Медико-биологические аспекты конструирования биокератопротезного комплекса с использованием культивированных фибробластов

На правах рукописи ШИПУНОВА АННА ВЛАДИМИРОВНА МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ КОНСТРУИРОВАНИЯ БИОКЕРАТОПРОТЕЗНОГО КОМПЛЕКСА С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ КУЛЬТИВИРОВАННЫХ ФИБРОБЛАСТОВ 14.01.07 – глазные болезни Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук Москва - 2012 Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Министерства Здравоохранения России Научные руководители: Борзенок Сергей Анатольевич доктор медицинских наук Васильев Андрей Валентинович доктор биологических наук Официальные оппоненты: Зуев Виктор Константинович доктор медицинских наук, профессор, заведующий отделом хирургии хрусталика и интраокулярной коррекции ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н.Федорова» Минздрава России Калинников Юрий Юрьевич доктор медицинских наук, врач-офтальмолог ФГБУ Клинической больницы Управления делами Президента РФ Ведущая организация: ФГБУ «МНИИ Глазных болезней им. Гельмгольца» Министерства Здравоохранения России Защита состоится «3» декабря 2012 г. в 14 часов на заседании диссертационного совета Д.208.014.01 при ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России по адресу: 127486, г. Москва, Бескудниковский бульвар, д. 59А. С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России Автореферат разослан «2» ноября 2012 г. Ученый секретарь диссертационного совета, доктор медицинских наук В.В. Агафонова Список сокращений БКПК Биокератопротезный комплекс СЭМ Сканирующая электронная микроскопия ВКМ Внеклеточный матрикс ФБ Фибробласты КПК Кератопротезная конструкция ЭТС Эмбриональная телячья сыворотка МФБ Миофибробласты DMEM Среда Игла в модификации Дульбекко ОПК Опорная пластинка кератопротеза UVA Ультрафиолет - А ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ Актуальность проблемы По данным Всемирной организации здравоохранения в 2010 году заболевания роговицы явились причиной слепоты 8-ми млн человек (World Health Organization, 2011). Пересадка роговицы при бельмах IV-V категории (по классификации В.П. Филатова и Д.Г. Бушмич, 1947) является неэффективной вследствие развития различного рода осложнений иммунного генеза, приводящих к помутнению трансплантата. Единственным способом восстановления зрения пациентам с такими бельмами остается протезирование роговицы (Филатов В.П.,1934; Гундорова Р.А., 1969; Федоров С.Н., 1969; Зуев В.К., 1974; Якименко С.А. и др., 1981, 1983, 1985; Мороз З.И., 1987; Калинников Ю.Ю., 2000, 2005; Cardona H., 1964, 1977; Barraquer J.,1965; Choyce D., 1965, 1966, 1968, 1973, 1980; Dohlman C., 1967, 1999; Hicks C., 1998). При этом существенной проблемой кератопротезирования остается сохранение имплантированного протеза в тканях бельма из-за отсутствия его истинного приживления в тканях (Гундорова Р.А., 1969; Федоров С.Н., 1969, 1982; Якименко С.А. и др., 1985; Калинников Ю.Ю., 2004; Мороз З.И., 2007; Cardona H., 1964, 1977; Barraquer J.,1965; Choyce D., 1980; Dohlman C., 1999; Hicks C., 1998). В этой связи актуальным вопросом остается создание "идеального" кератопротеза, обладающего высокими оптическими характеристиками и способного надежно интегрироваться в ткани роговицы. Эволюция кератопротезирования шла по пути совершенствования формы, размеров кератопротезов и материалов для их изготовления. Постепенно на смену ригидных гидрофобных материалов (пластик, резина) для конструирования кератопротезов пришли гидрофильные гидрогели, обладающие повышенными интегративными свойствами, способностью пропускать кислород и глюкозу, а также стимулировать эпителизацию поверхности материала после имплантации (Федоров С.Н., 1982, 1995; Калинников Ю.Ю., 2005; Dohlman C., 1999; Legeais J., 2001; Alió J., 2004; Hicks C. et al., 2006; Myung D. et al., 2008). Но, несмотря на достоинства кератопротезов таких моделей, их использование не гарантирует отсутствия таких специфических осложнений, как кератомаляция и отторжение кератопротеза (Калинников Ю.Ю., 2005; Legeais J. et al., 1991; Chirila T. et al.,1993; Hicks C.et al., 1998). Согласно ранее проводимым патогистологическим исследованиям (Федоров С.Н. и др., 1970; Панормова Н.В., Малов В.М., 1977; Пучковская Н.А.,1979; Шехтер А.Б., Розанова И.Б., 1999) имплантация в организм любого чужеродного материала, в том числе биологических тканей, вызывает стереотипную воспалительно-репаративную реакцию, приводящую к пролиферации фибробластов (ФБ), образованию коллагеновых волокон и других компонентов внеклеточного матрикса (ВКМ), формирующих соединительнотканную капсулу вокруг инородного тела. При развитии различных осложнений происходит срыв адаптивной воспалительно-репаративной реакции, связанный с нарушением межклеточных взаимодействий, способствующих нарушению нейтрофильного и макрофагального звеньев процесса, снижению количества макрофагально-фибробластических и других межклеточных контактов, что приводит к выраженному торможению пролиферативной фазы процесса (Шехтер А.Б., Серов В.В., 1991). Применение клеточных технологий сегодня позволяет замещать и восстанавливать ткани организма. Культивированные ФБ кожи человека в виде клеточных линий и в составе тканеинженерных конструкций широко используются в комбустиолоии, урологии, стоматологии и других клинических областях медицины, во многом решив проблему недостатка донорского материала (Терских В.В., Васильев А.В., 1995). Многими исследователями ведутся активные разработки по созданию "искусственной роговицы" (Griffith M.et al., 2008; Myung D.et al., 2008; Sheardown H.et al., 2008) и оптимальных способов доставки культивированных клеток в зону дефекта роговицы с целью стимуляции репаративных процессов (Васильев А.В. и др., 2000,2005; Макаров П.В., 2003; Ходжабекян Г.В., 2003; Беляев Д.С., 2009). При этом большое внимание при конструировании искусственных роговиц уделяется повышению прочностных свойств матрикса. С этой целью в конструкцию включают синтетические полимеры (Li F.et al., 2003), а также проводят рибофлавин – Ultraviolet A (UVA) - индуцированную фотохимическую сшивку коллагена (McLaughlin C.et al., 2009). Учитывая успешные результаты создания и применения тканеинженерных конструкций для замещения роговицы и восстановления ее поверхностных дефектов, стал актуальным вопрос использования достижений регенеративной медицины для создания кератопротезов нового поколения с повышенными прочностными и интегративными свойствами за счет использования прочного биополимерного каркаса и клеточных элементов, что послужило основанием к выбору цели исследования. Цель Повысить надежность приживления кератопротеза путем создания биокератопротезного комплекса, включающего кросслинкинг-модифицированную донорскую роговицу и культивированные фибробласты кожи человека Для реализации указанной цели были поставлены следующие задачи: 1. Разработать конструкцию биокератопротезного комплекса на основе кросслинкинг-модифицированной донорской роговицы и фибробластов кожи человека. 2. Изучить морфологические особенности сочетанного применения кросслинкинг-модифицированных донорских роговиц и фибробластов кожи человека в составе конструкции биокератопротезного комплекса в эксперименте in vitro. 3. Разработать на кроликах экспериментальную модель для изучения биокератопротезного комплекса. 4. Изучить медико-биологические и экспериментально-клинические закономерности приживления разработанной модели биокератопротезного комплекса в эксперименте на кроликах. Научная новизна результатов исследования 1. Впервые разработанная модель кератопротеза, названная биокератопротезным комплексом, включающая кросслинкинг-модифицированную роговицу, культивированные фибробласты кожи человека и кератопротез модели Федорова-Зуева, позволила в эксперименте избежать развития специфических осложнений при имплантации в глаза лабораторных животных (кроликов). 2. Впервые в эксперименте in vivo показано, что применение аутологичных фибробластов кожи человека в составе биокератопротезного комплекса приводит к более выраженному формированию соединительной ткани вокруг опорной пластинки кератопротеза и неоваскуляризации, чем при использовании аллогенных фибробластов. 3. Впервые установлено, что биодеградирующие желатиновые микроносители при имплантации в составе биокератопротезного комплекса, способствуют активной миграции фибробластов реципиента в полость интрастромального кармана роговицы, их трансформации в миофибробласты, и тем самым, надежно повышают приживление конструкции биокератопротеза. Практическая значимость результатов работы 1. Впервые разработаны подходы к поэтапному конструированию биокератопротезного комплекса на основе кросслинкинг-модифицированной роговицы и культуры аутологичных фибробластов кожи, состоящие в формировании кармана в строме донорской роговицы, проведении кросслинкинг-модификации коллагенового матрикса стромы, введении в полость интрастромального кармана опорной пластинки кератопротеза Федорова-Зуева и культивированных фибробластов кожи на желатиновых микроносителях с последующим инкубированием конструкции в течение 7-ми суток перед имплантацией. 2. Впервые показано, что кросслинкинг-обработка донорских роговиц, невостребованных для кератопластики, повышает плотность упаковки коллагеновых пластин стромы, способствует повышению устойчивости ткани к протеолитическим ферментам слезы, водянистой влаги и интервенции активных макрофагов, что позволяет использовать их в качестве матрицы биокератопротезной конструкции. 3. Впервые показано, что изучение особенностей приживления биокератопротезного комплекса возможно в эксперименте in vivo на глазах лабораторных животных (кроликов) в виде имплантации в интрастромальный карман роговицы в четвертой части биокератопротезной конструкции. Основные положения, выносимые на защиту 1. Новое поколение клеточно-тканевой биоинженерной конструкции кератопротезов - биокератопротезный комплекс, обладает повышенными прочностными свойствами, устойчивостью к протеолитическим ферментам слезы, водянистой влаги и интервенции активных макрофагов за счет использования в качестве биополимерного каркаса кросслинкинг-модифицированной аллогенной донорской роговицы, культивированных фибробластов кожи на желатиновых микроносителях, способствующих развитию репаративных процессов в строме и полости интрастромального кармана. 2. В эксперименте in vivo показано, что имплантация биокератопротезного комплекса повышает надежность его биологического приживления в глазах экспериментальных животных (кроликов) и обеспечивает профилактику специфических осложнений за счет активного формирования соединительнотканной капсулы вокруг опорной пластинки кератопротеза, интенсивной неоваскуляризации и пролиферации аутологичных фибробластов в полости интрастромального кармана. Апробация работы Основные положения диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях ФГБУ МНТК «МГ» им. акад. С.Н.Федорова (Москва, 2010, 2012), V Всероссийской научной конференции молодых ученых «Актуальные проблемы офтальмологии» (Москва, 2010), V Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2010), Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (Москва, 2010), IX Всероссийской научной конференции с международным участием «Федоровские чтения» (Москва, 2011) и X Всероссийской научной конференции с международным участием «Федоровские чтения» (Москва, 2012), VI Всероссийском съезде трансплантологов (Москва, 2012). На V Всероссийской научной конференции молодых ученых доклад на тему: «Биоинженерная конструкция кератопротезного комплекса с использованием культивированных фибробластов реципиента» был удостоен 1-й премии. На Всероссийской научной школе-конференции «Стволовые клетки и регенеративная медицина» (2010) доклад на тему: «Предварительные результаты конструирования биокератопротезного комплекс с использованием аутофибробластов кожи реципиента» был удостоен 3-го места. Публикации По теме диссертации опубликованы 16 печатных работ, в том числе 3 – в журналах, рецензируемых ВАК РФ. Имеется 1 патент РФ на изобретение. Структура и объем работы Работа изложена на 135-ти страницах машинописного текста, иллюстрирована 9-ью таблицами, 38-ью рисунками. Список используемой литературы включает 272 источника, из них 82 - отечественных и 190 - иностранных. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, 4-х глав, содержащих данные обзора литературы, экспериментальных исследований in vitro и in vivo, заключения, выводов, практических рекомендаций и списка используемой литературы. Экспериментальные исследования проводились на базе Центра фундаментальных и прикладных медико-биологических проблем ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (руководитель - д.м.н. С.А. Борзенок) и Лаборатории проблем клеточной пролиферации ФГБУН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук (руководитель - д.б.н., проф. В.В.Терских) совместно с к.б.н., н.с. Э.Б. Дашинимаевым. Гистологические исследования выполнены на базе лаборатории патологической анатомии и гистологии глаза ФГБУ «МНТК «Микрохирургия глаза» им. акад. С.Н. Федорова» Минздрава России (зав. Лабораторией - к.м.н. Шацких А.В.). Иммуногистохимические и цитохимические исследования осуществлялись в Лаборатории проблем клеточной пролиферации ФГБУН Института биологии развития им. Н.К. Кольцова Российской академии наук. Сканирующая электронная микроскопия выполнялась на базе лаборатории анатомии микроорганизмов ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Н.Ф. Гамалеи РАМН (руководитель д.м.н. Л.В. Диденко) совместно с к.м.н. Н.В. Шевлягиной.

Похожие:

	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Медико-биологические аспекты физической культуры и спорта: сборник статей IV научно-практической конференции студентов фгбоу впо...		А ажипа Я. И. Медико-биологические аспекты применения метода электронного... Данная рабочая программа курса «История древнего мира» предназначена для учащихся 5 класса средней общеобразовательной школы, изучающих...
	1 Становление первобытного общества и первобытного врачевания России; философия; основные медико-биологические и клинические дисциплины. Программа разработана Российским Университетом дружбы...		1 Становление первобытного общества и первобытного врачевания России; философия; основные медико-биологические и клинические дисциплины. Программа разработана Российским Университетом дружбы...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Б. 3) модуля основы природопользования (ОП), охватывающего разнообразные аспекты воздействия человека на окружающую среду, защиты...		Учебной дисциплины наименование дисциплины Устойчивое развитие Рекомендуется... Б. 3) модуля основы природопользования (ОП), охватывающего разнообразные аспекты воздействия человека на окружающую среду, защиты...
	Рабочая программа дисциплины медико-биологические основы безопасности... Целью освоения дисциплины является изучение причинно-следственных связей между качеством среды обитания и здоровьем человека, медико-биологических...		Пояснительная записка Основные цели и задачи курса. Целью дисциплины... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования
	Пояснительная записка Основные цели и задачи курса. Целью дисциплины... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования		Технологическая карта конструирования урока с использованием средств икт и оэр Рекомендуется следующая последовательность ак­туализации и проверки усвоения изученного материала
	№ урока по теме Технологическая карта конструирования урока с использованием средств информационных технологий и ресурсов Интернет		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Технологическая карта конструирования учебного занятия с использованием кейс метода
	Учебно-методический комплекс по мдк. 01. 01. Медико-биологические... Государственное бюджетное образовательное учреждение среднего профессионального образования Псковской области		Теоретические аспекты создания комплекса маркетинга организации,...
	Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Технологическая карта конструирования урока с использованием средств информационных технологий и ресурсов Интернет		Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Технологическая карта конструирования урока с использованием средств информационных технологий и ресурсов интернет