Условно-патогенные энтеробактерии: доминирующие популяции, биологические свойства, медико-экологическая значимость
Скачать 0.69 Mb.
|
Фенотипические и генотипические маркеры патогенности условно-патогенных энтеробактерий Определение фенотипических признаков у условно-патогенных энтеробактерий позволяет, во-первых, проводить мониторинг патогенности бактерий данной группы, во-вторых, является (наряду с другими) критерием их этиологической значимости. Современный уровень изучения биологических свойств микроорганизмов показывает, что, как отмечает В.М. Бондаренко (2011), количественный критерий не всегда определяет способность изолята вызывать заболевание, которое в большей степени связано с реализацией патогенного потенциала возбудителя. Для каждого вида возбудителей характерен комплекс маркеров (фенотипических и генотипических) патогенности, благодаря которым осуществляется развитие инфекционного процесса. Проведенная комплексная оценка фенотипических признаков клинических штаммов энтеробактерий, коррелирующих с их патогенностью, позволила установить, что исследуемыми фенотипическими свойствами обладала значимо большая часть (p<0,01) протестированных штаммов. При этом у 50,9±1,6% исследованных микроорганизмов отмечены персистентные свойства - антилизоцимная активность, направленная на инактивацию факторов естественной резистентности организма человека; около 40% штаммов продуцировали щелочную фосфатазу, способствующую увеличению проницаемости клеточных мембран, и обладали адгезивной активностью, направленной на прикрепление и колонизацию эпителиоцитов слизистых оболочек. Данные свойства встречались значимо чаще (р<0,05) по сравнению с другими признаками. У третьей части микроорганизмов отмечены протеолитическая и гемолитическая активность, оказывающая повреждающее действие на клеточные мембраны; у 26,5±1,4%-способность экспрессировать фермент патогенности ДНКазу, вызывающий повреждение структуры нуклеиновых кислот (рис. 2).  Рис. 2. Частота встречаемости свойств, коррелирующих с патогенностью, среди УПЭ, выделенных из фекалий больных ОКИ (%) Выявлена видовая и межродовая неоднородность клинических штаммов энтеробактерий по наличию фенотипических маркеров патогенности (рис.3).  Рис.3. Биопрофиль клинических штаммов УПЭ по фенотипическим маркерам патогенности Так, среди различных представителей энтеробактерий более высокая (p<0,05) частота встречаемости фосфатазной и протеолитической активности отмечена у штаммов Proteus spp. (при этом большим уровнем ферментативной активности обладали штаммы P.mirabilis), адгезивной активности - у штаммов Enterobacter spp. (преимущественно за счет E.aerogenes) и гемолитической - у Klebsiella spp. (данный признак среди штаммов K.pneumoniae встречался в два раза чаще, чем среди K.oxytoca). Антилизоцимная активность чаще (p<0,05) отмечалась у Klebsiella spp., Citrobacter spp. и M.morganii, продукция ДНКазы- у Klebsiella spp. и Proteus spp. Проявленная условно-патогенными энтеробактериями гетерогенность по фенотипическим маркерам позволила условно разделить их на четыре группы: 1 - штаммы, характеризующиеся наличием более двух маркеров; 2 - штаммы, с двумя маркерами; 3 - одним маркером; 4 группа - не обладающие исследованными свойствами. Установлено, что значимо чаще встречались клинические штаммы энтеробактерий, у которых отмечалось более двух фенотипических признаков (39,4±1,6%). В то же время были выделены микроорганизмы, характеризующиеся отсутствием фенотипических маркеров - 9,5±1,% (рис.4).  Рис. 4. Ранжирование клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий по наличию фенотипических признаков Среди бактерий родов Proteus и Klebsiella значимо преобладали штаммы с наличием более двух фенотипических признаков (67,1±2,6% и 54,4±3,0% соответственно), а у Enterobacter и Citrobacter - с двумя признаками (57,9±5,6% и 54,3±4,2%). Наличие самого большого комплекса (пяти из шести исследуемых) фенотипических маркеров патогенности значимо чаще выявлялось у штаммов Klebsiella spp. (8,8±1,7%). В то же время среди энтеробактерий, полученных от здоровых детей, значимо чаще отмечались штаммы четвертой группы (около 70%), пятая часть штаммов (22,7±3,7%) характеризовалась одним фенотипическим признаком; 7,8±2,4% - двумя признаками и не было выявлено штаммов с сочетанием более двух признаков. Также установлено, что спектр фенотипических признаков среди клинических штаммов энтеробактерий оказался значительно шире (пять маркеров) по сравнению со штаммами контрольной группы (два маркера). Таким образом, проведенные исследования показали, что условно-патогенные энтеробактерии, выделенные от больных ОКИ, крайне гетерогенны по наличию фенотипических признаков; среди них преобладают штаммы, которым свойственно наличие комплекса факторов патогенности, при этом каждый десятый штамм не обладает фенотипическими маркерами, необходимыми для проявления патогенности. Патогенность клинических штаммов in vivo – наиболее признанный маркер их этиологической значимости. Проведенная оценка вирулентности клинических штаммов энтеробактерий in vivo показала, что при тестировании 13 культур (K.pneumoniae -5, P.mirabilis -2, P.vulgaris -1, M.morganii-2, E.cloacae-2, С.freundii -1), обладающих комплексом фенотипических признаков, гибель 88,2% мышей наблюдалась через 24 часа, 11,8% - через 48 часов. Штаммы энтеробактерий, изолированные от больных ОКИ, характеризующиеся отсутствием маркеров патогенности, в течение 10-дневного наблюдения не вызывали гибели лабораторных животных. Штаммы энтеробактерий, выделенные от здоровых детей, характеризующиеся отсутствием маркеров патогенности, также не вызывали гибели лабораторных животных. Исследования последних лет показывают эффективность индикации у условно-патогенных энтеробактерий генетических маркеров патогенности с помощью молекулярно-генетических методов, в частности, ПЦР. В связи с этим проведено изучение наличия и распространенности генетических маркеров патогенности у клинических штаммов условно-патогенных энтеробактерий. Для определения нуклеотидных последовательностей генов, контролирующих продукцию факторов патогенности, использовали праймеры, амплифицирующие фрагменты sfaA и sfaG генов, детерминирующих продукцию фимбрий S типа, гена fimA, обеспечивающего синтез фимбрий l типа; hlyA и hlyB генов, контролирующих продукцию токсических веществ - гемолизинов; irp-2 гена, детерминирующего синтез сидерофора, участвующего в транспорте железа внутрь клетки. Тестирование коллекции из 175 штаммов УПМ показало, что у 41 изолята (23,4±3,2%) выявлены нуклеотидные последовательности генов, кодирующих фимбриальные факторы адгезии, продукцию гемолизинов и синтез железорегулируемого белка. При этом генетические детерминанты патогенности обнаружены у бактерий восьми родов (рис.5).  Рис. 5. Спектр клинических штаммов энтеробактерий с наличием генетических детерминант патогенности (в %) Установлено, что чаще встречались гемолитические детерминанты (hlyA и (или) hlyB -13,4±2,6%), вызывающие цитопатические изменения и являющиеся одним из важнейших факторов вирулентности энтеробактерий, и генетические детерминанты адгезивной активности энтеробактерий S типа и (или) 1 типа - 11,7±2,4%. Частота выявления нуклеотидных последовательностей генов, ассоциированных с продукцией гемолизинов и адгезией, оказалась значимо более высокой (p<0,01) по сравнению со встречаемостью других исследуемых генов. Так, в пуле исследуемых культур искомые ампликоны при использовании праймеров к hlyA и hlyB определены у 17 штаммов (9,7±2,2%), sfaА- 13 (7,4±1,9%); sfaG- 8 (4,6±1,5%), fim A- 4 (2,3±1,1%), irp-2 (1,2±0,3%) (рис.6).  Рис.6. Частота обнаружения генетических маркеров «островов» патогенности среди условно-патогенных энтеробактерий, выделенных от больных ОКИ (n=175) Проведенные исследования показали генетическую неоднородность популяции клинических штаммов энтеробактерий по признаку патогенности. Установлено, что среди УПЭ, обладающих генетическими детерминантами патогенности, наибольшую долю составили Klebsiella spp. и Citrobacter spp. (39,0 % и 24,4% соответственно среди штаммов с наличием генетических маркеров патогенности; 9,1±2,1% и 5,7±1,7% соответственно среди всех протестированных УПЭ). Кроме того, клинические штаммы Klebsiella spp., значимость которых в этиологии ОКИ в последние годы возрастает, несут самый большой набор генетических детерминант патогенности по сравнению с другими энтеробактериями (рис.7).  Прим.: 1- доля среди клебсиелл; 2- доля среди всех протестированных энтеробактерий Рис.7. Частота обнаружения генетических детерминант патогенности у клинических штаммов Klebsiella spp. У Klebsiella spp. выявлены практически все изучаемые генетические маркеры «островов» патогенности. При этом наибольшая частота обнаружения была характерна для нуклеотидных последовательностей генов hlyA и sfaG Бактерии рода Cirtobacter также характеризовались довольно большим набором генетических детерминант «островов» патогенности. У данных штаммов выявлены нуклеотидные последовательности генов, ассоциированных с продукцией гемолизинов (hlyB и hlyA), а также адгезией S типа (sfa A) и адгезией 1 типа (fimA). Среди бактерий рода Kluyvera (вид K.ascarbata) выявлены hlyB, hlyA и sfaA. У клинических штаммов Enterobacter spp. установлены ампликоны, гомологичные hlyA и sfaA генам, ответственным за продукцию гемолизинов и адгезивную активность S типа, при этом hlyA обнаружен у E.aerogenes, sfaA – у E.сloacae и E. intermedius. Штаммы M. morganii и P. agglomerans характеризовались только наличием генетических детерминант «островов» патогенности, ответственных за продукцию гемолизинов. Установлена неравномерность распространенности генетических детерминант патогенности у культур, полученных от детей разных возрастных групп. В большинстве случаев (85,3%) маркеры «островов» патогенности были обнаружены у культур, выделенных от детей до 3-х лет (группа риска). Кроме того, у клинических штаммов, выделенных от детей до 3-х лет, отмечен самый широкий набор генетических детерминант патогенности. Так, у культур данной возрастной группы выявлены 100% детерминант sfaG, fimA и irp-2; а также 88,2%- hlyB, 82,3% - hlyA, 76,9% - sfaA. Результаты по выявлению генетических маркеров патогенности у культур, выделенных от больных разных возрастных групп, сопоставимы с исследованиями Н.Ю. Жеребцовой. Данным автором при выявлении нуклеотидных последовательностей hlyA, hlyB, sfaG, cnfl, estB генов также показано, что на культуры, полученные от детей до 3-х лет, приходилась самая большая доля данных детерминант. Следует отметить, что среди энтеробактерий, изолированных от детей контрольной группы, встречаемость генов оказалась значимо более низкой и характеризовалась единичными находками (гены hlyA -3,1% и sfa -1,5%). Клинические аспекты ОКИ и их сопряженность с наличием генетическим детерминант патогенности условно-патогенных энтеробактерий Для изучения сопряженности клинических проявлений ОКИ с наличием генетических детерминант патогенности условно-патогенных энтеробактерий проведен анализ клинического течения ОКИ у детей, госпитализированных в Иркутскую областную клиническую инфекционную больницу. Установлено, что этиологическая структура выделенных энтеробактерий была представлена бактериями 10 родов и 22 видов, преимущественно родов Enterobacter, Proteus, Klebsiella, Morganella и Citrobacter. Частота их встречаемости превышала долю энтеробактерий других родов (p<0,01). Основную часть заболевших составляли дети в возрастной группе до 3-х лет (около 80%). Доминировало среднетяжелое течение заболевания (88,8±0,3%). При этом у больных до 3-х лет тяжелая форма ОКИ встречалась чаще, чем в других возрастных группах (около 8%). Средняя продолжительность заболеваемости острыми кишечными инфекциями составила 5,9 койко-дней с более длительным течением у детей двух возрастных групп: до 3-х лет и 3-7 лет. Значимо чаще (p<0,01) ОКИ протекали по типу острого гастроэнтерита и энтероколита (более 70% всех острых кишечных инфекций). Осложнения (синдром кетоацидоза и токсико-эксикоза) наблюдались преимущественно у детей до 3-х лет и 3-7 лет. При анализе отдельных клинических показателей ОКИ (длительность лихорадки, средняя продолжительность болезни, наличие рвоты, диареи и т.д.) установлено, что продолжительность госпитализации составила 5,6±0,5 дней; средняя продолжительность лихорадки - 4,1±0,2 дней, средняя максимаьная температура- 37,9±0,06°С. Среди детей в возрасте до 3-х лет продолжительность лихорадки была значимо длиннее (4,2±0,2 дней), чем у детей 3-6лет и 7-14 лет и старше - 3,6±0,2 и 3,5±0,2 дней соответственно (p<0,01). Почти у половины больных (42,5±1,8%) лихорадка наблюдалась в течение 4-6 дней, у десятой части детей (11,1±1,8%) сохранялась 7 и более дней. Рвота регистрировалась более чем у половины больных (51,3±1,8%). У третьей части детей 27,9±1,6% детей рвота была однократной; повторная рвота встречалась значимо реже -17,0±1,3% (p<0,05). Продолжительности диареи составила 4,4±0,1 дней, в т.ч. у детей до 3-х лет - 4,7±0,2 дней и была выше (р<0,05), чем у больных других возрастных групп: 3-7лет -3,3±0,1 дней; 7-14 лет и старше-3,2±0,2 дней. Кратность стула менее пяти раз в сутки отмечалась у подавляющего большинства детей (85,1±0,05%). Факторный дисперсионный анализ обнаружения генетических маркеров «островков» патогенности у штаммов энтеробактерий, выделенных от больных ОКИ, и клинических проявлений заболеваний показал наличие значимых связей между наличием генетических маркеров и клиническими проявлениями острых кишечных инфекций (табл.3). Анализ связей между характеристикой выделенных от больных детей клинических штаммов и клиническими проявлениями вызываемых ими инфекций показывает, что наличие у возбудителя генетических детерминант патогенности значимо сопряжено с увеличением продолжительности и уровнем лихорадки, а также длительностью диареи у детей, больных ОКИ. При наличии у клинических штаммов генетических детерминант патогенности в испражнениях больных чаще обнаруживаются патологические примеси (p<0,01), а при наличие полиантибиотикорезистентности наблюдалась более продолжительная лихорадка (p<0,01). Таблица 3 Оценка связей между наличием генетических маркеров патогенности клинических штаммов энтеробактерий с проявлениями ОКИ
Следует отметить, что во всех исследованных случаях генетические маркеры выявлены у штаммов, выделенных при среднетяжелых и тяжелых формах ОКИ. При этом культуры, несущие генетические детерминанты «островков» патогенности, статистически чаще (p<0,05) выявлялись при тяжелых формах ОКИ (12,2%) по сравнению со штаммами, у которых данные детерминанты не выявлены (0,7%). При тяжелом течении ОКИ были выделены штаммы, несущие следующие генетические детерминанты: ген высокой патогенности - irp-2 (K.pneumoniae, S. оdorifera), гены, ответственные за продукцию гемолизинов - hlyA и hlyВ (K.pneumoniae, C.koseri), а также за адгезию S типа - sfa A (E. intermedius). Штаммы бактерий, несущие генетические маркеры «островов» патогенности, в 73,2±6,9% случаев обладали полирезистентностью к антимикробным препаратам. Таким образом, полученные результаты показали, что наличие у клинических штаммов энтеробактерий генетических детерминант патогенности и их сопряженность с клиническим течением острых кишечных инфекций свидетельствует об этиопатогенетической значимости выделяемых при ОКИ условно-патогенных энтеробактерий. |
Похожие:
 | Влияние климата на биологические свойства почв юга россии Обобщение результатов влияния климата на эколого-биологические свойства почв юга России 110 | | Контрольные вопросы по детским инфекционным болезням для студентов... ... |
| Контрольные вопросы по детским инфекционным болезням для студентов... ... |  | 1 Становление первобытного общества и первобытного врачевания России; философия; основные медико-биологические и клинические дисциплины. Программа разработана Российским Университетом дружбы... |
| 1 Становление первобытного общества и первобытного врачевания России; философия; основные медико-биологические и клинические дисциплины. Программа разработана Российским Университетом дружбы... | | Рабочая программа дисциплины медико-биологические основы безопасности... Целью освоения дисциплины является изучение причинно-следственных связей между качеством среды обитания и здоровьем человека, медико-биологических... |
| Общеобразовательное учреждение семёно-александровская средняя общеобразовательная школа Земле, обобщают и углубляют понятия об эволюционном развитии организмов. Полученные биологические знания служат основой при рассмотрении... | | Основные достижения иммунобиотехнологии Интерфероны. Природа, классификация, биологические свойства, перспективы применения |
| Рабочая учебная программа по экология популяций и сообществ Охватывает круг вопросов, связанных с принципами организации и функционированием двух надорганизменных биологических систем: популяции... | | Воздействие наночастиц на биологические объекты: токсический эффект Так, например, оказалось, что наночастицы некоторых материалов имеют очень хорошие каталитические и адсорбционные свойства. Другие... |
| Пояснительная записка Основные цели и задачи курса. Целью дисциплины... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | | Пояснительная записка Основные цели и задачи курса. Целью дисциплины... Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования |
| Программа по формированию навыков безопасного поведения на дорогах... Рассмотреть важнейшие экологические характеристики популяции: территорию, которую она занимает, численность, возрастной и половой... | | Учебно-методическое пособие для студентов дневного отделения биолого-почвенного... Охватывает организмы, популяции, сообщества, в результате взаимодействия которых с окружающей средой (энергией и веществом) образуются... |
| Учебно-методический комплекс по мдк. 01. 01. Медико-биологические... Государственное бюджетное образовательное учреждение среднего профессионального образования Псковской области | | Медико-биологические аспекты конструирования биокератопротезного... Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Межотраслевой научно-технический комплекс «Микрохирургия глаза»... |
