименты выполняли на беспородных белых мышах (весом 14-15 г) в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных", утвержденными МЗ СССР (1977г.), «Международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных» (1986г.).
Для определения количественных показателей ферментативной активности исследуемые микроорганизмы культивировали при нескольких температурных режимах: 4оС, 24оС, 30оС и 37оС. Использовали две питательные среды: 1) необогащенная среда - физраствор, забуференный 0.1 М фосфатным буфером, или так называемая "голодная" питательная среда; 2) обогащенная среда Красильникова или полная синтетическая среда. Количественное определение ферментативной активности микроорганизмов проводили в соответствии с общепринятыми методиками: Mn-пероксидазную – по НАДН (Asada Y. et al., 1987); липазную - по олеиновой кислоте, уреазу - по мочевине (Хазиев Ф.Х., 1990). Активность каталазы определяли спектрофотометрически по убыли 0.06 М Н2О2 в растворе, содержащем Н2О2, культуральный фильтрат и 0.05 М фосфатный буфер рН 7.0.
Определение формирования биопленок штаммами условно-патогенных энтеробактерий проводили по методике И.А. Шагинян с соавт. (2007).
Молекулярно-генетические методы. Экстракцию тотальной бактериальной ДНК из бактериальных суспензий исследуемых микроорганизмов (107 КОЕ/мл) проводили согласно Методическим рекомендациям по детекции… (1998). Для ПЦР амплификации использовали стандартный набор «АмплиСенс-1» (пр-во ФГУН ЦНИИЭ Роспотребнадзора), амплификатор «Mastercycler» (фирма «Eppendorf»). Подбор температуры отжига праймеров осуществляли экспериментальным путем, а также используя данные литературы (Бондаренко В.М. с соавт., 2004; Фиалкина С.В., 2004; Жеребцова Н.Ю., 2006; Вершинин А.Е.,2008) и рекомендации НПФ «Литех». На один образец использовали 15 мкл реакционной смеси : 5-x РСR- буфер 3,0; MgSO4 – 1,0; dNTP -1,0; олигонуклеотидные праймеры – по 1,0; Tag-полимераза – 0,2; исследуемая проба- 5,0; деионизированная вода – 2,8.
Бактерии тестировали методом ПЦР на наличие генов вирулентности. Использовали праймеры к ряду генов, обнаруженных в составе «островков» патогенности E.coli, контролирующих адгезию S типа (sfaA-(F1) 5'-cggtgtgcgtagttcaat-3', (R1) 5'-cacccgcatggataaaaa-3'; sfaG-(F2) 5'-tgccgggaacacagaccatag-3', (R2) 5'-caatcttgataccgccagcattc-3') и 1 типа (fim A-(F3) 5'-сgacgcatcttcctcattcttct-3', (R3) -5'-attggttccgttattcagggttgtt-3'); продукцию гемолизинов (hlyA-(F4) 5'- cacgcgtgccgacaagtt-3', (R4)-5'- gccacatcccggaaatcaat-3'; hlyВ – (F5)-5'- cgacgtcgccttgatgata –3', (R5)-5'-tccccctgcttaatactgagat-3'); синтез железорегулируемого белка (irp-2 - (F6)-5'-gttgctgtccatcaagcacg -3', (R6)- 5'- gccggaaagcctggccttta -3'). Праймеры синтезированы в НПФ «Литех» (г. Москва). Анализ продуктов ПЦР проводили гель-электрофорезом в агарозе (камера электрофоретическая «SE-2»). Использовали агарозу производства «Sigma» (США) на трис-боратном буфере, добавляли 1% р-р бромистого этидия. Амплифицированный фрагмент идентифицировали по размеру, используя для сравнения маркер молекулярного веса ДНК Gene Ruler 100 bр DNA Ladder Plus. Результаты документировали с использованием видеосистемы гель-документирования и программы «Gel Imager».
Статистические методы. Статистическую обработку эпидемиологических данных и результатов микробиологических исследований проводили с применением общепринятых параметрических и непараметрических критериев статистики (Ашмарин Н.П. с соавт., 1962; Лакин Г.Ф., 1980; Гланц С., 1999; Савилов Е.Д. с соавт., 2004; 2011). Для анализа эпидемиологической обстановки по ОКИ применяли интегральный статистический критерий – суммарный индекс эпидемиологической ситуации (ИЭС) (Методический подход…, 2011). Для количественной оценки степени доминирования микроорганизмов, принадлежащих к различным таксономическим группам, использовали шкалу Е.Л. Любарского (Баканов А.И., 1987); для оценки микробиоценозов водных экосистем - коэффициент Серенсона (S) (Одум Ю., 1975), для определения разнообразия – индекс видового разнообразия Margalef (d) (Margalef R., 1958). Показатель «Л», характеризующий состояние системы «лизоцим-антилизоцим», определяли как соотношение числа лизоцимактивных и антилизоцимактивных микроорганизмов (Плотников А.О., с соавт., 2000). Оценку гетерогенности микробных популяций и состояния микробиоценозов водных экосистем проводили в соответствии с разработанным способом по показателю антибиотикорезистентности (ИАР) с позиции кластерной структурированности.
Результаты исследований и их обсуждение
Заболеваемость и спектр возбудителей острых кишечных инфекций у детей Иркутской области
Анализ заболеваемости ОКИ установленной этиологии в Иркутской области за период 2000-2010гг. выявил ее значимый рост (p<0,01), в т.ч. и у детей до 14 лет, что отражает эпидемиологическую ситуацию в РФ за последние годы. В возрастной структуре заболевших ОКИУЭ имело место увеличение доли детей до 14 лет (p<0,01). Одновременно отмечалось значимое повышение уровня заболеваемости ОКИ бактериальной этиологии (коэффициент регрессии +11,80/000; p<0,05). Эпидемиологическая ситуация по ОКИ бактериальной этиологии в Иркутской области достигла «порогового» уровня (0,92) в начале анализируемого периода (2000г.) и оставалась относительно стабильной до 2004 г. Ухудшение ситуации отмечено в период с 2005 по 2008 гг., когда показатели индекса эпидемиологической ситуации превышали «пороговые» значения (1,08-1,12).
Изучение спектра микроорганизмов, выделяемых при острых кишечных инфекциях, показало преобладание УПМ, которые значимо (p<0,01) превышали долю патогенов (1,5±0,1%) и вирусных агентов (43,2±1,4%) и обусловливали более половины всех ОКИУЭ (55,3±0,4%). Среди условно-патогенных возбудителей ОКИ абсолютно доминировали представители семейства Enterobacteriaceae (около 90%). Спектр условно-патогенных энтеробактерий был представлен бактериями родов Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Morganella, Hafnia, Kluyvera, Serratia, Providencia и Pantoea. На смену состава условно-патогенных энтеробактерий, в первую очередь, оказывало влияние содержание бактерий родов Proteus, Enterobacter, Citrobacter, Klebsiella, Morganella, составивших около 95% всех представителей данного семейства.
За период наблюдения (2000-2010 гг.) спектр условно-патогенных энтеробактерий, выделенных при острых кишечных инфекциях, претерпел существенные изменения, характеризующиеся значимым увеличением доли Klebsiella spp. (r=0,79; р<0,01), тенденцией к росту доли Enterobacter spp., варьированием (с тенденцией к снижению) частоты встречаемости Proteus spp., Citrobacter spp. и Morganellа spp. (рис.1).
Рис.1. Таксономический и количественный спектр условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от детей, больных острыми кишечными инфекциями, за 2000-2010 гг. (%)
Выявлены изменения в распределении УПЭ по классам доминирования. В 2000 г. в класс субдоминант (границы класса по доле от 36% до 14%) входили только энтеробактерии родов Proteus и Citrobacter, прочие представители семейства Enterobacteriaceaе (Klebsiella, Enterobacter и Morganella) относились к второстепенному классу (границы класса по доле от 14% до 6%). В конце исследуемого периода произошли существенные изменения в таксономическом составе условно-патогенных энтеробактерий, а именно: представители родов Klebsiella и Enterobacter, согласно доли бактерий каждого рода в общей численности, перешли в класс субдоминант, а Morganella – в редкий класс (границы класса по доле от 6 до 0%). Таким образом, в 2010 г. при отсутствии абсолютных доминант и доминант, спектр УПЭ, выделенных от больных острыми кишечными инфекциями, был представлен субдоминирующими бактериями родов Enterobacter, Proteus, Klebsiella и Citrobacter (табл.2).
Таблица 2
Оценка степени доминирования бактерий семейства Enterobacteriaceaе, выделенных от больных острыми кишечными инфекциями (по шкале доминирования)
Балл
|
Класс (по степени доминирования)
|
Границы классов по доле рода
|
Родовая принадлежность микроорганизма
|
2000г.
|
2010г.
|
5
|
Абсолютный доминант
|
64 < N <100
|
«-»
|
«-»
|
4
|
Доминант
|
36 < N < 64
|
«-»
|
«-»
|
3
|
Субдоминант
|
14 < N < 36
|
Proteus Citrobacter
|
Proteus
Citrobacter
Klebsiella
Enterobacter
|
2
|
Второстепенный
|
6< N <14
|
Klebsiella
Enterobacter
Morganella
|
|
1
|
Редкий
|
0< N< 6
|
другие
|
Morganella, другие
|
Прим. : «-»- отсутствие
|
