Скачать 0.74 Mb.
|
Цель исследования: установить молекулярные механизмы дизрегуляции цитокинопосредованной кооперации иммунокомпетентных клеток крови при хронических инфекциях, вызванных вирусами семейства Flaviviridae.Задачи исследования:
Научная новизна. Впервые с привлечением современных гематологических, иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования представлены знания фундаментального характера о роли генетически детерминированных механизмов дизрегуляции системы цитокинов в формировании длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae. Показано, что у пациентов с хроническим носительством вирусов семейства Flaviviridae (хронический вирусный гепатит, длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита) развивается дисбаланс цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови, опосредующий поляризацию иммунного ответа в направлении Th2, что подтверждается фактом обнаружения угнетения продукции и рецепции мононуклеарными лейкоцитами крови Th1-цитокинов (IL2, IL2R, IL12, TNFα, TNFR) и увеличения – Th2-цитокинов (IL4, IL4R, IL10, IL10R) и комплиментарных им рецепторов (IL2R и TNFR). Установлено, что характер и направленность изменений продукции и рецепции цитокинов (IL2, IL4, IL10, TNFα, IFNγ) не зависят от этиологического варианта флавивирусной инфекции и согласуются с концепцией типовых механизмов развития инфекционного процесса. Показано, что при остром клещевом энцефалите возрастает продукция мононуклеарными лейкоцитами крови Th1-цитокинов (TNFα, IL2, IFNγ), в то время как длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита сопровождается дисбалансом продукции и рецепции цитокинов эффекторными клетками крови. Установлено, что закономерности нарушения системы цитокинов и их рецепторов при персистенции TBEV определяются активностью инфекционного процесса. Впервые комплексно и в сравнительном аспекте представлена характеристика системы цитокинов и их рецепторов у пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита, сопровождающейся остаточными проявлениями нейроинфекции в виде цереброгенной астении, пациентов с бессимптомным носительством антигена вируса клещевого энцефалита и больных хроническим клещевым энцефалитом (полиомиелитическая форма, рецидивирующее течение). Установлено, что цитокиновый статус крови у пациентов с длительной антигенемией TBEV и больных хроническим клещевым энцефалитом характеризуется однонаправленными различной степени выраженности изменениями продукции и рецепции основных иммунорегуляторных цитокинов (IL2, IL4, IL10, TNFα, IFNγ). Выявлено, что у больных хроническим вирусным гепатитом С слабовыраженной и умеренной степени активности (на основании определения полуколичественного гистологического индекса активности - индекс Knodell), изменения в системе цитокинов и их рецепторов носят однонаправленный характер, при этом являются более выраженными в отношении изменения продукции Th2-цитокинов у больных хроническим вирусным гепатитом С умеренной степени активности. Впервые проведено исследование полиморфизма генов цитокинов и рецепторов (IL2, IL4, IL4R, IL10, IL12, TNFα) у лиц европеоидной популяции с хронической Flaviviridae-инфекцией, проживающих на территории Западной Сибири. Определено, что полиморфизмы в промоторных регионах генов IL10 и IL4RA50 обладают протективным эффектом в отношении HCV-инфекции; генов TNFA, IL12p40 и IL4RA50 – в отношении длительной антигенемии TBEV. Предрасположенность к развитию хронического вирусного гепатита С ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592A гена IL10; клещевой нейроинфекции с C/C генотипом промоторного региона A-1188C гена IL12p40, Val/Ile генотипом промоторного региона Ile-50Val гена IL4R, полиморфизмами в промоторных регионах Q-576R гена IL4R и C-592A гена IL10. Теоретическая и практическая значимость. Впервые установлены закономерности нарушения цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови у пациентов с длительной персистенцией вирусов семейства Flaviviridae (хронический вирусный гепатит, длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита). Определена важная роль в этом процессе нарушения продукции и рецепции иммунорегуляторных цитокинов (IL2, IL4, IL10, TNFα, IFNγ), регулирующих баланс Th1/Th2-пути антигенспецифического иммунного ответа. Установлены иммуногенетические факторы, обладающие протективным эффектом и определяющие риск прогрессирования и хронизации вирусного гепатита в отношении длительной персистенции вирусов гепатита С и антигенемии вируса клещевого энцефалита. Положения исследования могут служить основанием для разработки стратегии изучения молекулярных и клеточных механизмов формирования длительной персистенции вирусов в организме. Полученные фундаментальные знания представляют основу для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения клещевого энцефалита и вирусного гепатита С, а также технологии персонализированной коррекции дизрегуляции цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови с целью проведения патогенетически обоснованной терапии иммунных нарушений и своевременной профилактики развития хронических форм инфекции, а также осложнений, возникающих при длительной вирусной персистенции. Положения, выносимые на защиту: 1. При хронических вирусных инфекциях, вызванных вирусами семейства Flaviviridae (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С), развивается типовой дисбаланс системы цитокинов. 2. Преимущественная активация Th2-пути иммунного ответа при длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С) выражается в угнетении продукции IL2, IL12 и TNFα, увеличении секреции IL4 и IL10 мононуклеарными лейкоцитами крови. 3. Длительная персистенция вирусов семейства Flaviviridae (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С) сопровождается дисбалансом продукции IL2, IL4, IL10 и TNFα, а также презентации на лимфоцитах комплиментарных им рецепторов (IL2R, IL4R, IL10R и TNFR1), опосредующим нарушение межклеточной коммуникации иммунокомпетентных клеток крови. 4. Интра- и интернозологическая (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С) оценка нарушений функционирования системы цитокинов при хронической Flaviviridae-инфекции демонстрирует однонаправленность, но различную степень их выраженности. 5. Среди лиц европеоидной популяции, проживающих на территории Западной Сибири, степень риска прогрессирования и хронизации вирусного гепатита С ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592A гена IL10 (С/А генотип); клещевого энцефалита A-1188C гена IL12p40 (C/C генотип), Ile-50Val гена IL4R, Q-576R гена IL4R, C-592A гена IL10; резистентность к заболеванию хроническим вирусным гепатитом С C-592A гена IL10 (C/С генотип) и Ile-50Val гена IL4RA50; в отношении длительной антигенемии TBEV G-308A гена TNFA, A-1188C гена IL12p40 (А/А генотип), Ile-50Val гена IL4R. Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004); V Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004); III российский конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)» (Москва, 2004); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004); VI конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Анталия, 2004); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005); Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием к 100-летию со дня рождения А.Г. Панова «Современное состояние проблемы нейроинфекций» (Санкт-Петербург, 2005); Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005); Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет.» (Новосибирск, 2005); V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); ХII Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005); Всероссийской научно-практическая конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в ХХI веке» (Томск, 2006); Российском медицинском форуме с международным участием «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); Съезде неврологов Сибирского федерального округа (Ярославль, 2006); 15 Российско-Японский Симпозиуме медицинского обмена «Москва-2007» Пути развития и перспективы (Благовещенск, 2007); II Российско-Германской конференции Форума Коха-Мечникова «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении» (Томск, 2007); Всероссийской научной конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита», Москва, 15-16 ноября 2007. Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры патофизиологии (разделы «Патофизиология системы крови», «Патофизиология инфекционного процесса», «Патофизиология иммунной системы», «Патофизиология клетки»), микробиологии (разделы «Рабдо- и арбовирусы», «Возбудители гепатитов»), кафедры фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Клиническая патофизиология реактивности организма», «Молекулярные основы патологии»), кафедры морфологии и общей патологии («Инфекция и иммунитет»), а также в лекционном курсе по инфекционным болезням для студентов лечебного, педиатрического и медико-биологического факультетов Сибирского государственного медицинского университета. В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ по проблеме «Молекулярные механизмы нарушения структуры, метаболизма и функции клеток крови при патологии» (НШ-1051.2003.4), «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), «Роль генетически детерминированных реакций системы крови в патоморфозе инфекционных заболеваний» (НШ-2334.2008.7), а также результаты научно-исследовательских работ «Молекулярные механизмы предрасположенности и резистентности организма человека к персистентным бактериальным и вирусным инфекциям» РИ-112/001/158 (Государственный контракт от 05.09.2005 г. № 02.445.11.7110), «Молекулярные и клеточные основы управления реактивностью системы крови при актуальных заболеваниях инфекционной природы» 2006-РИ–112.0/001/384 (Государственный контракт от 09.06.2006 г. № 02.445.11.7419), «Молекулярные основы персонализированной терапии социально-значимых инфекционных заболеваний и прогнозирование исхода взаимодействия инфектогена и иммунной системы макроорганизма» (Государственный контракт от 27.02.07 г. № 02.512.11.2040), «Молекулярно-генетические основы управления адаптационной реактивностью системы крови человека при инфекции» (Государственный контракт от 05.06.2007 г. № 02.512.11.2112), в выполненных в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006, 2007-2012 годы». Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 работы, из них 16 статей в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК РФ, 28 статей и тезисов в материалах конференций, конгрессов и съездов. Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 352 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 97 таблицами. Библиографический указатель включает 534 источника (203 - отечественных и 351 - иностранных). ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 311 человек (188 мужчин и 123 женщины в возрасте от 18 до 55 лет, средний возраст – 33±3 лет), инфицированных вирусами клещевого энцефалита и гепатита С. Обследованные пациенты находились на стационарном лечении и диспансерном учете в инфекционном отделении госпитальных клиник ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (главный врач – Заслуженный врач РФ канд. мед. наук В.М. Шевелев, заведующий отделением – канд. мед. наук, доцент Н.С. Бужак), в терапевтическом отделении медико-санитарной части «Строитель» г. Томска (главный врач – Н.Н. Бартфельд, заведующий отделением – О.В. Буров), гастроэнтерологическом отделении Томской областной клинической больницы (главный врач – Заслуженный врач РФ Б.Т. Серых, заведующий отделением – С.Ю. Стан) и инфекционном отделении городской больницы №3 г. Томска (главный врач – канд. мед. наук М.А. Лукашев, заведующий отделением – Г.В. Западаева). Набор клинического материала осуществлялся при непосредственном участии заведующего кафедрой инфекционных болезней ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук, профессора А.В. Лепехина, заведующего кафедрой терапии ФУВ и ППС ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук, профессора Э.И. Белобородовой и профессора кафедры неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук Н.Г. Жуковой. Клинически и анамнестически у всех обследованных лиц были исключены инфекционные заболевания другой этиологии, обострение хронических воспалительных процессов, аутоиммунные, наследственные и психические болезни, а также злоупотребление алкоголем и прием гепатотоксических лекарств. В зависимости от этиологического фактора и ведущей органной патологии обследованные пациенты были разделены на две группы. Первую группу составили 196 человек, инфицированных вирусом клещевого энцефалита, ко второй – были отнесены 115 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С. Контрольной группой служили 80 здоровых доноров с аналогичными характеристиками по полу и возрасту (54 мужчины и 26 женщин в возрасте от 20 до 42 лет, средний возраст – 29±4 лет). Согласно клинической классификации, предложенной Н.Г. Жуковой и соавт. [2002], все обследованные пациенты с антигенемией вируса клещевого энцефалита были разделены на следующие группы: I группа – 25 пациентов с острой антигенемией вируса клещевого энцефалита (манифестная лихорадочная формы средней степени тяжести); II группа – 89 пациентов с длительным бессимптомным носительством антигена TBEV (более 6 мес после острого периода клещевого энцефалита); III группа – 75 пациентов с длительной антигенемией TBEV, сопровождавшейся остаточными проявлениями клещевого энцефалита (более 6 мес после острого периода клещевого энцефалита); IV группа – 7 больных, страдающих хроническим клещевым энцефалитом (полиомиелитическая форма, рецидивирующее течение). Первую группу обследованных лиц составили пациенты с острой антигенемией вируса клещевого энцефалита. Диагноз клещевого энцефалита (рубрика А84.0 МКБ-10) в острый период заболевания верифицировался на основании данных оценки неврологического статуса, определения уровня специфических антител к антигену вируса клещевого энцефалита в клеще (35%) и крови у пациентов (100%) методами непрямой реакции гемагглютинации и иммуноферментного анализа (ИФА), специфических антител классов IgM (87%) и IgG (74%) к антигену TBEV (ИФА), обнаружения вирусной РНК в крови методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР), а также результатов инструментальных исследований. Лабораторное обследование пациентов с клещевым энцефалитом осуществлялось в диагностическом центре ФГУП Микроген «НПО Вирион» в г.Томске. При этом 12,6% обследованных лиц проходили плановую противоэнцефалитную вакцинацию; 85,7% обратившихся на пункты серопрофилактики было проведено введение специфического иммуноглобулина с целью экстренной серопрофилактики и лечения клещевого энцефалита. Инкубационный период оказался весьма вариабельным (от нескольких часов до 60 дней и более) и продолжался в среднем 10,2±0,9 сут. Клиническая картина обследованных пациентов с острой антигенемией TBEV характеризовалась гипертермией различной степени тяжести от 37,2 до 39,6º С (длительность – от 3 до 7 дней). Заболевшие предъявляли жалобы на головную боль, общую слабость, тошноту, мышечные и суставные боли разной локализации, сонливость. У больных отмечались явления менингизма без воспалительных изменений цереброспинальной жидкости, но со значительным повышением внутричерепного давления. В клинической картине острого периода инфекции обращали на себя внимание нарушения со стороны вегетативной нервной системы в виде дистального гипергидроза, стойкого красного дермографизма и лабильности артериального давления. У пациентов была обнаружена рассеянная неврологическая симптоматика в виде легкого центрального пареза мимических мышц, неравномерности кожных и глубоких рефлексов, непостоянных симптомов орального автоматизма, нарушения конвергенции и болезненности точек выхода тройничного нерва. У лиц, отнесенных ко II группе [пациенты с длительным (более 6 мес после острого периода нейроинфекции) бессимптомным носительством антигена вируса клещевого энцефалита], при наличии в крови вирусной РНК клиническая картина начального периода заболевания практически редуцировалась. Пациенты во время обследования активно жалоб не предъявляли, каких-либо патологических изменений со стороны неврологического и соматического статуса выявлено не было. Следует отметить, что при различных физических и/или эмоциональных нагрузках у незначительного числа обследованных (13,2%) выявлялись клинические признаки астенического синдрома. III группу составили лица с остаточными проявлениями нейроинфекции в виде цереброгенной астении и длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита (более 6 мес после острого периода инфекционного процесса). Основными резидуальными явлениями были симптомы, входящие в рамки стойкого астено-вегетативного синдрома (быстрая утомляемость, раздражительность, нарушение концентрации внимания, снижение инициативы и ухудшение памяти, нарушение аппетита, расстройства сна, головокружение, слабость и эмоциональная лабильность), упорные головные боли, особенно к окончанию рабочего дня и после эмоционального напряжения. В неврологическом статусе выявлялись рассеянные органические микрознаки: слабость конвергенции, легкий центральный парез мимической мускулатуры, анизорефлексия глубоких брюшных рефлексов. Из вегетативных расстройств обращали на себя внимание бледность кожных покровов, гипергидроз дистальных отделов конечностей, повышенная общая потливость. Пациенты с остаточными проявлениями клещевого энцефалита характеризовались наличием тревожности и дистимическими нарушениями, частота встречаемости которых была существенно ниже по сравнению с периодом острой антигенемии, однако значительно выше по сравнению с аналогичным показателем у лиц с длительным бессимптомным носительством антигена TBEV. Клиническая история пациентов IV группы, страдающих хроническим клещевым энцефалитом (полиомиелитическая форма, рецидивирующее течение), продолжалась более 8 мес после стационарного лечения лихорадочной формы острого клещевого энцефалита. Ведущим симптомом данной формы инфекции являлось наличие вялых параличей мышц шеи, плечевого пояса и конечностей (преимущественно верхних). Ретроспективный анализ выявил наряду с длительной антигенемией TBEV появление новой очаговой неврологической симптоматики, характерной для клещевого энцефалита. По срокам развития у всех пациентов диагностировалась прогредиентная форма хронического клещевого энцефалита. У больных регистрировалось нарастание возникших ранее парезов мышц шеи, плечевого пояса, при этом сухожильные и периостальные рефлексы с ног были повышенными. В зоне пораженных мышц выявлялось снижение болевой чувствительности. У 33,3% пациентов обнаруживались амиотрофии, протекающие со снижением или полной утратой рефлексов. В зоне пораженных мышц выявлялось снижение болевой чувствительности чаще по сегментарному типу. У 75,0% лиц была выявлена нейросенсорная тугоухость, 50,0% обследованных страдали вегетативными кризами. В программу обследования были включены 115 пациентов, страдающих вирусным гепатитом С (по МКБ-10 рубрика В18.2 – хронический вирусный гепатит С). Все пациенты представляли группу риска по инфицированию возбудителем гепатита С (в анамнезе были оперативные вмешательства с переливанием крови, лечебные инъекции многоразовыми шприцами, лечение и удаление зубов, эпизоды наркомании, сексуальные контакты с больными вирусными гепатитами, работа с препаратами крови и больными у медицинских работников). Давность заболевания составляла от 1 года до 16 лет (в среднем 5±2 года). Анамнестически у всех пациентов были определены сроки и источник инфицирования, оценивались жалобы, характер течения заболевания и объективные признаки. Проводились общий и биохимический анализ крови, оценка иммунного статуса. В клинике пациенты проходили ультрасонографическое исследование органов брюшной полости для исключения сопутствующей патологии, а также сцинтиграфическое исследование печени, выявившее умеренное диффузно неравномерное накопление радиофармпрепарата в паренхиме органа, характерное для воспалительного процесса. Диагноз хронического вирусного гепатита основывался на наличии клинико-инструментальных симптомов (гепато-, спленомегалия), клинико-лабораторных синдромов (холестаза, цитолиза, мезенхимально-воспалительного). Этиологическая верификация диагноза проводилась путем выявления в крови РНК вируса гепатита С (HCV) (метод ПЦР), серологических маркеров HCV (анти-HCV Ig к cor, С-протеину, неструктурным белкам NS-3, NS-4, NS-5, анти-HCV IgM) (метод ИФА). С целью морфологического подтверждения диагноза и определения степени активности воспалительного процесса с использованием гистологического индекса активности по A. Knodell [1981] и стадии фиброза по U. Desmet [1995] всем пациентам проводилась пункционная биопсия печени по Mengini. По данным морфологического анализа полученного биопсийного материала, различали минимальную (1-3 балла), слабовыраженную (4-8 баллов), умеренную (9-13 баллов) и выраженную степени активности воспалительного процесса (более 13 баллов). В соответствии с классификацией, принятой Всемирным конгрессом гастроэнтерологов в Лос-Анжелесе (1994) [Ивашкин В.Т., 1995], были выделены следующие группы. По степени активности воспалительного процесса: I группа – больные хроническим гепатитом С умеренной степени активности воспалительного процесса в печени; II группа – больные хроническим гепатитом С слабовыраженной степени активности. По стадии фиброза печени: I группа – больные хроническим гепатитом С, стадия фиброза 1; II группа – больные хроническим гепатитом С, стадия фиброза 2. Анализ клинической картины у больных хроническим вирусным гепатитом умеренной степени активности показал, что наиболее часто выявлялся астено-вегетативный синдром (87,8%). Диспептический синдром (непереносимость жирной пищи, тошнота, горечь во рту, изжога, метеоризм) встречался у 65,9% пациентов. Синдром холестаза (желтушное окрашивание кожи и склер, зуд, билирубинемия) обнаруживался у больных хроническим гепатитом С в 45,2% случаев. В большинстве случаев гепато- и спленомегалия, выявленные физикально, подтверждались результатами ультразвукового исследования. При анализе биохимических показателей крови ведущим синдромом был цитолиз. У больных хроническим гепатитом С повышение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) отмечалось в 77,4% случаев. Мезенхимально-воспалительный синдром (увеличение значений СОЭ, тимоловой пробы, повышение уровня γ-глобулинов) по частоте встречаемости среди обследованных данной категории находился на втором месте. Пациенты с хроническим гепатитом С слабовыраженной степени активности характеризовались отсутствием клинической симптоматики поражения печени, нормальными значениями биохимических показателей. Из серологических маркеров HCV-инфекции у них выявлялся анти-HCV IgG. Эпизодически они получали курсы общеукрепляющей терапии. Трудовая деятельность не страдала. Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром до приема пищи (кровь стабилизировали гепарином - 25 Ед/мл). У пациентов с длительной персистенцией вирусов клещевого энцефалита, гепатита С, а также у здоровых доноров проводили комплексное сравнительное исследование иммунофенотипического статуса лимфоцитов, выявление особенностей продукции мононуклеарными лейкоцитами крови иммунорегуляторных цитокинов, анализ спонтанной и индуцированной in vitro рецепции цитокинов лимфоцитами, а также анализ полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов (табл. 1). Определение общего количества лейкоцитов крови и подсчет их отдельных морфологических форм проводили стандартными гематологическими методами [Меньшиков В.В., 1987]. Иммунофенотипирование лимфоцитов крови по CD-маркерам (CD3+, CD4+, CD8+, CD22+) проводили иммуноцитохимическим методом [Тотолян А.Н. и соавт., 2002]. Результаты выражали в относительных и абсолютных значениях. Мононуклеарные лейкоциты выделяли в стерильных условиях из цельной крови методом градиентного центрифугирования с использованием Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (ρ=1,077 г/см3) [Натвиг Дж. и соавт., 1980]. Выделенные клетки культивировали в течение 18 ч при температуре 37º и 5% СО2 в полной культуральной среде (90% RPMI-1640 (“Вектор-Бест”, Новосибирск), 10% инактивированная эмбриональная телячья сыворотка (“Биолот”, Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L-глутамина) без митогена или с добавлением 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) (“Difco”, Германия) для активации лимфоцитов [Хаитов Р.М. и соавт., 1995]. Затем проводили оценку содержания цитокинов (IL2, IL4, IL10, IL12, TNFα, IFNγ) и растворимого рецептора к TNFα в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов методом иммуноферментного анализа согласно инс- трукциям, предлагаемым производителями тест-систем («Procon», Россия; «Biosource», Бельгия, «Cytimmun», США). Учет результатов проводили с применением фотометра для микропланшетов «Multiscan EX» («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны 450 нм. Оценку презентации мембраносвязанных форм рецепторов к IL2, IL4, IL10, TNFα и IFNγ на лимфоцитах крови проводили методом проточной лазерной двухцветной цитометрии с использованием моноклональных антител к цитокиновым рецепторам, меченных флуоресцентными метками. Регистрацию презентации цитокиновых рецепторов на лимфоцитах проводили согласно протоколу фирмы производителя («R&D Systems», США). Анализ образцов клеточных суспензий осуществляли на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) с применением автоматического программного обеспечения и методов сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала) (рис. 1). Рис. 1. Распределение лимфоцитов по интенсивности флуоресценции в FL1-канале (оценка содержания TNFR1+-клеток, меченных FITC, в гейте лимфоцитарных клеток). а – принцип автоматического выделения гейта лимфоцитов по показателям малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеивания; б – одномерная гистограмма интенсивности флуоресценции в гейте лимфоцитарных клеток по FL1-каналу (слева от оси – несветящиеся клетки, справа – FITC-положительные лимфоциты) ДНК выделяли по инструкции, предлагаемой производителем тест-системы (“Лаборатория МЕДИГЕН”, Россия). Метод выделения основан на специфической обратимой сорбции ДНК в присутствии хаотропной соли (гуанидинизотиоцианат) на частицы силикагеля [Boom R. et al., 1991]. Генотипирование аллельных вариантов генов цитокинов и их рецепторов (G-308A TNFA, T-330G IL2, C-590T IL4, Ile50Val IL4R, Q-576R IL4R и C-592A IL10) осуществляли методом рестрикционного анализа продуктов амплификации (ПДРФ-анализ) специфических участков генома. Амплификацию осуществляли в пробирках типа «Эппендорф» путем полимеразной цепной реакции, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл. 2), и учитывая применение нами амплификатора «Tercik MC2» («ДНК- технология», Россия). Оценку полученных результатов проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез. При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Шапиро-Вилка). Для нормально распределенных выборок вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое (Х), среднее квадратичное отклонение (σ), ошибка среднего (m). Для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану (Ме), первый и третий квартили (Q1, Q3). С целью попарного сравнения показателей в исследованных группах применяли критерий Манна-Уитни для независимых групп. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05. С целью обнаружения связи между исследованными показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r) [Гланц С., 1999; Боровиков В.П., 2001]. Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам прове- Таблица 2 Характеристика исследованных полиморфизмов генов цитокинов
ряли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий χ2 Пирсона и точный тест Фишера. Обработку результатов генетических исследований осуществляли с использованием критерия отношения шансов OR с расчетом для него 95% доверительного интервала (CI) [Флейс Дж., 1989]. |
Программа вступительного экзамена «Клеточная биология, цитология, гистология» Экзамен проходит по традиционной форме, в соответствии с содержанием курса гистологии и клеточной биологии | Структурно-функциональная организация хромосом описторхид 03. 03.... ... | ||
Программа вступительного экзамена по специальности «Клеточная биология, цитология, гистология» Программа вступительных испытаний при приеме на обучение по программам подготовки научно-педагогических кадров в аспирантуре сформирована... | Рабочая программа дисциплины опубликована на сайте ТюмГУ: Цитология... «Биология», профили ботаника, зоология, физиология, генетика, биоэкология; форма обучения – очная | ||
Учебной дисциплины «гистология, эмбриология, цитология» Специальность... Дисциплина «Гистология, эмбриология, цитология», относится к циклу математических, естественнонаучных дисциплин. Основные знания,... | Рабочая программа учебной дисциплины Гистология, эмбриология, цитология-гистология... Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования | ||
Патологическая физиология Как медико-биологическая дисциплина «Патологическая физиология» требует системных естественно-научных знаний, на основе среднего... | Патологическая физиология Как медико-биологическая дисциплина «Патологическая физиология» требует системных естественно-научных знаний, на основе среднего... | ||
Рабочая программа учебной дисциплины единство и разнообразие клеточных... Изучение данной дисциплины базируется на знании дисциплин профессионального блока «Ботаника», «Методы биологического эксперимента»,... | Рабочая программа дисциплины «патологическая физиология» Минобрнауки РФ от 16. 03. 2011 г. №1365; паспорта специальности научных работников 14. 03. 03. «патологическая физиология», учебного... | ||
Методические указания для самостоятельной работы по дисциплине «патологическая физиология» Цель методических указаний – повышение теоретической подготовки студентов по дисциплине «Патологическая физиология» за счет активизации... | Осложнения беременности при острых респираторных вирусных инфекциях... О душе. Но все, чтобы ни представлялось необходимым исследовать, мы будем обсуждать, насколько способны, с помощью ума и доказательства,... | ||
Учебно-методический комплекс дисциплины сд. Дс. Ф. 4 Гистология сд... ... | Рабочая программа составлена в соответствии с требованиями фгос во... Изучение данной дисциплины базируется на знании дисциплин профессионального блока «Ботаника», «Методы биологического эксперимента»,... | ||
Гистология, эмбриология, цитология гистология полости рта Дать знания по цитологии, эмбриологии, общей и частной гистологии и умения их практического использования, необходимые для успешного... | Медико-экономическая оценка моделей лечения хронических вирусных... Медико-экономическая оценка моделей лечения хронических вирусных гепатитов (на примере Самарской области)1 |