«фотодинамическая терапия в лечении перитонита» (Экспериментальное исследование)
Скачать 1.06 Mb.
|
| ГЛАВА II МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 2.1. Материалы исследования 2.1.1. Характеристика экспериментального материала Экспериментальное исследование проведено на 189 крысах самцах линии Wistar, массой 200-250 г., полученных из питомника РАМН "Столбовая" (г. Москва). Для выполнения работы использовали животных без внешних признаков заболевания, прошедших карантинный режим в условиях вивария Тверской государственной медицинской академии. Все животные содержались в одинаковых условиях и на стандартном пищевом режиме. Манипуляции с животными проводились в соответствии с Санитарными правилами по устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев) № 1045-7 от 06.04.1973, Конвенцией по защите животных, используемых в эксперименте и других научных целях (г. Страсбург, Франция, 1986), Директивой Совета 86/609/EEC от 24.11.86 по согласованию законов, правил и административных распоряжений стран-участниц в отношении защиты животных, используемых в экспериментальных и других научных целях. В опытные группы входили животные одного возраста, полученные из питомника одновременно. Все исследования проводили в одно и тоже время суток. Проведение экспериментов на крысах обусловлено удобством в обращении, относительной простотой выполнения манипуляций и получения стандартных условий для анатомо-гистологических и клинико-иммунологических исследований в динамике. Животных, находившихся под наркозом, выводили из опыта методом декапитации. Производили макроскопическое описание органов и тканей брюшной полости, забор экссудата брюшной полости, также было проведено гистологическое исследование париетальной брюшины. Таблица 1 Распределение экспериментальных животных по этапам исследования
Представленная работа выполнена в 3 этапа (табл. 1): I - изучение накопления фотосенсибилизатора в брюшной полости; II - изучение эффективности лечения ОЭП при помощи ФДТ в сравнении с традиционными методами лечения; III - изучение антибактериальных свойств ФДТ в сравнение с традиционными методами лечения. 2.1.2. Методика создания экспериментального перитонита у крыс Для создания модели острого распространенного калового перитонита нами применена модифицированная методика Лазаренко В.А. и соавт.(2008), которая близка по этиопатогенезу, клиническим проявлениям и фазности течения у человека. Для эксперимента использовалась профильтрованная 10% каловая взвесь в дозе 0,5 мл на 100 г. Данную взвесь получали путем смешиванием 0,9% раствора натрия хлорида и кала из слепой кишки нескольких интактных животных, затем смесь освобождали от крупнодисперстных частиц, фильтруя через 4 слоя марли. Полученную взвесь не позднее чем через 20 минут после приготовления вводили интактным животным пункционным способом. Во избежание повреждения внутренних органов при введении каловой взвеси в брюшную полость животных располагали вертикально, каудальным концом вверх. Методом пункции вентральной стенки в центре по средней линии живота, направляя конец иглы поочередно то в правое и левое подреберья, то в правую и левую подвздошные области, вводили необходимое количество взвеси. 2.1.3. Характеристика групп животных I этапа исследований Цель первого этапа исследования заключалось в изучение способности накапливания фотосенсибилизатора «Фотодитазина» в париетальной брюшине и оценки фотодинамической реакции при проведении ФДТ. Эксперимент был выполнен на 64 крысах самцах линии Вистар. Все животные были разделены на 8 групп, из которых 6 - опытных, и 2 - контрольные. Каждая группа содержала 8 особей. Первые 6 групп составляли крысы с острым экспериментальным перитонитом, которым внутривенно (в хвостовую вену) вводили фотосенсибилизатор «Фотодитазин» в дозе 0,8 мг/кг, в соответствии с группой от 30 до 180 минут до оперативного вмешательства: 1 группа - 30 мин. от момента введения фотосенсибилизатора; 2 группа - 60 мин. от момента введения фотосенсибилизатора; 3 группа - 90 мин. от момента введения фотосенсибилизатора; 4 группа - 120 мин. от момента введения фотосенсибилизатора; 5 группа - 150 мин. от момента введения фотосенсибилизатора; 6 группа - 180 мин. от момента введения фотосенсибилизатора. 7 контрольная группа - состояла из крыс, у которых на фоне экспериментально смоделированного распространенного перитонита, фотосенсибилизатор не вводили. 8 контрольная группа - состояла из интактные крысы (спектрально-флуоресцентные измерения проводили через 150 минут после введения фотосенсибилизатора). После введения каловой взвеси в брюшную полость подопытным крысам, на 3 сутки, у животных наблюдались симптомы характерные для перитонита: вялость, заторможенность, животные «кучковались» в одном из углов клетки, взъерошенность шерсти, учащенное дыхание, отдышка, отказ от еды, жидкий стул и вздутие живота. Животных 6 основных группах и 7 контрольной, подвергали оперативному вмешательству в условиях общей внутривенной (в хвостовую вену) анестезии (тиопентал-натрия: 5-7мг., 2% р-ра на 100 г. массы тела). Во время операции макроскопическая картина брюшины у крыс 7 контрольной группы и всех основных групп соответствовала острому распространенному перитониту. В брюшной полости определялся экссудат, брюшная стенка тусклая, гиперемированная, с гнойно-фибринозными наложениями на поверхности и висцеральной поверхности печени. На органах брюшной полости рыхлые фибриновые спайки в виде «паутинки». На брыжейке кишечника отмечались отдельные мелкоочаговые кровоизлияния. Петли кишок были раздуты, заполненные массами темного цвета, в некоторых местах кишка отечна, сосудистый рисунок кишечной стенки усилен. После оценки состояния брюшной полости и распространенности воспалительного процесса выполняли флуоресцентную спектрографию для изучения накопления фотосенсибилизатора в париетальной брюшине. Изучение накопления фотодитазина в брюшине проводили с помощью многоканального оптического волоконного спектроанализатора (ЛЭСА-01-Биоспек), с определением интенсивности флуоресценции по 12 точкам (рис.1). Оценивали соотношение интенсивности флюоресценции к так называемой, лазерной линии (интенсивность излучения, диффузно отраженного от тканей).  Рисунок 1. Проведение спектрально-флуоресцентных измерений на брюшине крысы с распространенным перитонитом с помощью ЛЭСА-01-Биоспек Далее проводили санацию брюшной полости стерильным физиологическим раствором до удаления фибрина из брюшной полости. После завершения санации, промывную жидкость эвакуировали из брюшной полости электроотсосом и производили облучение брюшины лазерным излучением по методу, исключающим термическое повреждение тканей. В качестве источника света для проведения ФДТ был использован лазер «АТКУС-2» с выходной мощностью до 2 Вт, длиной волны 660±0,03 нм, в непрерывном режиме красного оптического диапазона (рис.2). После определяли выходную мощности лазерного излучения аппарата «АТКУС-2» с помощью прибора ИИМ-1П, производили облучение брюшины в течение 10 минут по анатомическим областям. При проведении лазерного облучения плотность энергии от 20 до 25 Дж/см2 [Странадко Е.Ф. и соавт., 2012;Толстых П.И. и соавт., 2000;Аземшоев А.М., 2008]. По окончания облучения, через 5 мин, выполняли повторную флуоресцентную спектрографию.  Рисунок 2. Проведения облучения брюшины крысы с распространенным перитонитом с помощью лазерного аппарата «АТКУС-2» Экспериментальные животные выводились из опыта трехкратной передозировкой тиопентала-натрия. У 6 крыс массой тела 200 - 500 г. были произведены измерения площади брюшины: Висцеральная брюшина:
Париетальная брюшина:
Всего: 378-452 см2 Из представленных данных следует, что «теоретически» можно обработать не более 60% площади брюшины у крысы, так как невозможно подвести лазерное излучение к сложным анатомическим областям. Особенности расположения органов в брюшной полости, наличие естественных карманов, ямок, щелей подтверждают, что непосредственное воздействие лазерного излучения на брюшину не способно обеспечить обработку всей ее поверхности. 2.1.4. Характеристика групп животных II этапа исследований Целью второго этапа исследований являлось изучение эффективности применения метода ФДТ при лечение распространенного перитонита в сравнении с традиционным методом санации брюшной полости. Для сравнительной оценки изучались; гематологические и биохимические показатели периферической крови, уровень эндогенной интоксикации, гистологический материал и летальность животных с ОЭП. Исследования проведены на 65 крысах, входящих в состав двух группы:
В качестве антисептического раствора в контрольной группе использовали 0.02% водный раствор хлоргексидина, действующим веществом которого является хлоргексидина глюконат, обладающий активным бактерицидным действием в отношении большинства грамположительных и грамотрицательных аэробных и анаэробных бактерий. Данный раствор широко применяется в клинической практике для промывания полостей и ран. В послеоперационный период животным обеих групп в течение 3 суток проводили антибактериальную терапию, используя внутримышечные инъекции гентамицина из расчета 2 мг/кг массы. По ряду причин выбор был сделан в пользу сульфата гентамицина. Данный препарат обладающий широким спектром действия, подавляет рост большинства грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов. При внутримышечном введении средних терапевтических доз препарата, концентрация его в сыворотке крови составляет 2-8 мкг/мл. Выполнение санации брюшной полости методом ФДТ Под общей внутривенной анестезии (тиопентал-натрия: 5-7мг, 2% р-ра на 100 г. массы тела) животное укладывали на операционный стол и фиксировали за конечности. После удаления волосяного покрова брюшной стенки и обработки ее по методу Гроссиха-Филончикова выполняли срединную лапаротомию от мечевидного отростка до лонного сочленения. Гемостаз из стенок раны брюшной стенки осуществляли с использованием электрокоагуляции. К краям раны подшивали стерильные салфетки шелком на атравматической игле. Затем к краям раны брюшной стенки подшивали четыре шелковые держалки и края раны разводились в стороны. Производили оценку морфологической картины: состояние париетальной и висцеральной брюшины; измеряли объем экссудата и давали его характеристику; стерильным шприцем проводили забор экссудата; производили забор участка париетальной брюшины для гистологического исследования. Экссудат полностью удаляли из брюшной полости при помощи электроотсоса. В брюшную полость животного вливали от 20 до 30 мл стерильного физиологического раствора, перед этим за держалки края раны брюшной стенки поднимали вверх и в стороны. Раствор тщательно перемешивали стерильным шпателем и производили удаление электроотсосом. Потом производили облучение брюшины лазерным излучением, по методу исключающим термическое повреждение тканей (мощностью 2 Вт длиной волны 660±0,03 нм), в течение 10 минут - плотность энергии от 20 до 25 Дж/см2. По окончанию облучения выполняли повторное промывание брюшной полости стерильным физиологическим раствором. Раствор тщательно перемешивали стерильным шпателем и производили удаление электроотсосом. Брюшную стенку зашивали через все слои шелком и обрабатывали спиртовой настойкой йода, животное маркировали и помещали в стандартные условия вивария. Выполнение санации брюшной полости традиционным методом Под общей внутривенной анестезии (описанной выше) животным выполняли срединную лапаротомия. Производили оценку морфологической картины: состояние париетальной и висцеральной брюшины; измеряли объем экссудата и давали его характеристику; стерильным шприцем проводили забор экссудата; производили забор участка париетальной брюшины для гистологического исследования. Экссудат полностью удаляли из брюшной полости при помощи электроотсоса. Брюшную полость промывали 0,02% раствором хлоргексидина, до «чистых» вод. Последовательность выполнения эксперимента не отличалась от санации брюшной полости в основной группе животных. Объем раствора хлоргексидина примененного для санации брюшной полости в контрольной группe животных составлял в среднем 82±3 мл, а время экспозиции – 107±4 секунд. По завершении интраоперационной санации брюшной полости ее ушивали через все слои, животных маркировали и помещали в стандартные условия вивария. 2.1.5. Характеристика групп животных III этапа исследований Отдельным этапом нашей работы было изучение антибактериальных свойств ФДТ при перитоните, при котором существенное значение имеет определение числа колониеобразующих единиц (КОЕ) микроорганизмов в послеоперационном периоде. Исследование произведено на 60 крысах. Для более удобного подсчета микроорганизмов в экссудате, моделирование перитонита вызывали внутрибрюшинным введением монокультуры E. Coli (Штамп 25922) в концентрации 108-9 микробных тел в 1 мл суспензии из расcчета 0,01 мл заражающей дозы на 1 г массы животного. Во избежание повреждения внутренних органов при введении монокультуры в брюшную полость, животных располагали вертикально, каудальным концом вверх. Методом пункции вентральной стенки в центре средней линии живота, направляя конец иглы поочередно то в правое и левое подреберья, то в правую и левую подвздошные области, вводили необходимое количество взвеси. Для определения КОЕ подопытных животных выводили из эксперимента на 1; 3; 5 и 7 сутки после оперативного вмешательства при помощи передозировки анестетика (тиопентал-натрия). Экспериментальные животные распределялись на группы:
Клиника перитонита у экспериментальных животных развивалась к концу 2 суток. На 3 сутки после моделирования бактериального перитонита животных подвергали оперативному вмешательству. Оперативное вмешательство производилось по вышеизложенным методикам. 2.1.6. Фотосенсибилизатор В качестве фотосенсибилизатора использовался препарат «Фотодитазин» разработан в Научно-производственной фирме ООО «ВЕТА-ГРАНД», входящей в ОАО «Группа компаний «Гранд», регистрационное удостоверение № ЛС-001246. «Фотодитазин» - универсальный, единственный в ряду известных фотосенсибилизаторов, применяющихся в медицинской практике препарат, используемый как для флуорестенцентной диагностики, так и для фотодинамической терапии. «Фотодитазин» (N-диметилглюкаминовая соль хлорина Е6) - препарат растительного происхождения, создан на основе производных хлорофилла А, получаемого из биомассы микроводоросли Спирулина Платензис (Spirulina platensis Gom.Geitleri). «Фотодитазин» удовлетворяет всем основным требованиям, предъявляемым к современным фотосенсибилизаторам: возможность использования «Фотодитазина» как для флуоресцентной диагностики, так как и для фотодинамической терапии; высокая селективность к раковым клеткам; низкое накопление ФС в нормальных тканях; практическое отсутствие токсичности и быстрое выведение из организма; высокая индуцированная люминесценция в очаге накопления для провидения надежной диагностики; высокий квантовый выход образования синглентного кислорода; интенсивный максимум поглощения в области 660-820 нм. Высокая скорость накопления в опухоли, отсутствие токсичности и, что особенно важно для практического применения, полное выведение из организма в течении 26-28 часов (существенное снижение ограничений для пациентов по соблюдению светового режима). По решению Федеральной службы по надзору в сфере здравоохранения и социального развития был внесен в государственный реестр лекарственных средств. Для исследования применялась дозировка препарата 0,8 мг/кг, что составляет среднестатистический показатель рекомендованной дозировка «Фотодитазина» для внутривенного введения (0,3-1,4 мг/кг). Рассчитанную дозу растворяли в 0,5-0,7 мл физиологического раствора и медленно вводили в хвостатую вену крысы. Разведение ФС и инъекции проводились в затемненном помещении. 2.2. Методы исследования 2.2.1. Флуоресцентная диагностика Исследования проводились с использованием портативного многоканального лазерного спектрального анализатора последнего поколения ЛЭСА-01 (рис.3) совместного производства объединения «Биоспек» (Россия) и ЦЕНИ ИОФ РАН, с программным обеспечением для работы в операционной среде Microsoft Windows'98-2000. Относительно простая компактная система позволяет получать спектр диффузного отражения и флюоресценции с интервалом 0,1 сек., что достаточно для мониторинга в реальном масштабе времени. Схема прибора позволяет производить регистрацию спектра флюоресценции в ускоренном режиме в диапазоне длин волн от 400 до 850 нм одновременно по более чем 3000 каналам. Система оснащена гибким V-образным многоканальным волоконно-оптическим катетером диаметром 1,8 мм, малый диаметр и гибкость позволяют вводить катетер в биопсийный канал эндоскопа для исследования полых органов, в том числе трахеи и бронхов, обеспечивая непосредственный контакт с исследуемой поверхностью [Лощенов В.Б.,1998; Харнас С.С.,1999; Loschenov, V. B., 1991]. Принцип работы системы следующий: cвет от лазерного источника фокусируется на входной конец V-образного волоконно-оптического катетера. В работе мы использовали гелий-неоновый лазер с длиной волны 632,8 нм и мощностью 25 мВт. Такая длина волны позволяет достичь наиболее возможной глубины проникновения до 3 мм. Дистальный конец диагностического катетера (общий диаметр 1,8 мм). Флуоресцентный и рассеянный свет поступает в приемные волокна (6 штук), которые окружают волокно для доставки света, последнее соединено со спектрографом. Волокна на выходном конце сформированы в ряд с тем, чтобы увеличить разрешение системы. Спектрограф вместе с электроникой для сбора данных смонтирован на плате компьютера, которая вставляется в ISA-слот станции расширения компьютера Notebook. Приемный сигнал оцифровывается, передается в память компьютера и изображается на дисплее в реальном масштабе времени. Многофункциональность применения данной системы обеспечивается также специальным программным обеспечением, работающим в среде Windows. Для того чтобы система могла эффективно использоваться в биомедицинских и клинических приложениях имеется возможность проводить анализ спектральной информации в реальном масштабе времени.  Рисунок 3. ЛЭСА-01 2.2.2.Источник света В качестве источника низкоинтенсивного лазерного излучения использовали полупроводниковый лазерный аппарат «АТКУС-2» (рис.4) фирмы ЗАО «Полупроводниковые приборы» г. Санкт-Петербург. Аппарат разрешен к применению в медицине Минздравом РФ. Сертификат соответствия (Госстандарт РФ № РОСС RU. ИМ 15. В 00404, № 6053691).  Рисунок 4. полупроводниковый лазерный аппарат «АТКУС-2» Аппарат имеет следующие технические характеристики:
Данный лазерный аппарат рекомендован Научно-производственной фирмой ООО «ВЕТА-ГРАНД» для работы с фотосенсибилизатором «Фотодитазин». С целью контроля выходной мощности на конце оптического волокна использовали интегральный измеритель мощности (ИИМ-1П), изготовленный Научно-производственной фирмой «ПОЛИРОНИК», Россия (рис.5).  Риссунок 5. ИИМ-1П 2.2.3. Клинико-лабораторные исследования Забор крови у экспериментальных животных производился из хвостовой вены. При проведение клинического анализа крови определяли показатели эритроцитарного звена (эритроциты, гемоглобин, гематокрит), лейкоциты. При проведение биохимических исследований определяли уровень аминотрансфераз (АлАТ, АсАТ), концентрацию креатинина и мочевины, концентрацию общего белка. Для оценки степени синдрома эндогенной интоксикации проводили подсчет лейкоцитарного индекса интоксикации (ЛИИ). Лейкоцитарный индекс интоксикации рассчитывали по лейкограмме согласно формуле, предложенной Я.Я. Кальф-Калифом (1941): ЛИИ=(4Мл+3Ю+2П+С) х (Пл+1)/(М+Л) х (Э+1) где: Мл – миелоциты крови (%); Пл – плазматические клетки (%); Ю – юные (%); М – моноциты (%); П – палочкоядерные (%); Л – лимфоциты (%); С – сегментоядерные (%); Э – эозинофилы (%). 2.2.4. Морфологические исследования Морфологические исследования тканей париетальной брюшины проводили на 1, 3, 4, 7 сутки после начала лечения. Биопсийный материал фиксировали в жидкости Карнуа в течение 2 часов и заливали в парафин. Срезы толщиной 5-7 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, пикрофуксином по Ван-Гизону на коллагеновые волокна, фукселином на эластические волокна, импрегнировали серебром по Гомори для выявления аргирофильных структур. Использовали также гистохимические методы: окраска толуидиновым синим для выявления глюкозаминогликанов и их комплексов с белками (протеингликаны), ШИК-реакция для выявления гликогена и гликопротеинов, реакция Браше для выявления РНК и реакция Фёльгена для выявления ДНК в клетках. Морфологические исследования выполнены совместно с д.м.н., профессором В. И. Елисеенко. 2.2.5. Методика выполнения бактериологического исследования экссудата брюшной полости После выполнения лапаротомии у животных с ОЭП в стерильные пробирки осуществляли забор экссудата из брюшной полости, а при его отсутствии забирали смывы из брюшной полости. Для этого в брюшную полость вводили стерильный изотонический раствор в количестве 10 мл. Осуществляли забор экссудата (смывов) в стерильные пробирки. Из забранного материала готовили разведение 102 , 104 , 106 , 108 микробных тел/мл. После этого осуществляли посев газоном на чашки с мясопептонным агаром. Результат оценивался через 18-20 часов инкубации при 270 С. Исследование проводились на 1, 3, 5, 7 сутки после проведения оперативного вмешательства. 2.2.6. Статистическая обработка полученных результатов Статистическую обработку результатов экспериментальных исследований осуществляли с помощью компьютера, методом вариационной статистики (Боровиков А.П. и соавт., 1998) с использованием пакета программ «Excell-5». Результаты рассматривали как достоверные, если вероятность случайного их происхождения по t-критерию Стьюдента была менее 5% (р< 0,05). | ||||||||||||||||||||||
Похожие:
 | Флуоресцентная диагностика и фотодинамическая терапия остроконечных кондилом вульвы ... | | Совершенствование методов диагностики и эндодонтического лечения... Методические рекомендации предназначены для медицинских работников, оказывающих первичную медико-санитарную помощь: врачей стоматологического... |
 | Селявко Юрий Александрович "Современная антибактериальная профилактика... | | Разработка полимерного низкочастотного виброизолятора с квазинулевой жесткостью Проведено аналитическое исследование разрабатываемого виброизолятора, его изготовление и экспериментальное исследование. Частота... |
| Иммуномодулирующая терапия в комплексном лечении неконтролируемой бронхиальной астмы у детей Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ульяновский государственный... | | Содержание Тюленёва А. Н., Осипенко М. А., Няшин Ю. И. экспериментальное и теоретическое исследование процесса иммобилизации микроорганизмов... |
| Синергетическая модель концепта «жизнь»: экспериментальное исследование Работа выполнена на кафедре английского языка Тверского государственного университета | | Исследовательская работа Автор работы Экспериментальное исследование, направленное на определение оптимального конструктора веб-сайта в школьных условиях |
| Экспериментальное исследование тонкодисперсного распыла перегретой воды Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Объединенном институте высоких температур Российской академии... | | Методические указания для работы с программой «Открытая Физика 1» Цель работы Экспериментальное исследование интерференции световых волн от двух источников (щелей) |
| Экспериментальное исследование генерации и устойчивости тепловых концентрированных вихрей Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Объединенном институте высоких температур Российской академии... | | Учебно-тематические планы лекционных занятий по дисциплине «Математика»... Экспериментальное исследование интерференции световых волн от двух источников (щелей) |
| Патентам и товарным знакам (19) Трянин а. П. Электропунктурная терапия в комплексном лечении хронического простатита. Гомеопатическая медицина и акупунктура. 1997,... | | Клинико-экспериментальное исследование 14. 00. 35 – детская хирургия... «Средняя общеобразовательная школа №19 с углубленным изучением отдельных предметов» |
| Экспериментальное исследование теплопроводности, удельного электрического... Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук Объединенный институт высоких температур ран | | Клиническое значение исследования ренальной гемодинамики в диагностике... Показатели внутриглазного давления новорождённого ребёнка, обусловленные морфологическими особенностями дренажной системы глаза в... |
