Рис. 4. Связь частоты обнаружения ВГА при плановом исследовании проб воды с заболеваемостью ГА в г. Н. Новгороде в 1995-2004 гг.
Применение метода ОТ-ПЦР в 2003-2004 гг. позволило выявить ВГА в воде не только в годы с высоким уровнем заболеваемости ГА, но и в условиях межэпидемического периода, когда ИФА был практически неэффективным. По нашему мнению, последнее обстоятельство обусловлено тем, что в годы с низкой заболеваемостью ГА концентрация возбудителя в водных объектах, находится ниже «фонового» уровня, обеспеченного пределом эффективности способов концентрирования вируса из воды и чувствительности метода его детекции, в частности ИФА.
При анализе помесячного распределения находок ВГА выявлено, что вирус в водных объектах можно обнаружить в любой месяц года. При этом ежегодно, независимо от фазы эпидпроцесса гепатита А, более 50% находок ВГА в поверхностных водоисточниках приходилось на весенний период. По сравнению с ИФА использование ОТ-ПЦР оказалось эффективным для обнаружения вируса и в период сезонного подъема заболеваемости (рис. 5).  Рис. 5. Распределение находок ВГА в пробах воды по месяцам 2001-2004 гг. Установлено, что уровень заболеваемости гепатитом А в период сезонного подъема в предшествующем году влияет на частоту обнаружения вируса в I квартале следующего года. При этом в феврале-марте ВГА обнаруживали в водных объектах только в том случае, если этому предшествовали оттепели, сопровождавшиеся таянием снега, а в апреле, когда для нашей климатической полосы характерно наступление паводкового периода, его выявляли каждый год. Во внутригодовой заболеваемости в отдельные годы, примерно через месяц после обнаружения РНК ВГА в воде в весеннее время, происходило повышение уровня заболеваемости среди населения. И хотя подъем был кратковременным и небольшой интенсивности, но с позиции теории саморегуляции паразитарных систем, возможно, он необходим для формирования «эпидемического» варианта возбудителя. Последнее обстоятельство требует экспериментального подтверждения и указывает на необходимость продолжения исследований. Таким образом, комплексное эпидемиологическое и лабораторное исследование с применением методов ИФА и ОТ-ПЦР для детекции ВГА в воде позволило обосновать роль водного фактора передачи ГА на территории г. Н. Новгорода.
В 2005 г. в отдельных районах г. Н. Новгорода в условиях ожидаемого периодического подъема была зарегистрирована вспышка гепатита А. Рост заболеваемости прогнозировался на основании, как официальных статистических данных, так и результатах динамического слежения за иммуноструктурой к ВГА населения города. Так, в 2004 г. на фоне межэпидемического периода произошло увеличение в 2,7 раза доли иммунных лиц среди детского населения по сравнению с 2003 г., особенно выраженное в индикаторной возрастной группе 5-9 лет, где частота выявления анти-ВГА Ig G составила 20,9±3,7% (p<0,001).
В условиях вспышечной заболеваемости гепатитом А только с помощью метода ОТ-ПЦР РНК вируса гепатита А была обнаружена в 2 пробах водопроводной воды из распределительной сети микрорайона, в котором регистрировались максимальные показатели заболеваемости, что позволило подтвердить роль водного пути передачи инфекции в конкретной эпидситуации.
При изучении скрыто протекающего эпидемического процесса ГА спустя 3 месяца от начала вспышки иммунная прослойка в группе лиц 15-40 лет, среди которых регистрировались наибольшие показатели заболеваемости, составила 35,2±3,4%. В то время как по данным Т.Н. Быстровой (1999) снижение уровня заболеваемости ГА происходит, когда доля иммунных к ВГА в популяции достигает >70%. С учетом представленных результатов был дан неблагоприятный прогноз развития эпидситуации ГА на территории г. Н.Новгорода, что подтвердилось впоследствии данными регистрируемой заболеваемости. За первые 3 месяца 2006 г. уровень заболеваемости ГА характеризовался превышением среднемноголетних показателей в 3,0 раза, а года с максимальным значением (1989 г.) – в 1,4 раза.
С эпидемиологической точки зрения важным является не только сам факт обнаружения РНК вируса гепатита А в том или ином исследуемом субстрате, но и возможность оценить его эпидемиологическую значимость. О том, что обнаружение РНК вируса гепатита А в воде является маркером эпидемической опасности свидетельствуют представленные выше данные эпидемиологических наблюдений.
Также нами предпринята попытка решить вопрос об эпидемиологической значимости обнаружения РНК ВГА в различных субстратах с помощью метода иммуноэлектронной микроскопии, который позволяет визуализировать вирусную частицу. В результате в 5 из 11 препаратов экстрактов фекалий больных гепатитом А и контактных из очагов инфекции, а также в 2 из 6 концентратов воды, в которых обнаруживалась только РНК вируса гепатита А, нам удалось определить отдельные вирусные частицы, окруженные специфическими антителами и морфологически идентичные возбудителю гепатита А, и их агрегаты из 2-8 частиц (рис. 6).
Рис. 6. Вирусные частицы ВГА в препарате РНК ВГА-позитивного концентрата водопроводной воды. Иммуноэлектронная микроскопия (х 50 000)
Таким образом, эпидемиологические наблюдения и экспериментальные данные позволяют считать обнаружение РНК ВГА в фекалиях и воде маркером эпидемической опасности в рамках реализации фекально-орального механизма передачи гепатита А.
В целом результаты проведенного нами исследования свидетельствуют о том, что метод ОТ-ПЦР является более информативным по сравнению с ИФА и позволяют рекомендовать его к использованию в эпиднадзоре за гепатитом А.
ВЫВОДЫ
Установлены различия в проявлениях эпидемического процесса гепатита А на отдельных территориях г. Н. Новгорода: в заречной части города по сравнению с нагорной выявлено превышение уровня заболеваемости; доли ГА в структуре ОВГ; более длительный период сезонного подъема; относительно высокая доля сезонной надбавки; позднее наступление процесса «повзросления» инфекции и различная значимость воды как фактора передачи.
Показано, что ингибирование ОТ-ПЦР происходит в пробах сывороток крови в 4,4±2,2%, фекалий - 14,7±3,9%, слюны - 95,5±3,1%, концентратов речной воды - 81,8±3,5%. Разработан способ предварительной обработки проб слюны и концентратов воды, который позволил устранить ингибирование реакции в 94,7±2,6% образцов и повысить эффективность выявления РНК ВГА. Необходимым условием при проведении ОТ-ПЦР для обнаружения РНК ВГА является применение внутреннего контрольного образца.
Использование ОТ-ПЦР, в отличие от ИФА, позволяет обнаружить РНК ВГА в слюне и сыворотке крови, а также повысить выявляемость возбудителя в фекалиях на 87%, концентратах воды – на 95%.
Частота обнаружения РНК ВГА у больных в первые 3 дня желтушного периода составила в фекалиях и сыворотке крови 100%, в слюне 32,1±3,4%. На 25-й день с момента появления желтухи РНК ВГА выявлялась у реконвалесцентов ГА в фекалиях в 90,6±5,2% и сыворотке крови – 56,3±8,8%.
Частота обнаружения РНК ВГА в фекалиях контактных из очагов, сформировавшихся в организованных детских коллективах, колебалась от 0% до 16,1±6,6% и коррелировала с числом зарегистрированных случаев ГА.
Установлено, что метод ОТ-ПЦР является более информативным по сравнению с ИФА при детекции ВГА в воде. Это обусловливает целесообразность его использования в системе эпиднадзора за инфекцией при проведении вирусологического мониторинга водных объектов, а также для установления водного фактора передачи в условиях вспышечной заболеваемости ГА.
В многолетней динамике существует прямая корреляционная связь между частотой обнаружения ВГА в водных объектах и уровнем заболеваемости гепатитом А на территории г. Н. Новгорода, при этом ежегодно более 50% находок вируса приходилось на весенний период, а в феврале-марте его выявляли чаще вслед за годом с высокими показателями заболеваемости и в случае оттепелей, сопровождавшихся таянием снега в зимнее время года.
Обнаружение РНК ВГА в фекалиях и воде является маркером эпидемической опасности в рамках реализации фекально-орального механизма передачи гепатита А.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
В целях совершенствования организации противоэпидемических мероприятий в систему эпиднадзора за гепатитом А необходимо внедрить определение РНК ВГА методом ОТ-ПЦР в фекалиях реконвалесцентов декретированных групп населения для решения вопроса о допуске их в коллективы. За критерий эпидемической безопасности переболевших следует принять отрицательный результат определения РНК ВГА в фекалиях.
Алгоритм лабораторной диагностики ГА при обследовании очагов инфекции в детских организованных коллективах необходимо дополнить использованием метода ОТ-ПЦР для определения РНК ВГА в фекалиях контактных в случае обнаружения у них в сыворотке крови анти-ВГА Ig M. Это позволит своевременно и более полно выявить и изолировать источники инфекции, а также решить вопрос об их допуске в детские учреждения.
Обязательным условием всех исследований методом ОТ-ПЦР при определении РНК ВГА должно быть применение внутреннего контрольного образца.
Как обязательный элемент в систему эпиднадзора за ГА необходимо включить мониторинг водных объектов централизованного хозяйственно-питьевого водоснабжения за контаминацией вирусом гепатита А. При этом методической основой детекции возбудителя следует признать метод ОТ-ПЦР.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
Совершенствование методов детекции вируса гепатита А в воде / Т.Н. Быстрова [и др.] // Современные средства иммунодиагностики, иммуно- и экстренной профилактики актуальных инфекций : тр. науч. конф. с международным участием. – СПб., 2004. – С. 225-226.
Тенденции в современных проявлениях эпидемического процесса и совершенствование эпиднадзора за гепатитом А / Т.Н. Быстрова [и др.] // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний : матер. науч. конф. – Н. Новгород, 2004. – С. 7-12.
Быстрова, Т.Н. Современные аспекты эпидемического процесса вирусного гепатита А / Т.Н. Быстрова, К.В. Блохин, М.И. Попкова // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний : матер. науч. конф. – Н.Новгород, 2004. – С. 12-18.
Эволюция проявлений эпидемического процесса гепатита А на территории крупного города европейской зоны России / Т.Н. Быстрова [и др.] // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. – 2004. - № 5 (18). – С. 24-27.
Попкова, М.И. Методические подходы при проведении мониторинга за контаминацией водных объектов вирусом гепатита А / М.И. Попкова // Окружающая среда и здоровье : матер. Всероссийск. науч.-практич. конф. молодых ученых и специалистов. – Суздаль, 2005. – С. 481-482.
Использование метода ОТ-ПЦР при диагностике гепатита А / Т.Н. Быстрова [и др.] // Мир вирусных гепатитов. – 2005. - № 7-8. – С. 5.
Современный взгляд на пути передачи гепатита А / М.И. Попкова [и др.] // Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций : матер. Всероссийск. науч. конф. – СПб., 2005. – С. 64-65.
Место водного фактора в эпидемическом процессе гепатита А / Т.Н. Быстрова [и др.] // Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций : матер. Всероссийск. науч. конф. – СПб., 2005. – С. 65-67.
Эпидемиологические закономерности вирусных гепатитов на территории г. Н.Новгород в современный период / Т.Н. Быстрова [и др.] // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний : матер. науч. конф., посвящ. 85-летию акад. РАМН И.Н. Блохиной. – Н. Новгород, 2006. – С. 99-100.
Водная вспышка гепатита А в г. Н. Новгород в 2005 г. / Е.И. Ефимов [и др.] // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний : матер. науч. конф., посвящ. 85-летию акад. РАМН И.Н. Блохиной.– Н. Новгород, 2006. – С. 100-103.
Быстрова, Т.Н. Эпидемиологическая значимость определения специфических маркеров ВГА в воде методами ИФА и ОТ-ПЦР / Т.Н. Быстрова, К.В. Блохин, М.И. Попкова // Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний : матер. науч. конф., посвящ. 85-летию акад. РАМН И.Н. Блохиной. – Н. Новгород, 2006. – С. 103-104.
|
